Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Özet

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Özet

sıçan modellerinde genetik materyallerin miyokard teslim yoluyla ifade ya da belirli genlerin aktivitesini kontrol eden gen fonksiyonlarının soruşturma izin verir. merkezinde Bunların terapötik potansiyeli de belirlenebilir. Fare kalp in vivo molekül müdahale sınırlı yaklaşımlar bulunmaktadır. Rekombinant adeno-bağlantılı virüsü (AAV) tabanlı genom mühendisliği in vivo kardiyak gen manipülasyonu için gerekli bir araç olarak kullanılmıştır. Bu teknolojinin belirli avantajları minimal yüksek verimlilik, yüksek özgüllük, düşük genomik entegrasyon oranı dahil immünojenisite ve minimal patojenite. Burada, rAAV9 vektörleri, inşa paket ve arındırmak için detaylı bir prosedür açıklanmıştır. Yenidoğan yavruların halinde rAAV9 deri altı enjeksiyonu, karaciğer ve diğer dokularında güçlü bir ifade ya da fare kalbinde ilgili gen (ler) in etkin bir devirme ile sonuçlanır, fakat. Kalp-specifi kullanarakCı TnnT2 promoteri, kalp GFP geninin yüksek elde edildi. Ayrıca, rAAV9-U6-ShRNA kullanılmıştır zaman mRNA kalbinde inhibe edilmiştir hedef. rAAV9 teknoloji bilgisi çalışma kardiyovasküler araştırmalar için de faydalı olabilir.

Giriş

Çeşitli biyolojik sistemlerde, belirli genlerin dışavurumu ya da aktivitesini kontrol gen fonksiyonu ¹ çalışmasında değerli bir strateji haline gelmiştir. Bu amacı gerçekleştirmek doğrudan bir aracı nükleotid dizilerini işlemek ve mutant alelleri üretmektir. canlı hücre genomuna kesin ve hedeflenen bir değişiklik yapmak hala olmasına rağmen Bir zaman alıcı ve emek yoğun bir uygulamadır, güçlü TALEN ve CRISPR / Cas9 araçlarının geliştirilmesi genom düzenleme ^2-5 yeni bir dönem açtı. Gen manipülasyonu için daha rutin laboratuvar yöntemi genetik malzemeler (DNA'lar ve kodlama dizileri veya siRNA'lar / shRNAs içeren RNA'lar) açık veya ilgi ^1,6 gen (ler) demonte hücrelerin içine giriş odaklanmıştır.

Pek çok durumda, gen manipülasyonu için büyük bir darboğaz hücrelerine DNA, RNA ya da protein verilmesidir. In vitro çalışmalarda dikkate alarak, verimli transfecti ilesistemlerde çok kültürlenmiş hücre çizgileri kurulmuştur. Bununla birlikte, özellikle de fare modelinde in vivo gen aktarım daha zordur. Eksojen reaktiflerin etkili biçimde hücreye alınması elde edilmesi amacıyla bypass gereken ekstra ve hücre içi engellerin bir dizi işlem bulunmaktadır. Ek engeller, hızlı temizleme ve teslim malzemeler ^7,8 kısa süreli içerir. Bu sorunları aşmak için bir strateji, in vivo gen aktarımı için "taşıyıcılar" veya "araçlar" gibi viral vektörler kullanmaktır. Virüslerin doğal olarak gelişmiş iletim özellikleri hücre ^7,9,10 söz konusu bir genin etkin bir dağıtımını sağlar. Viral vektörlerin çok sayıda türleri geliştirilmiş ve farelerde, farklı hücre tipleri ve organların in vivo gen manipülasyonu esnek olanak edilmiştir.

En yaygın olarak kullanılan viral sistemler retrovirüs, lentivirüs, adenovirüs ve adeno-ilişkili virüs (AAV) dahildir 11 kadar. Retrovirüsler, tek dallı bir RNA virüsleridir ve hedef hücre ve organ ^12-14 transdüksiyona genlerin yaşam boyu ifadesi için potansiyel sağlamaktadır mitotik bölünmesi sırasında istikrarlı bir şekilde konukçu hücre genomuna genetik malzemenin neden olabilir. Bununla birlikte, retrovirüsler, çok çeşitli, sadece bölünen hücreleri enfekte eder ve bölünmeyen hücreleri onların etkinliği ¹⁵ derece düşüktür. Bu gen aktarımı için bunların kullanımını sınırlar. Lentivirüs Retroviridae ailesinin bir cinsidir. Diğer retrovirüsler arasında farklı, lentivirüs, her iki bölme ve bölünmeyen hücreleri enfekte edebilir ve yaygın olarak post-mitotik ve yüksek farklılaşmış hücrelerin ¹⁶ gen transferi için kullanılmıştır. Lentivirüs yaşam döngüsü, konakçı genomuna vektör DNA'nın entegrasyonu içermektedir. Bu nedenle, lentivirüs aracılığıyla gen teslimi transduse genetik elementlerin ^16-18 kararlı ve uzun süreli ifadesini sağlar. Ancak, bu özellik bir çift e temsil edebilirVektör DNA 'nın entegrasyonu girmeyle mutagenez neden olabileceğinden, bu virüslerin kullanımı dged kılıcı gen ekspresyonunu değiştirmek için ve ev sahibi hücrelerde artefakt etkilere neden olabilir. Adenovirüs başka yaygın olarak kullanılan gen aktarım sistemidir. Retrovirüsler ve lentivirüsler farklı olarak, Adenovirüsler, entegre olmayan ve konakçı hücreler ^8,10,11,19 genomik bütünlüğü ile karışmaz. Buna ek olarak, Adenovirüsler, bir çok hücre tipinde içine DNA transfekte olabilir ve enfeksiyon aktif hücre bölünmesi ¹⁹ bağlı değildir. Viral vektörler yeteneği ^19,20 çoğaltılması zorunda adenovirüslerin başka önemli özelliği, vektör arınma kolaylığıdır. Bununla birlikte, bu sistemin en önemli uyarı adenovirüslerin, özellikle gen tedavisi çalışmalarında, birçok araştırmalarda kullanımını kısıtlayan, hedef hücrelerin ve organlar ¹⁹ güçlü bir bağışıklık tepkilerini tetikler olabilir.

Bu farklı tip ile karşılaştırıldığındaViral vektörlerin s, rekombinant adeno-bağlantılı virüs (AAV) ideal bir gen iletim sisteminin ^21,22 olduğu görülmektedir. Minimal immünojenite ve patojenitesini ^23,24 sergiler. Buna ek olarak, rAAV bölünmesi ve bölünmeyen hücreleri hem de dahil olmak üzere hücre tiplerinin geniş bir yelpazede enfekte eder. Çoğu durumda, rAAV ana genomlarına entegre değildir; Bu nedenle, hedef hücrelerde arzu genetik ya da genomik değişiklik riski düşüktür ^22'dir.

Son zamanlarda, rAAV sistemleri başarıyla fare kalp kası ^23,25-29, DNA kodlayan proteinlerin miRNA'lar, shRNAs ve CRISPR-gRNAs in vivo verilmesi için kullanılmaktadır. Bu metodoloji kardiyovasküler araştırma alanında temel araştırmalar ve gen tedavisi çalışmaları kolaylaştırmıştır. Burada detaylı bir işlemi etkin bir şekilde tarif edilmiştir aşın veya fare kalplerinde ilgi genleri demonte rAAV9 vektörleri üretir. Protokol, basit ve etkili bir yöntem temin etmektedirfare deneysel modellerde kalp gen ifadesi manipüle.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm açıklanan adımlar Biyogüvenlik Komitesi ve Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller altında yapıldı. Boston Çocuk Hastanesi düzenlenmiş aydınlık / karanlık döngüsü ve iklim kontrolü ile patojen içermeyen fare olanakları bulunmaktadır. Veterinerlik ve hayvan bakım personeli değişim kafesleri farelerin sağlığını sağlamak ve. tesisler AAALAC belgeli ve aktif Hayvan Refahı Güvencesi sertifikası (AAALAC Akreditasyon 1992/02/24 Hayvan Refahı Güvencesi numarası üzerinde Verilen.: A3303-01) var. Fareler, bir basınçlı gaz kaynağı teslim _CO2 ile ötenazi uygulandı. Doku örnekleri durdurduğunu hayvanların kalp hızı, hareketi ve nefes onayladıktan sonra toplandı. Yenidoğan kemirgenler ₂ ötenazi CO dayanıklı ve keskin bir makas kullanarak kafaları kesilmek suretiyle kurban edilmiştir. Bu yöntemler Amerikan Veteriner Medica Ötanazi Paneli tavsiyeleri ile uyumludurl Derneği.

Plazmid omurgasına bir cDNA veya shRNA ekspresyon kaseti klonlanmasıyla rAAV9 Yapılar 1. Üretim

Not: rAAV9 plazmid, gen aşırı ekspresyonu için kullanılan ters çevrilmiş terminal tekrarlarıdır AAV2 (ITRler), ihtiva eden tavuk TNNT2 liman için modifiye edilmiştir kalıt gen ^25,26,29 ve kardiyomiyosit özel dışavurumunu sağlayan yükseltici (rAAV9.cTNT). Benzersiz Nhel ve KpnI sahalarına promotörün aşağı plazmid içine edilmiştir. Ilgi genleri kodlayan cDNA fragmanları, her iki sınırlandırma bölgeleri ^25,26,29 kullanılarak rAAV9 omurgasına klonlanabilir. Burada bir örnek olarak, fare kalplerinde, GFP geninin aşırı ifadesi için rAAV9 vektörü oluşturuldu. Elde edilen plazmid, iki ITR sitelerinin (Şekil 1) tarafından sınırlanan cTnT :: GFP kasetini içermektedir. rAAV9.U6 :: shRNA yapıları ²⁵ demonte gen için kullanılmıştır. kullanarak Tasarım shRNAsOnline ShRNA tasarım sunucuları. rAAV9.U6 :: ShRNA tavlama ve U6 promotör barındıran sınırlama enzimi sindirilmiş rAAV9 vektörlere ShRNA dizileri DNA içeren oligos bağlanması, ya da uzun menzilli PCR ve intra-moleküler Gibson montaj tabanlı "kesintisiz" ya oluşturulabilir inşaat ^30. Elde edilen plazmid, iki ITR sitelerinin (Şekil 2) tarafından sınırlanan U6-shRNA kaseti içermelidir. Burada bir örnek olarak, rAAV9.U6 :: shRNA vektörü Trbp mRNA (: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG Trbp shRNA sekansı) demonte inşa edilmiştir. Bir mücadele shRNA, bir negatif kontrol (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG) olarak kullanılmıştır.

1. rAAV9 plazmid omurgasına cDNA ya da shRNA sentezleme kaseti klonlama. Yetkili, E. Coli hücrelerine ²⁵ içine DNA Dönüşümü.
   Not: rAAV9 DNA transformasyonu için kullanımı stbl2 ya stbl3 E. coli hücreleri, istenmeyen ITR rekombinasyonu azaltmak için.
2. I almaktransforme edilen E. coli hücrelerinden Pozitif bir klon. Lilly-Barnett ortamı, 500 ml kültür yükseltmek ve bakteri hücreleri ^25-30 arasında rAAV9 plazmid ekstrakte edin.
   NOT: Midi / Maxi DNA (> 100 ug) yüksek miktarda elde etmek için rAAV9 plazmid hazırlık. Daha önce tarif edildiği gibi virüsün üretimini önce, her zaman, sınır sindirimi ve agaroz jel elektroforezi ile AAV plasmidlerin sekansı bütünlüğünü analiz (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html).

rAAV9 plazmid ile HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu 2.

1. doğrusal polietilenimin (PEI) çözeltisi 1 ug / ul hazırlayın. Endotoksin içermeyen dH 70-80 ° C'ye kadar ısıtılmış olan ₂ O PEI toz eritilir. Oda sıcaklığına kadar soğutulması, 1 M HCI ile pH 7.0'a Çözeltinin nötralize edilmesi. Filtre sterilize (0.22 mikron) çözümüdür. 1 mcg / ml PEI stok solüsyonu (1.400 ul / tüp) alikotu ve solut saklamak-20 ° C'de iyonu.
2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde kültür HEK293 hücreleri. Kültür 5 ±% 0.5 karbon dioksit ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri _(CO2).
3. 2 seyreltme: 0. günde, on 150 mm'lik tabaklar içerisinde bir 1 bölme>% 90 konfluent hücreler tarafından transfeksiyon önce 18-20 saat HEK293 hücreleri plaka.
   Not: 1. günde, hücreler,% 90 izdiham ulaşmalıdır.
4. Gün 1 'de, rAAV9 plasmid (ör rAAV9.cTNT :: GFP veya rAAV6.U6 :: shRNA oluşturur), Ad-yardımcı plazmit ve PEI ^25,26,29 kullanarak AAV Rep / Kapak plazmidi ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri.
   1. % 90 izdiham hücre 10 yemekler için, 50-ml santrifüj tüpü içinde Ad-yardımcı plazmit 70 AAV Rep / Cap plazmidi ug rAAV9 plazmid PF 70 ug ve 200 ug karıştırın.
   2. Hücreler daha az konfluent iseniz, orantılı DNA miktarını ayarlamak. Hücreler% 75 konfluent altındadır Örneğin, azaltmakorantılı DNA miktarı (adım 2.4.1 gösterilen miktarın 75/90): 70 x 75/90 = AAV-Rep / Cap plazmid 58.3 mikrogram, rAAV9 plazmid x 75/90 = 58.3 mikrogram 70 ve 200 x mix 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde Reklam-yardımcı plazmidin 75/90 = 166.7 ug.
   3. 50 ml'lik bir tüpe (FBS'siz) RT DMEM 49 ml ilave edilir ve iyice karıştırılır.
   4. PEI yapmak için PEI solüsyonu 1.360 ul ekleyin: DNA oranının (h / a) 4 olması: 1 arasındadır. İyice karıştırın. 30 dakika - 15, oda sıcaklığında inkübe edilir.
   5. (On 150 mm'lik tabaklar karışımın 50 mi), her 150 mm tabak için adım 2.4.4 hazırlanan karışım, 5 ml.
5. Kültür 60-72 saat 5 ±% 0.5 _CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri.

3. Hasat transfekte HEK293 hücreleri ve rAAV9 Vektörler saflaştırılması

1. Hücreler, transfeksiyondan sonra, 60-72 saat hasat edilir. Çıkarmak ve yukarı pipetleme ve kültür ortamı ile aşağı yemekleri hücreleri askıya. steril tüm hücre süspansiyonları aktarın50 ml tüpler.
2. 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri Santrifüj. Her bir tüp içinde 5 ml PBS ile hücre pelletini ve bir 50 ml tüp içine tüm hücre süspansiyonları birleştirir.
3. 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri Santrifüj. süpernatant atın. Bu adımda, -80 ° C de hücre pelletini depolamak ya da hemen adımda 3,4-3,15 tarif edildiği gibi, pelet AAV saflaştırılması.
4. 150 mM NaCl ve 20 mM Tris-HCl, pH 8.0: lizis tamponu hazırlayın. Filtre sterilize (0.22 uM). 4 ° C'de tampon saklayın.
5. liziz tamponu 10 ml pelletini.
6. daha sonra bunun çözülme 37 ° C'de, 80 ° C'de ya da kuru buz / etanol banyosu içinde lizat dondurun. 1 dakika vorteksleyin. Freeze ve lizat 3 kez Çözülme.
7. Çözülmüş lizat _MgCI2 solüsyonu (1 mm lizatında _MgCl2 nihai konsantrasyon olun). 250 U / ml bir son konsantrasyona kadar nükleaz ekleyin. DNA / Protein AGGR çözünmesi için 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edinegation.
   NOT: DNA / protein agregasyonu, nükleaz veya endonükleaz tedaviden sonra çözülmüş olsun yoksa Dounce Lizatlar 20 kez homojenize.
8. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4,800 x g'de santrifüjleyin. süpernatant toplayın.
9. Bu arada, iyodiksanol gradyan çözeltisi hazırlayın:
   1. 10x 5 ml PBS, 1 M _MgCl2, 0.05 mi, 1 M KCI, 0.125 mi, 5 M NaCI, 10 ml ve gradyan ortam ofdensity 12,5 ml karıştırma gradyan çözeltisi% 17 hazırlayın. _H2O ile 50 ml toplam hacmini ayarlamak
   2. 10x 5 ml PBS, 1 M _MgCl2, 0.05 mi, 1 M KCI, 0.125 mi, yoğunluk gradyanlı ortam 20 ml ve% 0.5, 0.2 ml (a / h) Fenol Kırmızısı karıştırılarak% 25 çözelti hazırlayın. _H2O ile 50 ml toplam hacmini ayarlamak
   3. 10x 5 ml PBS, 0.05, 1 M _MgCl2 mL, 1 M KCI, 0.125 mi, ve yoğunluk dereceli ortamının 33.3 mi karıştırılarak% 40 çözelti hazırlayın. kullanılarak 50 ml toplam hacmini ayarlamak_H2O
   4. Karıştırılarak% 60 çözelti hazırlayın 0.05 ml 1 M _MgCl2, 1 M KCI, 0.125 ml, yoğunluk gradyanlı ortam, 50 ml ve 0.1 ml% 0.5 (ağırlık / hacim) Fenol Kırmızısı.
10. Bir enjektör ile, alttan başlayarak,% 60 5% 17 mi,% 25, ​​5 ml,% 40, 5 ml ve 5 ml için polipropilen tüp içine iyodiksanol gradyan çözeltisi yükleyin. gradyanın tepesinde Aşama 3,8 (14-16 mi) içinde elde edilen tüm lizat yükleyin. alttan üste doğru listelenmiş gradyan,% 60,% 40,% 25,% 17, ve lizat tabakasıdır. lizis tamponu ile tüp doldurun ve mantar ile örtün.
11. 16 ° C'de 90 dakika boyunca 185,000 x g'de santrifüjleyin.
12. bir şırınga ile viral kısmını (% 40 katman) Hasat. sadece% 40 katman aspire,% 40 ve% 60 fraksiyonları arasındaki kesişme içine iğne (21 gauge) yerleştirin.
    NOT:% 25 tabakasının HERHANGİ aspirasyon kaçının.
13. Sterilize polioksietilen-polyoxypro viral kısmını karıştırın15 ml'lik bir toplam hacme kadar: pylene blok kopolimeri PBS solüsyonu (10,000 PBS içinde seyreltilmiş,% 10 polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri hazır 1). Filtre tüp (cut-off MW = 100 kD) içine karışımı yerleştirin. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin.
14. altta çözüm atın. 15 ml'lik toplam hacme kadar polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri, PBS çözeltisi ile filtre tüp doldurun. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. saflaştırılmış rAAV9 virüsü (filtresinin üzerine fraksiyonu) toplayın.
15. 1.7 ml tüpler filtre tüpünde saflaştırılmıştır rAAV9 aktarın. Saflaştırılmış rAAV9 bölüm (100 - AAV hacmi ve titre bağlı olarak 400 ul / tüp), ve -80 ° C 'de virüs saklayın.
    NOT: tekrarlanan donma-çözülür kaçının.

rAAV9 titresi 4. Ölçüm

1. Standart DNA örnekleri hazırlayın.
   1. özel ve etkili bir PCR TasarımrAAV9 vektörleri için primerler ve PCR durumunu optimize eder.
      Not: ": TCGGGATAAAAGCAGTCTGG;: İleri TCGGACGGAGATACGTGAGT" Bu çalışmada kullanılan primerlerdir. PCR reaksiyonu, aşağıdaki koşullar ile yapıldı: Initial doğasını değiştiren 3 dakika boyunca 95 ° C'de; 20 saniye, 15 saniye, 60 ° C'de ve 10 saniye boyunca 72 ° C'de, 95 ° C'de 35 döngü; ve 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma. RAAV9 vektöründe ilave sekansı PCR ³¹ özgünlüğünü ve verimliliğini etkileyebilir Ancak, optimize edilmiş primerleri ve PCR koşulları, plazmid-özeldir.
   2. Adım 4.1.1 gösterilen şartlara PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Bir jel özütleme kiti ile PCR ürünü saflaştırılır.
   3. Bir spektrofotometre kullanılarak, saflaştırılmış DNA konsantrasyonu ölçümü. PCR ürününün molekül ağırlığı / uzunluğuna göre DNA moleküler sayıda konsantrasyonu hesaplanır.
      1. aşağıdaki denklem kullanılarak moleküler konsantrasyonu hesaplayın: moMolecular konsantrasyonu (DNA molekülleri veya bunların fragmanları / ml) = 6.23 x 10 ^{23 mol-1} X Kon. x 10 ^-6 / MW. Not: (6.23 x 10 ^{23 mol-1} Avagadro sayısı Kon .: DNA konsantrasyonu ng / ml; MW .: g / mol molekül ağırlığı). PCR ürününün elde konsantrasyonu, 100 ug / ml ve uzunluğu 200 bp Örneğin, iki-şeritli DNA molekül ağırlığı, her bir nükleotitden 2 x 200 x 310 = 124,000 (ortalama molekül ağırlığıdır tek-şeritli DNA, yaklaşık 310 g / mol) 'dir. Moleküler konsantrasyonu (DNA molekülleri / mi) 6.23 x 10 ^{23 mol-1} X 100 ug / ml x 10 ⁶ / 124.000 g / mol = 5.18 x 10 ¹⁴ DNA molekülleri / ml =.
      2. 10 ila ¹³ molekül / ml, 10 ila ¹² molekül / ml, 10 ¹¹ molekülleri / ml, 10 ¹⁰ molekülleri / ml, 10 ⁹ molekülleri / ml, 10 konsantrasyonları ile, DNA fragmanının bir seyreltme serisi gerçekleştirmek ve standart örnekleri hazırlamak ^{8 molekülleri / ml ve 10 7 molekülleri / ml olmuştur. (Adım 4.6, qPCR) kantitatif PCR için her bir standart numune için solüsyonun 1 ul kullanın.}
2. 10x DNAz tamponu, 5 ul, DNAz 1 ul (10,000 U / ml) ve GKD ₂ O. 39 ul toplam hacim 50 ul olmalıdır saflaştınlmış rAAV9 çözeltisi 5 ul karıştırın.
3. Kalıntı paketlenmemiş plazmid DNA çıkarmak için 30 dakika için 37 ° C 'de şişe inkübe edin.
4. 10 dakika boyunca 95 ° C 'de DNAz inaktive. , Çözelti önce soğumaya _H2O 44 ul 10x DNAz tampon 5 ul proteinaz K ile stokunun 1 ul (10 mg / ml) ekleyin.
5. 2 saat boyunca 50 ° C'da, çözelti inkübe edin. reaksiyonu durdurun ve 10 dakika boyunca 95 ° C 'de Proteinaz K etkisiz hale getirirler.
6. kantitatif PCR (qPCR) deneyi için örnek 1 ul kullanın. titresi hesaplayın.
   1. Numuneler fr kullanarak adım 4.1.1 tasarlanmış primerler ile kantitatif PCR (qPCR) çalıştırınom adımı 4.1.4 (standart numune) ve aşama 4.5 ila (örnekler, bundan).
      1. Her bir reaksiyon için, (Taq polimeraz, dNTP karışımı, tampon, _MgCl2 ve yeşil boya ihtiva eder) 2x Yeşil ana karışımı 10 ul ileri primer (5 uM), 0.5 ul ters primeri (5 uM), 0.5 ul karıştırın _H2O 8 ul ve örnek 1 ul ölçülecek. aşağıdaki koşullarda qPCR gerçekleştirmek: 2 dakika ve 10 dakika boyunca 95 ° C, 50 ° C 'de numuneler tutun; 15 sn için ve 1 dakika boyunca 60 ° C 'de 95 ° C' de 40 döngü gerçekleştirmek; erime aşaması için, 30 saniye ve 15 saniye süreyle 60 ° C, 95 ° C 'de numuneler inkübe edin. Standart numuneler (Şekil 3) C _T numaraları dayalı standart eğri oluşturmak.
   2. standart bir eğriye karşı AAV numunenin molekül konsantrasyon / titresi hesaplanır. rAAV9 tek iplikli DNA genomu, bu nedenle molekül konsantrasyonundan 2 kat daha yüksek olacakHesaplanan değer (2x gücü (10, y), Şekil 3B). Buna ek olarak, arıtılmış, rAAV9 titresi bağlı DNase ve proteinaz K reaksiyonlarda virüsü (100 ul toplam 5 ul) 1:20 seyreltme hesaplama elde edilen daha büyük bir değere 20 kat olacaktır.

Heart Yenidoğan Farelerde ve Gen İfadesi Tahliller 5. rAAV9 Enjeksiyon

1. polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri, PBS çözeltisi içinde rAAV9 çalışma çözümleri hazırlayın. 1-7 x 10 ¹² parçacıklar / ml titreleri ile virüs stok yapmak.
   NOT: deri altı enjeksiyonu ile her doğum sonrası gün 0.5-1.5 fare içine rAAV9 çözeltisi 50-70 ul sunun. etkin gen ifadesinin veya demonte elde etmek için, enjekte edilen AAV miktarını optimize etmek için her bir çalışma için bir pilot testi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. önyargı en aza indirmek için her çalışma için rAAV9.cTNT :: Luc veya rAAV9.U6 :: karıştıran kontrolleri aynı miktarda kullanın.
   NOT: 1-1.5 kullanılanx 10 ¹¹ parçacıklar / yavru aşırı ekspresyonunun ve 2.5 - doğum sonrası gün 0.5-1.5 mi ce) içinde demonte için 5 x 10 ¹¹ parçacıklar / yavru.
2. Deri altı enjeksiyonu ile P0.5-P2.5 de rAAV9 neonatal fareler davranın.
   1. rAAV9 çözümü ile bir 29G1 / 2, 0.33 x 12.7 mm insülin şırınga önceden doldurun. Hava kabarcıklarını çıkarmak için dikkatli olun.
   2. başparmak ve işaret parmağı ile bir yandan cryo anestezi yavru tutun. Enjeksiyondan önce, steril durumunu korumak için% 70 izopropil alkol ile doymuş bir çubukla sopayla yavru arka cilt tokatlamak. 5 ila 10 ° 'lik bir açı ile hayvan ön-dorsal subkütisine bir şırınga iğnesi yerleştirin. insülin şırınga kullanarak rAAV9 çözeltisi 50-70 ul enjekte edilir.
      NOT: rAAV9 da intraperitoneal veya intravenöz enjeksiyon ^26,27 aracılığıyla fare teslim edilebilir. kalp teslim genlerin etkin ekspresyonu elde edilebilir. Bununla birlikte, intraperitonal enjekteİyon bazen karaciğer sızan ifade neden olabilir. enjeksiyonundan sonra, yavruların durumu her gün izlendi.
3. Kalp gen ekspresyonunun seviyesi qPCR, immünofloresan veya western blot ile izlenebilir (Örnek sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir ve 5) ^25,26.
   Not: Fareler, sıkıştırılmış gaz kaynağından teslim _CO2 ile ötenazi uygulandı. Doku örnekleri hayvanların kalp atış hızı, hareket ve solunum sona olduğu doğrulandıktan sonra toplanmıştır. Yenidoğan kemirgenler ₂ ötenazi CO dayanıklı ve keskin bir makas kullanarak kafaları kesilmek suretiyle kurban edilmiştir. yöntem Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötanazi Paneli önerileri ile tutarlıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

RAAV9.cTNT :: GFP veya rAAV9.U6 :: shRNA plasmidlerin rAAV9 yapımı için strateji Şekil sırasıyla 1 ve 2, gösterilmiştir. Örnek olarak, rAAV9 vektörü, fare kalplerinde GFP geninin aşın ifade etmek üzere oluşturuldu. Elde edilen plazmid, iki ITR sitelerinin (Şekil 1) tarafından sınırlanan cTnT :: GFP kasetini içermektedir. RAAV9.U6 :: ShRNA vektör Trbp mRNA demonte inşa edilmiştir (Şekil 2)<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Plazmid, inşaat sırasında istenmeyen ITR rekombinasyonu azaltmak için çok önemlidir. virüs oluşturmadan önce, bir zaman kısıtlaması sindirim ve agaroz jel elektroforezi kullanılarak AAV plazmid ITR bütünlüğünü izlemek gerekir. % 100 sağlam plazmidler elde etmek mümkün değildir, ancak rekombinasyon oranı mümkün olduğunca en aza indirilmelidir. Az% 20 başarı rAAV9 paket için kabul edilebilir. Dikkat çekici bir alt sallayarak hızla (180-200 rpm) ile düşük sıcaklıkta (30 ° C) bakteriler...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nuclease, ultrapure	SIGMA	#E8263-25KU
Density Gradient Medium(Iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub	SIGMA	#CAD7942-12EA
Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution)	SIGMA	P5556-100ML
Proteinase K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
Centrifuge machine	Thermo Scientific	75004260
Centrifuge System	Beckman Coulter	363118
Ultracentrifuge	Beckman Coulter
DMEM medium	Fisher Scientific	SH30243FS
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9 vector	Penn Vector Core	P1967