JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Abstract

السيطرة على التعبير أو نشاط جينات معينة من خلال تقديم عضلة القلب من المواد الجينية في نماذج الفئران يسمح التحقيق في وظائف الجينات. الإمكانات العلاجية في قلب كما يمكن تحديدها. هناك أساليب محدودة في الجسم الحي تدخل الجزيئي في قلب فأر. وقد استخدمت المؤتلف فيروس الغدة المرتبطة (rAAV) هندسة الجينوم المستندة كأداة أساسية في الجسم الحي التلاعب الجيني القلب. وتشمل المزايا المحددة لهذه التكنولوجيا عالية الكفاءة، والدقة العالية، وانخفاض معدل التكامل الجيني، الحد الأدنى المناعية، والحد الأدنى المرضية. هنا، يتم وصف إجراءات تفصيلية لبناء، حزمة، وتنقية ناقلات rAAV9. حقن تحت الجلد rAAV9 إلى الجراء حديثي الولادة النتائج في التعبير القوي أو ضربة قاضية كفاءة من هذا الجين (ق) من الفائدة في قلب فأر، ولكن ليس في الكبد والأنسجة الأخرى. باستخدام القلب-specifiتم الحصول ج TnnT2 المروج والتعبير عالية من الجين GFP في القلب. بالإضافة إلى ذلك، استهداف وتثبيط مرنا في القلب عندما كان يستخدم لrAAV9-U6-shRNA. العمل معرفة التكنولوجيا rAAV9 قد يكون من المفيد إجراء تحقيقات القلب والأوعية الدموية.

Introduction

أصبحت السيطرة على التعبير أو نشاط جينات معينة في الأنظمة البيولوجية المختلفة استراتيجية قيمة في دراسة وظيفة الجين 1. وسيلة مباشرة لتحقيق هذا الهدف هو التلاعب تسلسل النوكليوتيدات وتوليد أليل متحولة. وعلى الرغم من اتخاذ دقيقة، والتغيرات التي تستهدف جينوم الخلايا الحية لا تزال ووممارسة كثيفة العمالة تستغرق وقتا طويلا، وقد فتحت تنمية قوية TALEN وكريسبر / Cas9 أدوات حقبة جديدة من تحرير الجينوم 2-5. وقد ركزت طريقة المخبرية الروتينية أكثر للتلاعب الجيني على إدخال المواد الجينية (السلطات الوطنية المعينة والرنا التي تحتوي على الترميز متواليات أو الرناوات siRNAs / shRNAs) إلى خلايا للتعبير أو ضربة قاضية الجين (ق) من الفائدة 1،6.

في كثير من الحالات، وعقبة رئيسية للتلاعب الجيني هو تسليم DNA، RNA، أو البروتين في الخلايا. وفيما يتعلق الدراسات في المختبر، transfecti كفاءةعلى أنظمة أنشئت في كثير من خطوط الخلايا المستزرعة. ومع ذلك، في نموذج الفأر على وجه الخصوص، في الجسم الحي توصيل الجينات هو أكثر تحديا. وهناك سلسلة من الحواجز من خارج وداخل الخلايا التي تحتاج إلى تجاوزها من أجل تحقيق امتصاص الخلوية كفاءة من الكواشف الخارجية. وتشمل عقبات إضافية لإزالة السريع وقصر مدة المواد 7،8 تسليمها. استراتيجية واحدة للتحايل على هذه القضايا هي استخدام ناقلات فيروسية باسم "ناقلات" أو "المركبات" في الجسم الحي توصيل الجينات. خصائص التنبيغ تطورت بشكل طبيعي من الفيروسات تسمح التنفيذ الفعال لجينة من الفائدة إلى خلايا 7،9،10. وقد تم تطوير أنواع عديدة من النواقل الفيروسية وتمكين مرونة في التلاعب الجيني المجراة في أنواع مختلفة من الخلايا والأعضاء في الفئران.

وتشمل أنظمة الفيروسية الأكثر شيوعا-الارتجاعي، الفيروسة البطيئة، اتش، والغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) 11. الفيروسات هي الفيروسات RNA واحدة الذين تقطعت بهم السبل ويمكن إدخال المواد الجينية لجينوم الخلية المضيفة بطريقة مستقرة خلال تقسيم الإنقسامية، وتوفير إمكانات للتعبير مدى الحياة من الجينات transduced في الخلايا المستهدفة وأجهزة 12-14. ومع ذلك، وأنواع عديدة من الفيروسات تصيب فقط تقسيم الخلايا، ومدى فعاليتها في الخلايا غير تقسيم هو منخفض جدا 15. هذا يحد من فائدتها لتوصيل الجينات. الفيروسة البطيئة هو جنس من عائلة Retroviridae. مختلفة من الفيروسات الأخرى، ويمكن الفيروسة البطيئة تصيب كلا تقسيم الخلايا وعدم تقسيم واستخدمت على نطاق واسع لنقل الجين إلى ما بعد الإنقسامية وخلايا متباينة للغاية-16. دورة حياة الفيروسة البطيئة ينطوي أيضا على دمج الحمض النووي ناقلات في الجينوم المضيف. توصيل الجينات وبالتالي، الفيروسة البطيئة بوساطة تمكن مستقرة وطويلة الأجل التعبير عن العناصر الوراثية transduced 16-18. ومع ذلك، قد تمثل هذه الميزة الإلكترونية مزدوجالسيف جهاز 'في استخدام هذه الفيروسات لمعالجة التعبير الجيني، والتكامل من الحمض النووي ناقلات قد يؤدي إلى الطفرات إقحامي في الخلايا المضيفة ويمكن أن يسبب آثار مصطنع. اتش هو آخر يستخدم على نطاق واسع نظام توصيل الجينات. على عكس الفيروسات القهقرية وlentiviruses، الغدية هي غير متكامل ولا تتعارض مع سلامة الجينوم من الخلايا المضيفة 8،10،11،19. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الغدية transfect الحمض النووي في العديد من أنواع الخلايا، والإصابة ليست متوقفة على انقسام الخلايا النشطة 19. وهناك سمة أخرى مهمة من الغدية هو سهولة تنقية ناقلات، نظرا إلى أن ناقلات فيروسية القدرة على أن تتكرر 19،20. ومع ذلك، فإن التحذير الرئيسي لهذا النظام هو أن عدوى اتش يمكن أن تؤدي إلى استجابات مناعية قوية في الخلايا المستهدفة والأجهزة 19، وتقييد استخدامه في العديد من التحقيقات، لا سيما في الدراسات العلاج الجيني.

مقارنة مع هذه نوع مختلفالصورة من النواقل الفيروسية، والفيروسات المرتبطة الغدة-المؤتلف (rAAV) ويبدو أن نظام توصيل الجينات المثالي 21،22. فإنه يسلك الحد الأدنى المناعية والمرضية 23،24. وبالإضافة إلى ذلك، rAAV يصيب مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الفاصل والخلايا غير الانقسام. في معظم الحالات، لا rAAV ليس الاندماج في الجينوم المضيف؛ وبالتالي، فإن مخاطر التغيرات الوراثية أو الجينوم غير مرغوب فيها في الخلايا المستهدفة منخفض 22.

في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت أنظمة rAAV بنجاح لفي الجسم الحي تسليم البروتينات ترميز الحمض النووي، miRNAs، shRNAs، وكريسبر-gRNAs في الماوس عضلة القلب 23،25-29. وقد سهلت هذه المنهجية التحقيقات الأساسية والدراسات العلاج الجيني في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية. هنا، وإجراءات مفصلة لتوليد ناقلات rAAV9 أن بإفراط بكفاءة أو ضربة قاضية لجينات الفائدة في قلوب الماوس وصفه. وينص البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لالتلاعب التعبير الجيني القلب في الفئران نماذج تجريبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ جميع الخطوات المذكورة تحت البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة السلامة الأحيائية واللجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من مستشفى الأطفال في بوسطن. مستشفى بوسطن للأطفال ومرافق الماوس خالية من مسببات الأمراض مع ضوء / دورات الظلام التنظيم والتحكم في المناخ. البيطرية ورعاية الحيوان تغيير الموظفين الأقفاص وضمان صحة الفئران. المرافق AAALAC معتمدة ولها النشطة شهادة الحيوانية ضمان الرفاهية (AAALAC الاعتماد الممنوحة في 1992/02/24 الحيوان ضمان الرعاية الاجتماعية رقم: A3303-01). الموت الرحيم كانت الفئران عن طريق CO 2 تسليمها من مصدر الغاز المضغوط. تم جمع عينات الأنسجة بعد التأكد من معدل ضربات القلب والحركة والتنفس من الحيوانات قد توقفت. القوارض الوليدية هي مقاومة للثاني 2 القتل الرحيم ووالموت الرحيم بواسطة قطع الرأس باستخدام مقص حاد. هذه الأساليب تتفق مع توصيات الفريق بشأن القتل الرحيم للالطبية البيطرية الأمريكيةجمعية لتر.

1. توليد rAAV9 التركيبات التي كتبها استنساخ [كدنا] أو shRNA التعبير كاسيت في العمود الفقري البلازميد

ملاحظة: البلازميد rAAV9، التي تحتوي على يكرر محطة مقلوب (وائح الاتصالات الدولية) من AAV2، وتستخدم ل overexpression الجين تم تعديلها لإيواء TNNT2 الدجاج المروج (rAAV9.cTNT)، والتي تمكن التعبير عن cardiomyocyte معين من الجينات transduced 25،26،29. وقد أدخلت مواقع فريدة من نوعها NheI وKpnI إلى البلازميد، المصب من المروج. شظايا [كدنا ترميز الجينات التي تهم يمكن استنساخ في العمود الفقري rAAV9 استخدام هذه المواقع تقييد اثنين 25،26،29. هنا، على سبيل المثال، تم إنشاء ناقلات rAAV9 لoverexpression من هذا الجين GFP في قلوب الماوس. يحتوي البلازميد ينتج عن ذلك من cTNT :: الكاسيت GFP يحيط بها اثنان بالميدان المواقع (الشكل 1). استخدمت بنيات rAAV9.U6 :: shRNA عن الجينات ضربة قاضية 25. تصميم shRNAs باستخدامعلى الانترنت خدمة تصميم shRNA. rAAV9.U6 :: shRNA يمكن أن تتولد إما عن طريق الصلب وligating oligos التي تحتوي على الحمض النووي تسلسل shRNA في تقييد ناقلات rAAV9 هضم انزيم إيواء المروج U6، أو عن طريق طويلة المدى PCR وداخل الجزيئية أساس التجميع جيبسون "سلس" بناء 30. يجب أن يحتوي على البلازميد الناتج الكاسيت U6-shRNA يحيط بها اثنان بالميدان المواقع (الشكل 2). هنا، على سبيل المثال، تم بناء ناقلات rAAV9.U6 :: shRNA ضربة قاضية Trbp مرنا (Trbp shRNA تسلسل: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG). تم استخدام التدافع shRNA بمثابة السيطرة السلبية (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG).

  1. استنساخ [كدنا أو shRNA التعبير كاسيت في البلازميد العمود الفقري rAAV9. تحويل الحمض النووي في الخلايا المختصة كولاي 25.
    ملاحظة: استخدام stbl2 أو stbl3 الخلايا كولاي للتحول rAAV9 الحمض النووي للحد غير مرغوب فيها إعادة التركيب بالميدان.
  2. التقطاستنساخ إيجابية من الخلايا كولاي تحويلها. تضخيم ثقافة في 500 مل من ليلي-بارنيت المتوسطة واستخراج البلازميد rAAV9 من الخلايا البكتيرية 25-30.
    ملاحظة: ميدي / ماكسي الإعدادية البلازميد rAAV9 للحصول على كمية عالية من الحمض النووي (> 100 ميكروغرام). قبل إنشاء فيروس، دائما تحليل سلامة تسلسل البلازميدات AAV عن طريق الهضم تقييد والاغاروز الكهربائي للهلام، كما هو موضح سابقا (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html).

2. ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 مع rAAV9 البلازميدات

  1. إعداد 1 ميكروغرام / ميكرولتر من الخطية polyethylenimine (PEI) حل. حل مسحوق جزيرة الأمير إدوارد في DH خالية من الذيفان الداخلي 2 O الذي تم تسخينه إلى 70-80 درجة مئوية. Aftercooling وصولا الى RT، تحييد الحل لدرجة الحموضة 7.0 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك. تعقيم فلتر (0.22 ميكرون) الحل. قسامة / ميكرولتر جزيرة الأمير إدوارد حل الأوراق المالية 1 ميكروغرام (1400 ميكرولتر / أنبوب) وتخزين solutأيون في -20 درجة مئوية.
  2. خلايا HEK293 الثقافة في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. ثقافة الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون 5 ± 0.5٪ (CO 2).
  3. في اليوم 0، لوحة خلايا HEK293 في عشرة أطباق 150 ملم 18-20 ساعة قبل ترنسفكأيشن من خلال تقسيم> خلايا متكدسة 90٪ في التخفيف 1: 2.
    ملاحظة: في يوم 1، يجب أن الخلايا تصل إلى 90٪ التقاء.
  4. في يوم 1، transfect خلايا HEK293 مع البلازميد rAAV9 (على سبيل المثال، rAAV9.cTNT :: GFP أو rAAV6.U6 :: shRNA يبني)، الإعلان، ومساعد البلازميد، والبلازميد AAV-النائب / كاب باستخدام جزيرة الأمير إدوارد 25،26،29.
    1. لمدة 10 أطباق من الخلايا في 90٪ التقاء، خلط 70 ميكروغرام من AAV-النائب / كاب البلازميد، 70 ميكروغرام الجبهة الوطنية rAAV9 البلازميد، و 200 ميكروغرام من الإعلان، ومساعد البلازميد في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    2. إذا كانت الخلايا أقل متموجة، وضبط كمية الحمض النووي نسبيا. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا في 75٪ متموجة، والحد منكمية الحمض النووي نسبيا (75/90 من المبلغ الموضح في الخطوة 2.4.1): خلط 70 × 75/90 = 58.3 ميكروغرام من AAV-النائب / كاب البلازميد، 70 × 75/90 = 58.3 ميكروغرام من rAAV9 البلازميد، و 200 س 75/90 = 166.7 ميكروغرام من الإعلان، ومساعد البلازميد في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    3. إضافة 49 مل من RT DMEM (بدون FBS) في أنبوب 50 مل وتخلط جيدا.
    4. إضافة 1360 ميكرولتر من حل جزيرة الأمير إدوارد لجعل جزيرة الأمير إدوارد: نسبة الحمض النووي (ت / ث) تكون 4: 1. اخلط جيدا. في احتضان RT ل15-30 دقيقة.
    5. إضافة 5 مل من الخليط المعد في الخطوة 2.4.4 إلى كل طبق 150 ملم (50 مل من الخليط لمدة عشرة أطباق 150 ملم).
  5. ثقافة الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5 ± 0.5٪ CO 2 ل60-72 ساعة.

3. حصاد Transfected HEK293 الخلايا وتنقية rAAV9 المتجهات

  1. حصاد الخلايا 60-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. طرد ووقف الخلايا في أطباق من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع مستنبت. نقل عن تعليق خلية لعقيمةأنابيب 50 مل.
  2. الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق. Resuspend وبيليه الخلية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني في كل أنبوب والجمع بين كل تعليق الخلية في أنبوب واحد 50 مل.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف. في هذه الخطوة، وتخزين بيليه خلية في -80 درجة مئوية أو مباشرة تنقية AAV من بيليه، كما هو موضح في الخطوات 3،4-3،15.
  4. إعداد العازلة تحلل: 150 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0. تعقيم فلتر (0.22 ميكرون). تخزين المخزن المؤقت في 4 درجات مئوية.
  5. Resuspend وبيليه مع 10 مل من تحلل العازلة.
  6. تجميد المحللة في -80 درجة مئوية أو في حمام الثلج / الايثانول الجاف، ثم ذوبان أنه عند 37 درجة مئوية. دوامة لمدة 1 دقيقة. تجميد وذوبان الجليد في المحللة 3 مرات.
  7. إضافة MgCl 2 حل لالمحللة إذابة (جعل تركيز النهائي من MgCl 2 في المحللة يكون 1 ملم). إضافة نوكلياز إلى التركيز النهائي من 250 U / مل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى حل DNA / البروتين aggregation.
    ملاحظة: إذا كان تجميع الحمض النووي / البروتين لا يحصل المنحل بعد نوكلياز أو نوكلياز داخلية العلاج، dounce التجانس لست] 20 مرة.
  8. الطرد المركزي العينة في 4800 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف.
  9. وفي الوقت نفسه، وإعداد حل Iodixanol التدرج:
    1. إعداد 17٪ من الحل التدرج عن طريق خلط 5 مل من 10X برنامج تلفزيوني، 0.05 مل من 1 M MgCl 2، 0.125 مل من 1 M بوكل، 10 مل من 5 M كلوريد الصوديوم، و 12.5 مل ofdensity المتوسطة الانحدار. ضبط الحجم الإجمالي إلى 50 مل باستخدام H 2 O.
    2. إعداد حل 25٪ عن طريق خلط 5 مل من 10X برنامج تلفزيوني، 0.05 مل من 1 M MgCl 2، 0.125 مل من 1 M بوكل، 20 مل من كثافة متوسطة الانحدار، و 0.2 مل من 0.5٪ (ث / ت) الفينول الأحمر. ضبط الحجم الإجمالي إلى 50 مل باستخدام H 2 O.
    3. إعداد حل 40٪ عن طريق خلط 5 مل من 10X برنامج تلفزيوني، 0.05 مل من 1 M MgCl 2، 0.125 مل من 1 M بوكل، و 33.3 مل من التدرج الكثافة المتوسطة. ضبط الحجم الإجمالي إلى 50 مل باستخدامH 2 O.
    4. إعداد حل 60٪ عن طريق خلط 0.05 مل من 1 M MgCl 2، 0.125 مل من 1 M بوكل، 50 مل من كثافة متوسطة الانحدار، و 0.1 مل من 0.5٪ (ث / ت) الفينول الأحمر.
  10. مع الإبر والمحاقن، تحميل حل التدرج Iodixanol في أنبوب البولي بروبلين في حدود 5 مل من 17٪، 5 مل من 25٪، 5 مل من 40٪ و 5 مل من 60٪، بدءا من القاع. تحميل جميع المحللة التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.8 (14-16 مل) على رأس التدرج. التدرج، المدرجة من أسفل إلى أعلى، 60٪، 40٪، 25٪، 17٪، وطبقة المحللة. ملء الأنبوب مع تحلل العازلة وتغطية ذلك مع الفلين.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 185000 x ج لمدة 90 دقيقة في 16 درجة مئوية.
  12. حصاد جزء الفيروسي (40٪ طبقة) مع حقنة. ادخال الإبرة (21 مقياس) في تقاطع ما بين 40٪ و 60٪ كسور، فقط الشفط طبقة 40٪.
    ملاحظة: تجنب الشفط أي طبقة 25٪.
  13. خلط جزء الفيروسي مع تعقيمها البولي أوكسي إتيلين-polyoxyproحل كتلة pylene البوليمرات برنامج تلفزيوني (10٪ البولي أوكسي إتيلين-polyoxypropylene كتلة كوبوليمر الأوراق المالية 1: 10،000 المخفف في برنامج تلفزيوني) تصل إلى الحجم الكلي لل15 مل. تحميل الخليط في أنبوب فلتر (قطع ميغاواط = 100 دينار كويتي). أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  14. تجاهل الحل في القاع. إعادة ملء الأنبوب فلتر مع كتلة البولي أوكسي إتيلين-polyoxypropylene البوليمرات حل PBS إلى إجمالي حجم 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. جمع الفيروس rAAV9 تنقيته (الكسر فوق فلتر).
  15. نقل rAAV9 تنقيته في الأنبوب فلتر لأنابيب 1.7 مل. قسامة rAAV9 تنقيته (100-400 ميكرولتر / أنبوب، وهذا يتوقف على حجم وعيار من AAV) وتخزين الفيروس في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب تكرار تجميد يذوب.

4. قياس عيار من rAAV9

  1. إعداد عينات من الحمض النووي القياسية.
    1. تصميم PCR محددة وفعالةالاشعال لناقلات rAAV9 وتحسين حالة PCR.
      ملاحظة: الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة هي "إلى الأمام: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG. عكسي: TCGGACGGAGATACGTGAGT". تم إجراء تفاعل PCR مع الشروط التالية: تغيير طبيعة الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 10 ثانية؛ والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ومع ذلك، الاشعال الأمثل وشروط الاسترداد هي البلازميد محددة، كما تتابع أقحم في ناقلات rAAV9 قد تؤثر على خصوصية وكفاءة PCR 31.
    2. نفذ تفاعل PCR للشروط الموضحة في الخطوة 4.1.1. تنقية المنتج PCR مع مجموعة استخراج الهلام.
    3. قياس تركيز الحمض النووي تنقيته باستخدام مقياس الطيف الضوئي. حساب تركيز بأعداد الجزيئية الحمض النووي على أساس الوزن الجزيئي / طول المنتج PCR.
      1. حساب تركيز الجزيئي باستخدام المعادلة التالية: موتركيز الجزيئية (جزيئات الحمض النووي أو شظايا / مل) = 6.23 × 10 23 مول -1 س كون. × 10 -6 / MW. ملاحظة: (6.23 × 10 23 مول -1 هو عدد Avagadro؛ وتركيز كون: الحمض النووي في ميكروغرام / مل. ميغاواط: الوزن الجزيئي في غرام / مول). على سبيل المثال، إذا كان تركيز الحصول عليها من المنتج PCR هو 100 ميكروغرام / مل وطوله 200 سنة مضت، والوزن الجزيئي من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل هو 2 × 200 × 310 = 124،000 (متوسط ​​الوزن الجزيئي للكل النوكليوتيدات في الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل حوالي 310 جم / مول). التركيز الجزيئي (جزيئات الحمض النووي / مل) = 6.23 X 10 23 مول -1 × 100 ميكروغرام / مل × 10 -6 / 124000 جم / مول = 5.18 × 10 14 DNA الجزيئات / مل.
      2. تنفيذ سلسلة تخفيف جزء الحمض النووي، وإعداد العينات القياسية، مع تركيز 10 13 جزيئات / مل و 10 و 12 جزيئات / مل، 10 11 جزيئات / مل، 10 10 جزيئات / مل، 10 9 جزيئات / مل، 10 8 جزيئات / مل، و 10 7 جزيئات / مل. استخدام 1 ميكرولتر من حل لكل عينة القياسية لالكمي PCR (QPCR، في خطوة 4.6).
  2. مزيج 5 ميكرولتر من حل rAAV9 النقي مع 5 ميكرولتر من 10X العازلة الدناز، 1 ميكرولتر من الدناز (10،000 U / مل)، و 39 ميكرولتر من ده 2 O. يجب أن يكون الحجم الكلي 50 ميكرولتر.
  3. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة المتبقي غير المعبأة DNA البلازميد.
  4. إبطال نشاط الدناز في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تهدئة الحل، إضافة 44 ميكرولتر من H 2 O و 5 ميكرولتر من 10X العازلة الدناز، و 1 ميكرولتر من الأسهم بروتين كاف (10 ملغ / مل).
  5. احتضان الحل عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وقف رد فعل وإبطال نشاط بروتين كاف في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  6. استخدام 1 ميكرولتر من العينة للفحص PCR الكمي (QPCR). حساب عيار.
    1. تشغيل الكمي PCR (QPCR) مع الاشعال مصممة في الخطوة 4.1.1 باستخدام عينات الابام خطوة 4.1.4 (عينات قياسية) ومن الخطوة 4.5 (العينات المراد قياسها).
      1. لكل رد فعل، مزيج 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي الأخضر 2X (التي تحتوي على طق البلمرة، مزيج dNTP، العازلة، MgCl 2، وصبغ الأخضر)، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي إلى الأمام (5 ميكرومتر)، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (5 ميكرومتر)، 8 ميكرولتر من H 2 O، و 1 ميكرولتر من العينة المراد قياسها. أداء QPCR فقا للشروط التالية: عقد العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. أداء 40 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، وعند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. للمرحلة الذوبان، واحتضان العينات في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. توليد المنحنى القياسي استنادا إلى أرقام C T من العينات القياسية (الشكل 3).
    2. حساب تركيز الجزيئي / عيار العينة AAV ضد المنحنى القياسي. وrAAV9 لديها جينوم الحمض النووي واحد حبلا، وبالتالي فإن التركيز الجزيئي تكون 2 أضعاف أعلى منالقيمة المحسوبة (السلطة 2X (10، ص)، الشكل 3B). وبالإضافة إلى ذلك، فإن عيار من rAAV9 تنقيته يكون 20 أضعاف أعلى مما تم الحصول عليها من الحساب بسبب التخفيف 1:20 من الفيروس في ردود فعل الدناز وبروتين كاف (5 ميكرولتر في 100 مجموع ميكرولتر).

5. حقن rAAV9 في الفئران حديثي الولادة وفحوصات التعبير الجيني في القلب

  1. إعداد حلول العمل rAAV9 في البولي أوكسي إتيلين-polyoxypropylene كوبوليمر كتلة الحل برنامج تلفزيوني. جعل الأسهم فيروس مع التتر من 1-7 × 10 12 الجسيمات / مل.
    ملاحظة: تسليم 50-70 ميكرولتر من محلول rAAV9 في كل ما بعد الولادة اليوم 0،5-1،5 الماوس عن طريق الحقن تحت الجلد. لتحقيق overexpression الجينات كفاءة أو ضربة قاضية، فمن المستحسن لإجراء اختبار تجريبي لكل دراسة لتحسين كمية AAV حقن. استخدام نفس الكمية من rAAV9.cTNT :: لوك أو ضوابط rAAV9.U6 :: التدافع للحصول على كل دراسة للحد من التحيز.
    ملاحظة: استخدمنا 1-1.5× 10 11 الجسيمات / الجرو ل overexpression و2،5-5 × 10 11 الجسيمات / الجرو لضربة قاضية في يوم ما بعد الولادة 0.5-1.5 ميل م).
  2. علاج الفئران حديثي الولادة مع rAAV9 في P0.5-P2.5 عن طريق الحقن تحت الجلد.
    1. قبل ملء 29G1 / 2، 0.33 س 12.7 ملم الأنسولين المحاقن مع الحل rAAV9. كن حذرا لإزالة فقاعات الهواء.
    2. عقد الجرو-تخدير البرد في يد واحدة مع الإبهام والسبابة. قبل الحقن، انتقد الجلد الخلفي للالجرو بعصا مسحة مشبعة 70٪ ايزوبروبيل للحفاظ على حالة معقمة. إدراج إبرة حقنة تحت الجلد في الأمامي الظهري الحيوان في زاوية من 5 إلى 10 درجة. حقن 50-70 ميكرولتر من محلول rAAV9 باستخدام حقنة الأنسولين.
      ملاحظة: rAAV9 يمكن أيضا أن يتم تسليمها إلى الماوس عن طريق داخل الصفاق أو في الوريد حقن 26،27. التعبير كفاءة من الجينات تسليمها في قلب ويمكن الحصول على. ومع ذلك، حقن داخل الصفاقأيون قد يؤدي في بعض الأحيان في التعبير المتسرب في الكبد. بعد الحقن، تم رصد حالة من الجراء كل يوم.
  3. يمكن رصد مستوى التعبير الجيني في القلب مع QPCR، المناعي، أو لطخة غربية (وتظهر نتائج ممثلة في الأرقام 4 و 5) 25،26.
    الموت الرحيم كانت الفئران التي CO 2 تسليمها من مصدر الغاز المضغوط: ملاحظة. تم جمع عينات الأنسجة بعد التأكد من معدل ضربات القلب والحركة والتنفس من الحيوانات قد توقفت. القوارض الوليدية هي مقاومة للثاني 2 القتل الرحيم ووالموت الرحيم بواسطة قطع الرأس باستخدام مقص حاد. هذه الطريقة متسقة مع توصيات الفريق بشأن القتل الرحيم للجمعية الأميركية للطب البيطري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وترد الاستراتيجيات لبناء rAAV9 من rAAV9.cTNT :: GFP أو البلازميدات rAAV9.U6 :: shRNA في أرقام 1 و 2 على التوالي. كما الأمثلة، تم إنشاء ناقلات rAAV9 إلى بإفراط عن الجين GFP في قلوب الماوس. يحتوي البلازميد ينتج عن ذلك من cTNT :: الكاسيت GFP يحيط بها اثنان بالميد?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ومن المهم للحد غير مرغوب فيها إعادة التركيب بالميدان خلال بناء البلازميد. قبل إنشاء الفيروس، يجب على المرء دائما مراقبة سلامة بالميدان من البلازميدات AAV باستخدام الهضم تقييد والاغاروز الكهربائي للهلام. فمن المستحيل الحصول على 100٪ البلازميدات سليمة، ولكن نسبة إعادة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)Polysciences, Inc. #23966-2
Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)Beckman Coulter, Inc# 362183
Nuclease, ultrapureSIGMA#E8263-25KU
Density Gradient Medium(Iodixanol)SIGMA#D1556-250ML
Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membraneEMD Millipore Corporation#UFC910008
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hubSIGMA#CAD7942-12EA
Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution)SIGMAP5556-100ML
Proteinase KSIGMA3115828001
DNase IRoche10104159001
Centrifuge machineThermo Scientific75004260
Centrifuge SystemBeckman Coulter363118
UltracentrifugeBeckman Coulter
DMEM mediumFisher ScientificSH30243FS
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals              S11150
rAAV9 vectorPenn Vector CoreP1967

References

  1. Primrose, S. B., Twyman, R. Principles of gene manipulation and genomics. , John Wiley & Sons. (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  4. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  6. Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
  7. Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342(2015).
  8. Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
  9. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  10. Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
  11. Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
  12. De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
  13. Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
  14. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
  15. Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
  16. Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
  17. Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
  18. Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
  19. Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
  20. Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
  21. Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
  22. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  23. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
  24. Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
  25. Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
  26. Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
  27. Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
  28. Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
  29. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
  30. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
  31. Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
  32. Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
  33. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
  34. Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
  35. Piras, B. A., O'Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894(2013).
  36. Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.

One of the authors names and affiliation was corrected from:

Jian-Ming Jiang3,4
3 Department of Genetics, Harvard Medical School
4 Howard Hughes Medical Institute

to:

Jianming Jiang5
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118 cardiomyocyte overexpression

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved