عابر الدماغي الأوسط الشريان انسداد نموذج من السكتة الدماغية حديثي الولادة في الفئران P10

Summary

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Abstract

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Introduction

السكتة الدماغية خلال فترة ما بعد الولادة هي سببا هاما من أسباب الوفاة والعجز، والتي تحدث في ما يصل الى 1 في 2300 ولادة حية ^1. وهذا يؤدي إلى تطوير النظام العصبي المركزي المتغيرة وزيادة معدلات الإصابة بالمرض على المدى الطويل، بما في ذلك زيادة حالات الصرع، والشلل الدماغي والتخلف العقلي، وغيرها من أنواع السيارات أو ضعف الادراك. آثار مدى الحياة من السكتة الدماغية المبكرة تجعل النماذج الحيوانية متعدية ضرورية لدراسة آليات الإصابة وإصلاح في هذه الفئة من السكان، بما في ذلك استراتيجيات لحماية الدماغ المصاب أو لتعزيز الإصلاح.

وقد استخدمت نماذج نقص التروية مختلفة لدراسة إصابات الدماغ في الحيوانات البالغة، وبينما رايس وVannucci (معدلة ليفين) يستخدم ² الإجراء عادة لدراسة إصابة الإقفاري بنقص التأكسج في الدماغ النامية، البؤري نقص التروية ضخه هو آلية واضحة للإصابة مما تسبب في إصابة التنسيق، مع جوهر المصابين وpenumbra والأنسجة البعيدة لم يصب. وقد وضعت نماذج كويزومي ³ و ⁴ لونجا في الفئران البالغة لتحقيق عابرة وسط انسداد الشريان الدماغي عن طريق الشريان السباتي المشترك (CCA) والشريان السباتي الخارجي (ECA)، على التوالي. في كلا النموذجين، ربط دائم والكي من فروع الشريان مهمة للحد من النزيف وتبسيط الإجراء الجراحي، والذي يسبب أيضا آثارا سلبية على قدرة الحيوان على إطعام واكتساب الوزن بعد الاصابة. وعلاوة على ذلك، هناك آليات واضحة إصابة في الدماغ غير ناضجة وأنماط محددة من الإصابة ينظر إليها على أنها نتيجة لذلك.

وفي الآونة الأخيرة، استخدمت السكتة الدماغية photothrombotic (طريقة روز البنغال) ⁽⁵⁾ ودائم MCA ربط ⁶ لدراسة السكتة الدماغية حديثي الولادة وتعليم الكبار. كل من السكتة الدماغية photothrombotic وMCA ربط خلق تغييرات دائمة في تدفق الدم إلى المخ أن يؤدي إلى نقص في reperfusأيون. ضخه هو عنصر حاسم من تطور وتقدم الإصابة التنسيق، مع زيادة التحفيز الزائدة، وتشكيل الجذور الحرة، والنيتريك إنتاج أكسيد مما يؤدي إلى موت الخلايا تأخر ينطوي على إشارات أجهزة الطرد المركزي التي تختلف من مرحلة الدماغية ^7. ويشمل نقص الأكسجة نقص التروية دائم ربط الشريان السباتي من جانب واحد يليه نقص الأكسجة العالمي، والذي يختلف أيضا من سبب الإصابة بنقص التأكسج الدماغية لدى البشر ولا تتسبب في نمط الإصابة بؤري ثابت، مما يجعل دراسة جوهر المصابين وغبش أكثر تحديا.

وصفناها سابقا نقص التروية ضخه نموذج السكتة الدماغية غير نزفية في الفئران غير ناضجة باستخدام عابرة وسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO) ^{8، 9، 10.} هذا هو وسيلة أقل الغازية التي يصل وoccludes على MCA من خلال الشريان السباتي الداخلي دون ligati دائمةأو الكي. وهذا يوفر نموذجا للإصابة مماثلة إلى السبب الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية في فترة ما حول الولادة ^{11 و 12.} هذا نموذج نقص التروية ضخه من النتائج إصابة في الأضرار التي لحقت المخطط المماثل والقشرة الجداري الصدغي. هذا النموذج من tMCAO أيضا يساعد في التحكم في شدة الإصابة بنسبة تتراوح مدة انسداد. يمكن فحص مسارات الإشارات والتغيرات النسيجية في قلب المصاب وغبش وفي النسيج المماثل والمقابل لم يصب مزيد من إلقاء الضوء على آليات الإصابة وإصلاح في الدماغ غير ناضجة. وهذه الدراسة تثبت هذا النموذج إصابة مهم لنمو الدماغ.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البحوث الحيوانية في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو جنة للبحوث الحيوانية وأجريت وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، المنشور رقم 85-23، 1985 ). تم رصد الحيوانات عن كثب من قبل الأطباء البيطريين لجنة UCSF المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC)، المعتمدة من قبل AAALAC. تم الحصول على واحدة من الإناث سبراغ داولي الفئران مع القمامة القديمة يوم 8 (10 الجراء في القمامة). أعطيت الأم والجراء لها الطعام والمياه libitum الإعلانية ويضم في مرافق الرعاية الحيوانية و للحرارة التي تسيطر عليها الضوء في تخصيب اليومي، في بروتوكول IACUC، حتى كانت الجراء 10 يوما القديمة. تم تعقيمها جميع الأدوات الجراحية المستخدمة في هذا الإجراء لضمان العقم. يتم الحفاظ على عقم نصائح أداة في جميع أنحاء الجراحة.

1. الأوسط انسداد الشريان الدماغي

1. وزن الجرو ويكفل له أنه هو الوزن الصحيح (19-21 جم). تخدير الجرو في 3٪ الأيزوفلورين في 100٪ O ₂ و ضمان عدم وجود استجابة لقرصة القدم. المحافظة على درجة حرارة سطح الجسم بين 35.5 درجة مئوية و 37 درجة مئوية مع استخدام وسادة التدفئة تحت مرحلة الجراحية.
2. تأمين الحيوان في موقف ضعيف مع الشريط عبر المناطق الكتف. باستخدام قطعة قطن معقمة، مسحة عنق الرحم المنطقة الأمامية مع حل بوفيدون اليود تليها مسحة من 70٪ من الإيثانول في الماء المقطر المزدوج، بالتناوب بين كل حل لأربع مسحات الإجمالية.
3. التسلل محليا 0.25٪ بوبيفاكايين في موقع شق المخطط له. باستخدام المجسام، وجعل خط الوسط شق عنق الرحم 5-7 ملم الأمامي لفضح الشريان السباتي المشترك (CCA). ضع 2-4 مبعدات للحفاظ على تجويف مفتوح والشريان عرضة للخطر.
4. حدد موقع الشريان السباتي الداخلي (ICA)، الشريان القذالي (OA)، والشريان السباتي الخارجي (ECA). العريس الشرايين للحصول على رؤية واضحة. اصبح سيارةeful عدم تعكير صفو العصب المبهم.
   ملاحظة: للحصول على الجراء الشام التي تديرها، يتم ترك inicision مفتوحة وتتعرض الشرايين، وبعد ذلك يتم خياطة الجرح مغلقة. إجمالي وقت التخدير ما يعادل ذلك من جراحة انسداد.
5. خفض 1.5 سم من 6-0 الحرير موضوع مضفر خياطة. Unbraid خياطة، سحب خيوط واحدة. تأكد من أن فروع واحدة هي نظيفة وليس المتوترة.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، smoothe نهايات المتوترة التي كتبها غمس ضفيرة واحدة في الماء المعقم والاستمالة حبلا مع نصائح forcep.
6. في حين عقد حبلا خياطة مع ملقط 45 درجة، حرك ملقط في حركة قوس شاملة للذهاب تحت ICA بحيث تظهر النصائح forcep بين ICA وOA.
   ملاحظة: إذا تم تشريح جيدا، وهذه الخطوة سوف يكون من السهل نسبيا. إذا كان ICA وOA هي مؤثرة، يجب الحرص على عدم تمزق الشرايين عند استخدام ملقط لعزل ICA. في حالة حدوث نزيف، والضغط على الشريان مع ملقط حتىتوقف النزيف. امتصاص الدم مع مسحة معقمة.
7. الاستيلاء على نهاية حبلا خياطة الجروح التي في حوزة ملقط وتسحبه حتى نهاية من السهل الوصول إليها. الافراج عن حبلا من ملقط ودعم ملقط من تحت ICA، وعكس اتجاه الحركة في خطوة 1.5 (الشكل 1A).
8. ربط ربطة مؤقت حول ICA في القاعدة، الأقرب إلى حيث يفصل من CCA.
   ملاحظة: من المهم أن يعقدا قرانهما بحيث نهاية حبلا التي سيتم سحبها لإزالة عقدة هي فترة كافية (أكبر من 1 ملم، وأقل من 3 مم) لفهم بسهولة مع ملقط، مع ضمان أنه لا يوجد أحد كمية مناسبة من حبلا خياطة على الجانب الآخر من عقدة لتراجع.
9. بعناية التراجع عن ICA أفقيا واستخدام مقطع لتأمين حبلا إلى الجلد الزائد بالقرب من منطقة الإبط على الجانب المقابل شق. تأكد من أن هذا التراجع حبلا هو مشدود بما فيه الكفاية لوقف تدفق الدم قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، لتقليل خطر حدوث نزيف غير المنضبط. لاحظ أن الشريان مسطح وشاحب.
   ملاحظة: لا تبالغ في التراجع، لأنها يمكن أن تسبب بتمزق جزئي أو كامل للICA. وتراجع يمكن تعديلها فقط قبل اتخاذ بضع الشريان عن طريق سحب على حبلا على العكس الجانب إلى مقطع.
10. استخدام 45 درجة ملقط لفهم حبلا آخر خياطة unbraided وحلقة تحت وحول ICA، كما في الخطوة 1.5. موقف هذا حبلا الوحشي لحبلا تراجع (الشكل 1B).
    ملاحظة: يمكن أيضا أن هذه الخطوة ينبغي القيام به قبل التراجع. إذا لم تكن متأكدا حول نوعية تراجع، هذه العقدة يمكن ربط فضفاضة جدا قبل الخطوة التالية.
11. قطع منتصف الطريق بضع الشريان 0.2 ملم بين الحروف المركبة مرتبطة وغير مقيدة، المخطئين أقرب إلى ضمد مرتبطة.
    ملاحظة: المتبقي الدم في الشريان مرتبطة حالا قد أفرغ من خلال بضع الشريان ولكن يجب أن لا تتجاوز 5 ميكرولتر. إذا استمر النزيف، وسحب بعناية حبلا التراجع إلى زيادة تراجع، مع الرعاية لالفراغ الإضرار الشريان من التوتر المفرط.
12. وباستخدام مسطرة متري، وقياس خياطة الاغلاق وقطع الخيط مع بدل اضافي من 2-3 ملم لإزالة مطبق خلال ضخه. عقد مطبق مع ملقط 45 درجة واستخدام ملقط على التوالي لخلق منحنى على طول المناسب للوصول إلى MCA، مما يشكل نقطة توقف للتقدم.
    ملاحظة: 10 ملم طول انسداد من طرف نهاية السيليكون لثني يستخدم لP10 سبراغ داولي أو طويل ايفانز الفئران الوليدة في هذا النطاق الوزن.
13. باستخدام ملقط 45 درجة، وإطعام النايلون انسداد خياطة المغلفة السيليكون في بضع الشريان ودفع خياطة إلى منعطف الذي يصادف المسافة المحددة مسبقا إلى MCA (الشكل 1C). ضمان التقدم يشعر على نحو سلس. التوقف فورا عن التقدم إذا شعر المقاومة. أثناء التقدم، وتهدف خياطة في الاتجاه الذي هو مواز لCC / ECA، نحو الرأس.
    ملاحظة: إذا كان الخيط هو ظهريا المتقدمة، ونحوالعمود الفقري للحيوان، قد تصل الى الشريان الحنكي (PTA). إذا شعر المقاومة بعد 3-5 ملم من التقدم، وضرب خياطة تقاطع منطقة التجارة التفضيلية. دعم مطبق من الشريان حتى الرأس سيليكون بالقرب من بضع الشريان قبل تعديل الاتجاه النهوض بها. وليس من الضروري تماما لإزالة مطبق من بضع الشريان.
14. تأمين مطبق من قبل ربط ربطة مؤقت، وذلك باستخدام حبلا من الخطوة 1.10 (1D الشكل).
15. إزالة مقطع ضام. تقليم فروع في كل من الحروف المركبة مؤقتة بحيث حبلا من عقدة التي يتم سحبها لإزالة عقدة من السهل فهم مع ملقط على التوالي وأطول من حبلا التي يتم سحبها لتشديد عقدة.
    ملاحظة: يجب أن خيوط تكون قصيرة بما فيه الكفاية بحيث لا متشابكة في تجويف بعد الإغلاق.
16. إزالة مبعدات وإغلاق تجويف باستخدام 6-0 الحرير مضفر لخلق 3-4 خيوط متقطعة.
17. إزالة الجرو منالتخدير ووضعه على وسادة التدفئة في هواء الغرفة. مراقبة الجرو حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية وتأكد من أنه تعافى تماما قبل إعادته إلى السد. تأكد من أن الجرو يحافظ على درجة حرارة سطح الجسم بين 35.5 درجة مئوية و 37 درجة مئوية.
18. وخلال الانسداد، مرجحة نشر التصوير بالرنين المغناطيسي (DW-MRI) تحت التخدير الأيزوفلورين يمكن استخدامها للتحقق من تحريض المناسب من الاصابة. يوضح الشكل 2 الإصابة الدماغية الجارية الكشف عنها بواسطة DW-MRI خلال tMCAO ^9.
    يتم تنفيذ المرجحة إنتشار تدور مستو صدى التصوير 10-15 دقيقة قبل ضخه: ملاحظة. وتصوير الدماغ بأكمله مع أقسام الاكليلية 2 ملم سميكة التسلسلية باستخدام إعدادات تسلسل نبض التالية: TR / TE = 5000/60 مللي و 4 متوسطات، مجال الرؤية = 35 مم، مصفوفة البيانات = 128X128 ونشرها مدة التدرج = 20 مللي، وفصل = 29.7 مللي ثانية، والسعة = 70mT / م، وب عامل = 1045 ق / مم ^2.الحيوانات اظهار عدم إشراك القشرية أو الإصابة الدماغية غير نمطية، كما هو الحال في الدماغ، يتم استثناء.

2. ضخه

ملاحظة: يتم تنفيذ انسداد لمدة 3 ساعات لسبب كمية متوسطة إلى شديدة من الإصابة التي تنطوي على المخطط وقشرة.

1. وفي حوالي 2 ساعة و 50 دقيقة بعد انسداد MCA، تخدير الجرو في 3٪ الأيزوفلورين في 100٪ O _2. حفاظ على درجة حرارة سطح الجسم بين 35.5 درجة مئوية و 37 درجة مئوية مع استخدام وسادة التدفئة تحت مرحلة الجراحية.
2. إزالة الغرز توقف من الخطوة 1.16 وتحديد تقاطع، التي وضعت من قبل اثنين من الأربطة وذيل خياطة الاغلاق.
   ملاحظة: يتم يسببها الحيوانات التي تديرها الشام ويبقى تحت التخدير لفترة زمنية تعادل الحيوانات المغطي. يتم فتح شق مرة أخرى وخياطة مغلقة. الحيوانات الشام التي تديرها، انتقل إلى الخطوة 2.11.
3. فك بعنايةعقدة معظم الجانبية مرتبطة سابقا في الخطوة 1.14 عن طريق سحب حبلا الطويل.
   ملاحظة: إذا كان هناك مقاومة في حل العقدة، ووقف للتأكد من أن حبلا الصحيح من عقدة يتم سحبها. إذا استمرت المقاومة، وزيادة التكبير لرؤية أفضل. توخي الحذر عند فك القيود، كما أنه من الممكن أن يؤدي إلى تلف الشرايين خلال هذه الخطوة.
4. إزالة حبلا خياطة من تجويف.
5. في تمام الساعة 3 ساعات التالية MCA انسداد، نسخ ببطء خياطة الاغلاق من الشريان. لن تكون هناك مقاومة.
   ملاحظة: في معظم الحالات، سوف يكون هناك نزيف. في حالة حدوث كمية صغيرة من النزيف، والضغط على الشريان في الموقع بضع الشريان.
6. استخدام ملقط لممارسة الضغط على لبضع الشريان، كما يعيد الخطوة التالية تدفق الدم ICA لضخه.
7. فك بعناية عقدة سطي باستخدام نفس الطريقة كما في الخطوة 2.3.
8. إزالة حبلا خياطة من الجسم وتطبيق وكيل مرقئ إلى بضع الشريان لوقف النزيف.
9. تأكد من أن النزيف قد توقف.
   ملاحظة: عودة الشكل الأصلي الشريان واللون الأحمر تؤكد أن تمت استعادة تدفق الدم ICA.
10. إزالة مبعدات وإغلاق تجويف مع 3-4 خيوط متقطعة من 6-0 الحرير مضفر.
11. إزالة الجرو من التخدير ووضعه على وسادة التدفئة في هواء الغرفة. مراقبة عليه حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية وضمان الشفاء التام قبل إعادته إلى السد. تأكد من أن الجرو يحافظ على درجة حرارة سطح الجسم بين 35.5 درجة مئوية و 37 درجة مئوية.
12. تفقد الجراء يوميا لمدة 5 أيام. Recprd أوزانها وتفقد مواقع شق بشكل وثيق لتضميد الجراح المناسب. إزالة الغرز بعد 7-14 أيام. إصابة بعد tMCAO يمكن تصوير مع التصوير بالرنين المغناطيسي، وإذا رغبت ^9.
    ملاحظة: الحيوانات قد تفقد ما يصل الى 1 غرام من الوزن في اليوم الأول ولكن عادة استعادة الوزن دون تدخل ويكون ضمن مماثلة تزنر مجموعة لضوابط من قبل أيام 4-5. نادرا، الجرو قد تفقد الوزن الزائد أو يكون تغذية صعوبة، وتتطلب أنبوب تغذية عن طريق الفم يغذي لمدة 2-3 أيام.
13. في P21، والإصابة يمكن تقييمها بشكل موثوق مع الاختبارات السلوكية الحسية، مثل rotarod أو اسطوانة التربية. الاختبار المعرفي لا يمكن أن يؤديها في وقت مبكر من 4-6 أسابيع من العمر باستخدام تقييمات مثل التعرف على وجوه رواية أو الماء متاهة موريس ^13.
14. الموت ببطء الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من Euthasol (50 ملغ / كلغ) للحصاد الدماغ ^{11 و 12.}
15. حجم الإصابة أو استجابة لتدخلات لا يمكن أن يؤديها مع البنفسجي الكريزيل أو H & E تلطيخ (الشكل 3) ¹⁰ التحليل النسيجي لتقييم.

النتائج

شدة الضرر الناجم عن tMCAO تعتمد بشكل كبير على كل من الوقت انسداد وخبرة الجراح. A انسداد 90 دقيقة في كثير من الأحيان تنتج خفيفة الى معتدلة نمط الإصابة، في حين أن 3 ساعات تنتج إصابات بين متوسطة وشديدة. يمكن تقدير شدة الإصابة من خلال مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي، الأنسجة، أو التحليلات السلوكية على المدى القصير أو على المدى الطويل. يوضح الشكل 2 مثالا للDW-MRI إجراء 75 دقيقة إلى انسداد 90 دقيقة، مؤكدا الإصابة الدماغية التي تنطوي على نصف الكرة المماثل. نشر التصوير المرجح يدل على زيادة نشر في المخطط المماثل والغالبية من القشرة المماثل، دون تغييرات المقابل، خلال المرحلة الدماغية الحادة. هذا يرتبط إلى مستوى معتدل من إصابة طويلة الأجل تشمل كلا من القشرة والمادة الرمادية عميقة.

انسداد نتائج MCA في موت الخلايا التي تبدأ في المخطط للإصابة أقل حدة وتطور تفاقم الاصابة القشرية وقرن آمون في أوقات انسداد أطول وإصابة أكثر شدة. خلال تعظيم الاستفادة من هذه التقنية الجراحية، مثل تحديد خياطة طول الإدراج، MRI ينصح بشدة، لأنها تسمح لتأكيد وضع الخيط الصحيح والتصور وذمة وتطور الإصابة خلال الانسداد ^{14 و 15 و 16.} إذا MRI غير متوفرة، H & E أو الكريزيل تلطيخ البنفسجي طرق النسيجية بسيطة وموثوق بها لتحديد الإصابة التشكل، ويمكن استخدامها في كل من النقاط الزمنية المبكرة والمتأخرة بعد tMCAO. يوضح الشكل (3) نمط إصابة معتدلة إلى شديدة على فحص الأنسجة بعد انسداد 3 ساعات، مما يدل على تشكيل الكيس وحدة التخزين في المخطط المماثل والقشرة.

> الكمي stereological متحيز أقسام الكريزيل البنفسجية الملطخة لحساب نسبة المماثل لحجم نصف الكرة الأرضية المقابل يؤكد المماثل الإصابة الدماغية ضخه. على وجه التحديد، بعد التخدير الحيوان مع Euthasol، كان حصادها الدماغ عن طريق نضح transcardiac في 0.1 M PBS مع 4٪ لامتصاص العرق. وبعد postfixation بين عشية وضحاها وموازنة في 30٪ سكروز، ومقطوع الدماغ بأكمله في 50 ميكرومتر فترات، واختير كل قسم الثاني عشر، التي شنت، وملطخة الكريزيل البنفسجي ^10.

حتى مع إصابة خفيفة، والتغيرات الحركي، مثل الطواف وفالج، لاحظت خلال الفترة انسداد. مع أكثر إصابة شديدة، فإن هذه التغيرات تستمر بعد ضخه. اختبار السلوكي إضافية يمكن استخدامها لتقييم شدة إصابة، بما في ذلك rotarod أو اسطوانة اختبار تربية من أجل وظيفة الحسية ومتاهة موريس المائية للوظيفة الادراك ^13.

الشكل 1: صور جراحية حية من إجراء tMCAO. ويحلق (A) أول حبلا خياطة حول ICA، كما هو مفصل في خطوة 1.6. (B) ويرتبط ضمد مؤقت الأول وتراجع عن ICA. ويحلق حبلا خياطة الثاني حول ICA، الأفقي إلى أول حبلا خياطة، كما هو مفصل في خطوة 1.9. ويتم تغذية (C) سيليكون المغلفة خياطة انسداد في الموقع بضع الشريان، كما هو مفصل في خطوة 1.12. (D) ويرتبط ضمد مؤقت الثاني لتأمين مطبق في المكان، كما هو مفصل في خطوة 1.14. شريط مقياس = 1 مم.

الشكل 2: MRI خلال Occlusion يدل على جانب واحد من الإصابات المناسبة. الأمامي إلى الخلفي، صورة شرائح الاكليلية من DW-MRI، التي أجريت خلال الانسداد 90 دقيقة، وإظهار زيادة انتشار تنطوي على نصف الكرة المماثل (الأسهم)، وهو ما يتسق مع الإصابة الدماغية الجارية في المرحلة الحادة. أعيد طبعها بإذن من السكتة الدماغية ^11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): من جانب واحد الإصابات إشراك المخطط وقشرة في 4 أسابيع التالية tMCAO. الخلفي لالأمامي، ملطخة الكريزيل البنفسجي-أقسام الدماغ الاكليلية (كل 50 ميكرون) تحصد من P38 الحيوانات تبين إصابة شديدة إلى حد ما (تظهر السهام تشكيل الكيس المماثل وخفضت القشرية وحجم العقدة المخططة) بعد tMCAO 3 ساعات في P10. حفرة مستديرة على الجانب الأيسر يمثل معرف نصف الكرة الأرضية المقابل. شريط مقياس = 5 ملم. أعيد طبعها بإذن من علم الأعصاب من الأمراض ^(12). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

أولا، من المهم للحفاظ على سوائية الحرارة من بدء التخدير حتى الشفاء التام، كما أن هناك من المعروف تأثيرات كل من انخفاض حرارة الجسم ¹⁷ و ¹⁸ ارتفاع الحرارة على تطور إصابات الدماغ في كل من الحيوانات غير الناضجة والناضجة. ثانيا، في حين تأمين الحيوان والتراجع شق، وتحديد المواقع المثلى لمراقبة التنفس والتأكد من أن القصبة الهوائية خالية من ضغط غير ضروري. ثالثا، تجنب الضغط أو تمتد العصب المبهم، لأن هذا قد يسبب تغيرات في معدل ضربات القلب مع تحفيز العصب الحائر. رابعا، بسبب تراجع للICA ضروري للسيطرة على النزيف خلال بضع الشريان، يجب أن تدفع الانتباه إلى درجة من التوتر خلال التراجع لتجنب إتلاف الشرايين. إذا كان الشريان لا المسيل للدموع من التراجع، أو إذا كان هناك سوء بضع الشريان شق، ينبغي استبعاد الحيوان من التحليل بسبب خطرمن نزيف وضعف ضخه.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي كدليل، قد يكون الأمثل طول الخيط للتأكد من أن الطرف سيليكون occludes صحيح MCA لإنشاء نقص التروية البؤري. إذا MRI غير متوفرة، قد يتم التخلص الجراء قبل ضخه للتشريح لتصور موضع خياطة. ضبط طول الخيط حسب الحاجة. وزن الجرو يرتبط إلى حد كبير مع متطلبات طول الاغلاق خياطة. الساعة انسداد يمكن تعديلها لضبط درجة شدة الإصابة.

وبالإضافة إلى ذلك، شكل خياطة وطول حاسمة. لP10 سبراغ داولي وطويل ايفانز الفئران وزنها 19-21 غ، 10 ملم وطول الأمثل للالإدراج في تجربتنا. مزيد من ادراج خياطة الاغلاق قد يؤدي إلى ثقب في MCA. وعلاوة على ذلك، فإن التناسق في شكل خيوط الاغلاق في كل عملية جراحية يؤدي إلى الاتساق زيادة الإصابة صattern ^{19 و 20.} لهذا السبب، أوصينا باستخدام الخيوط الجراحية المصنعة مهنيا لهذا الغرض المحدد. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن نمط الإصابة قد تختلف بين الممارسين بسبب الخلافات التي تبدو دقيقة في تقنية.

حدود أسلوب

أداء هذه التقنية في الصغيرة، وتطوير القوارض يتطلب خبرة كبيرة. إذا أجريت بشكل صحيح، الجراح قادر على التسبب في إصابة نمط ثابت للغاية عبر الحيوانات من مختلف الأحجام وتحقيق معدل البقاء على قيد الحياة أكبر من 95٪. وعلاوة على ذلك، الأدوات الجراحية المناسبة ضرورية. الأدوات الجراحية يجب أن تكون بحالة جيدة لضمان أن جميع نصائح أداة تقارب بشكل صحيح.

أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب القائمة أو بديلة

في حين نقص الأكسجة نقص التروية، أو الأرز Vannucci نموذج ² ، هو الأكثر شيوعا لدراسة إصابة الإقفاري بنقص التأكسج في الدماغ النامية، من المهم أن نلاحظ أن هذا النموذج من tMCAO يختلف من مرحبا في أن هناك نقص التروية التنسيق عابرة دون نقص الأكسجة العالمي، تليها مرحلة ضخه عندما يكون تتم إزالة العراقيل واستعادة تدفق الدم. هذا يؤدي إلى إصابة أكثر اتساقا وقابلة للتكرار، وأكثر متعدية سريريا عن طريق التسبب في نمط إصابة مماثلة لتلك التي شوهدت في السكتة الدماغية حديثي الولادة فترة ولاية كاملة. وهذا يتيح للدراسة أنماط الإصابة التنسيق والاستجابات التعويضية في الأنسجة لم يصب.

التطبيقات المستقبلية بعد اتقان هذه التقنية

هذا النموذج يشبه السبب الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية في حديثي الولادة الإنسان، وهو خثرة سادة عابرة التي تحدث خلال فترة ما حول الولادة ^{11 و 21.} المسببات غير واضح تماما، وهو على الأرجح سياقاتها، ولكن يفترض في معظم الحالات رس تنجم عن الصمات يمر من المشيمة ^(11). وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من الأطفال حديثي الولادة مع السكتة الدماغية فترة ما حول الولادة يفترض الحالية في كثير من الأحيان مع نوبة الصرع لاحق أو الفحص العصبي البؤري خفية تشوهات ^22. وهذا يجعل استخدام نموذج إصابة متعدية ثابت لتحديد آليات تطور الإصابة والاستراتيجيات العلاجية الممكنة حاسمة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflourane	Henry Schein	50033	anesthetic, at 3%
Trinocular Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
Heating pad	Sunbeam	000731-500-000	low to medium setting
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Retraction kit for small animals	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	112522-00	2x
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	2x
B-2 Micro Clamp	Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm cutting edge
Occlusion Sutures	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Ruler	Fine Science Tools
Hemostatic Agent	Avitene	DVL1010590
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 mL/kg
Cotton Tipped Applicators	Henry Schein	100-9249
Laboratory Tape	VWR	89097-990