JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Abstract

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.

IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 ± 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 µg/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 µg/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

Introduction

تنظيم نمو الخلايا وموت الخلايا الاستجابات المناعية أمر أساسي لدور الأسرة عامل النسخ من العوامل التنظيمية مضاد للفيروسات. يتم تمييز IRF5 بأنها حاسمة لتنظيم الاستجابات المناعية بين النوع 1، وتعزيز الاستجابة الالتهابية والنوع 2، وإصلاح الأنسجة الاستجابة المناعية الاستهداف. IRF5 أساسية في سرطان 1، والمناعة الذاتية 2، 3، 4، 5.

الماوس ضيق الجلد (تصك / +) هو نموذج لتليف الأنسجة وتصلب الجلد بسبب طفرة الازدواجية في الجينات fibrillin-1. هذه الطفرة النتائج في الجلد محكم وزيادة في النسيج الضام. هذه الفئران تطوير التهاب عضلة القلب، والتليف وأخيرا فشل القلب 5، 6، 7،> 8، 9. تصلب الجلد هو اضطراب المناعة الذاتية التي تؤثر متليفة ما يقرب من 150،000 مريض في الولايات المتحدة (6). السمات المميزة لهذا المرض هي تليف الأعضاء الداخلية بما في ذلك القلب 7، 8، 9، 10، 11.

طبيعة الدراسة طالبت تصميم الببتيد المثبطة. وقد تم اختيار نهج البرامج على النهج التقليدي باستخدام عرض فج. النهج البرنامج هو أسهل وأقل استهلاكا للوقت. يستخدم البنك بيانات RCSB لتحديد مواقع الربط المناسبة 12. لدراسة التفاعل بين الببتيد المصممة حديثا مع البروتين المؤتلف والتركيز على معايير ملزمة، تم استخدام تقنية تسمى biolayer التداخل. Biolayer التداخل هو techniq جهاز الاستشعار البيولوجي تستندرق الذي يحدد ملزمة تقارب وتكوين الجمعيات وتبرؤ باستخدام جهاز الاستشعار البيولوجي وعينة ملزمة. وجهاز الاستشعار البيولوجي يمكن أن يكون fluorescently، luminescently، وصفت radiometrically وcolorimetrically. ويستند هذا القياس على إضافة جماعية أو نضوب تشبه الجمعيات وتبرؤ 13 و 14. وكان الهدف من هذه الدراسة إلى فهم دور IRF5 في التهاب عضلة القلب وتليف. وكان الهدف هو التبصر في دور IRF5 في تطوير تليف الأنسجة وتصلب الجلد.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (البروتوكول: AUA # 1517). وقد أجريت جميع البحوث التي تنطوي على الفئران بما يتفق مع سياسة خدمات الصحة العمومية.

1. تصميم شرك الببتيد

  1. البحث عن هيكل 3D من IRF5 وقاعدة التصميم على ذلك. تصميم 17 مير، ووصف IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD)، حيث يتم استبدال اسبارتاتي (D) ل(S) سيرين لتقليد الفسفرة في IRF5 في 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). اقترح تحليل مجموعة 3D سلفهيدريل ومعرفة آلية IRF5 للتفعيل، أي سيرين الفسفرة، أن استراتيجية واحدة لاستهداف IRF5 كانت لتوليد الببتيد شرك. انظر الشكل 1. لتحديد أفضل منطقة في هيكل 3D، استخدام برنامج النمذجة الجزيئية لتصميم molecul صغيروفاق و الببتيدات 15.
    ملاحظة: خطوة حاسمة في هذه العملية هو توافر هيكل 3D من البروتين المستهدفة والمواقع المحتملة ملزمة. هيكل 3D من IRF5 يمثل بدقة dimerizes كيف IRF5 بعد الفسفرة. والاستعانة بمصادر خارجية استبدال اسبارتاتي لسيرين أو ثريونين. ويتم تصنيع الببتيد على حدة دون ربطها IRF5.
  2. تكرار الفوسفات المجال ببساطة عن طريق استبدال D لS. استنادا إلى تسلسل الأصلي (ELSWSADSIRLQISNPD، وجعل IRF5S الببتيد جديدة مع تسلسل الأحماض الأمينية من 2 ايه سي ELDWDADDIRLQIDNPD-نيو هامبشاير (IRF5D).

2. Biolayer التداخل (BLI)

ملاحظة: تم الاستعانة بمصادر خارجية وتنقية IRF5 المؤتلف. 16

  1. التسمية البيوتين IRF5 في نسبة المولي 1: 1 من البيوتين ليجند مع كاشف biotinylation دمج رابط سلسلة طويلة. سوف رابط سلسلة طويلة ضمان الدوري الاسباني أكثر نشاطا ومتجانسةسطح الثانية.
    1. إضافة 1 مل من 2 ملغ / مل IRF5 إلى 13 ميكرولتر من 20 ملي البيوتين كاشف أو زيادة الكميات إذا لزم الأمر. احتضان على الجليد لمدة 2 ساعة. بعد وضع العلامات، واستخدام عمود تحلية تدور لإزالة خليط التفاعل من البروتين المسمى.
  2. احتضان يجند المسمى البيوتين مع أجهزة الاستشعار لمدة 15 دقيقة. تجنب الإفراط في وضع العلامات وضبط نسبة 1: 1 الرحى. بعد وضع العلامات، واستخدام عمود تحلية تدور لإزالة خليط التفاعل من البروتين المسمى.
  3. احتضان البيوتين وصفت أجهزة الاستشعار IRF5 لمدة 10 دقيقة في تركيزات مختلفة من الببتيد IRF5 شرك. تم تحديد معدلات تكوين الجمعيات والتفكك كما هو موضح 10، 17، 18.

3. موت الخلايا المبرمج وانتشار فحوصات

  1. انتشار الفحص عبر bioreduction من نتروبلو
    1. إدارة IRF5D مخففة في برنامج تلفزيوني (1 ملغ /كغ / د، حقن حجم 20 ميكرولتر في 20 غ الماوس) تحت الجلد بإبرة 27 عيار بواسطة تقنية scruffing القياسية أو برنامج تلفزيوني وحدها لتصك / + وC57BL / 6J الفئران لمدة 21 يوما.
    2. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب.
    3. ليز قلوب مع العازلة البروتين تحلل تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و 0.5٪ NP-40، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 50 ملي ناف 10 وتحديد تركيز البروتين برادفورد فحص 19.
    4. معطف لوحات 96-جيدا مع C57BL / 6J مصفوفة القلب معزولة كما هو موضح في قسم 7. تمييع برنامج تلفزيوني علقت C57BL / 6J مصفوفة القلب إلى تركيز 20 ميكروغرام / مل وإضافة 30 ميكرولتر من C57BL / 6J القلب إلى كل بئر. السماح لها تسوية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الحاضنة.
    5. ثقافة خلايا الوريد السري الإنسان باستخدام 500 مل من البطانية القاعدية مالقانونين مع 0.4٪ مستخلص البقري الدماغ، 0.1٪ حمض الاسكوربيك، 0.1٪ الهيدروكورتيزون، 0.1٪ عامل نمو البشرة البشري، 2٪ مصل بقري جنيني و 0.1٪ أضاف جنتاميسين / الأمفوتريسين B إليها. ثقافة الخلايا على 96 لوحات جيدة في 5٪ CO 2 و 95٪ هواء الغرفة مع كثافة من 25000 خلية لكل جيدا. حفز مع زيادة تركيزات IRF5D بين 0-100 ميكروغرام / مل في وسائل الإعلام (وبلغ حجم التداول بين 0 و 50 ميكرولتر / مل).
    6. تحديد تكاثر الخلايا بعد ثلاثة أيام وتقييم الاختلافات في الامتصاصية على قارئ صفيحة. رد الفعل هو bioreduction من MTS نتروبلو المجمع. ويتم إنتاج NADPH أو NADH من الانزيمات نازعة في خلايا نشطة عملية الأيض.
    7. كما يتم تخزين نتروبلو مجمع MTS المجمدة في -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد المجمع ببطء على مدى ما يقرب من 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ماصة 20 ميكرولتر في كل بئر من 96 لوحة جيدا، وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة لذلك. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعات في humidified، 5٪ CO 2 غرفة.
    8. قراءة الامتصاصية عند طول موجي 490 نانومتر.
  2. موت الخلايا المبرمج فحص عن طريق النشاط كاسباس
    ملاحظة: انشاء التجريبية هو نفسه على النحو الوارد أعلاه 3.1.1 إلى 3.1.5.
    1. تحفيز الخلايا مع زيادة تركيزات IRF5D بين 0-100 ميكروغرام / مل في وسائل الإعلام.
    2. إضافة كشف الأخضر لالركيزة كاسباس 3/7 إلى ECS واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تقييم مضان على قارئ صفيحة ميكروسكوبية في وقت واحد مع الطول الموجي امتصاص / انبعاث 502/530 نانومتر. تشغيل تجارب في ثلاث نسخ.
      ملاحظة: عامل الفلورية الخضراء هو الببتيد حمض أميني أربعة بد أن صبغة ملزمة الحمض النووي. هذا كاشف يصبح الفلورسنت عندما المشقوق بعد كاسباس 3 و 7 التنشيط. يتم قياس هذه مضان. ميزة هي انخفاض في خطوات غسل.

4. تقييم IRF5 وICAM-1 التعبير في اسمعواتي

  1. إدارة IRF5D مخففة في برنامج تلفزيوني (1 ملغ / كغ / يوم، حقن حجم 20 ميكرولتر في 20 غ الماوس) تحت الجلد بإبرة 27 عيار بواسطة تقنية scruffing القياسية أو برنامج تلفزيوني وحدها لتصك / + وC57BL / 6J الفئران مرة واحدة في اليوم لمدة 21 يوما.
  2. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب.
  3. ليز قلوب مع العازلة البروتين تحلل تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و 0.5٪ NP-40، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 50 ملي ناف 10 وتحديد تركيز البروتين برادفورد فحص 19.
    1. إجراء طخة غربية على لست] من القلوب. تمييع عينات إلى 25 ميكروغرام البروتين الكلي وبلغ حجم التداول 40 ميكرولتر مع العازلة عينة Laemmli تحتوي على 5٪ المركابتويثانول. تشغيل العينات على 4-15٪ TGX هلام في 50 فولت لمدة 5 دقائق. زيادة الجهد إلى 100 فولت لمدة 1 ساعة حتى تدير الجبهة صبغ بها.
    2. وضع الجل في 1X العازلة نقل (25 ملي تريس، 190 ملي الجلايسين، 20٪ الميثانول، وضبط درجة الحموضة إلى 8.3 إذا لزم الأمر)، واحتضان ل10-15 دقيقة.
    3. تجميع ساندويتش نقل (الإسفنج، والتصفية، هلام، غشاء السليلوز، مرشح، الإسفنج). تأكد من عدم وجود فقاعات المحاصرين في بين. يجب أن يكون وصمة عار على الكاثود والجل على الأنود. نقل لمدة 1 ساعة في غرفة باردة في 100 مللي أمبير.
    4. في اليوم التالي، شطف وصمة عار ثم منع الخلفية في 5٪ الحليب الجاف الخالي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف وصمة عار مع تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على 5٪ توين ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. احتضان بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية باستخدام الأجسام المضادة الأولية لIRF5 أو ICAM-1. تمييع الأجسام المضادة في تريس مخزنة المالحة في التخفيف 1: 1000.
    6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في تريس مخزنة المالحة واحتضان وصمة عار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. عن الأجسام المضادة الثانوية، واستخدام الفجل البيروكسيداز مترافق حمار لمكافحة فأر الإيجG (1: 10000) والفجل البيروكسيديز حمار المضادة للماعز مفتش (1: 10000)، على التوالي.
    7. تطبيق التوهج إلى وصمة عار بعد مكونات الخلط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واحتضان لمدة 3 دقائق لluminesce عصابات الفائدة. فضح وصمة عار إلى فيلم الأشعة السينية. استخدام يماغيج لقياس كثافة. تطبيع قيم الكثافة إلى عصابات تحكم 10.

5. تقييم أرقام الخليوي التهابات بعد IRF5 تثبيط

  1. إدارة IRF5D مخففة في برنامج تلفزيوني (1 ملغ / كغ / د) تحت الجلد بإبرة 27 عيار بواسطة تقنية scruffing القياسية أو برنامج تلفزيوني وحدها لتصك / + وC57BL / 6J الفئران لمدة 21 يوما.
  2. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب. المفاجئة تجميد وتخزين قلوب رفعه حتى التحليل.
  3. جبل قلوب المجمدة على TISSأصحاب رق المناسبة لناظم البرد في الاستخدام. قطع 10 ميكرون أقسام المجمدة سميكة على ناظم البرد لالمناعية.
  4. إصلاح الأجزاء المجمدة مع 1٪ امتصاص العرق في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Permeabilize الأقسام مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    تحذير: لامتصاص العرق هو مادة مسرطنة للتنظيم ويجب التعامل معها بحذر.
  5. تخفيف المضادة للأرنب CD64، وهو الوحيدات / بلعم علامة 1: 200 في برنامج تلفزيوني. تنطبق على الأبواب الثابتة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة.
  7. تمييع لمكافحة الفئران NIMP، العدلات علامة الابتدائية 1: 200 في برنامج تلفزيوني. تنطبق على الأبواب الثابتة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
  9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب اليكسا 488 مترافق ومكافحة فأر اليكسا 488 مترافق 1: 200 في برنامج تلفزيوني.
  10. تطبيق المضادة للأرنب اليكسا 488 مترافق ومكافحة فأر اليكسا 488 الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى أقسام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لذلك. حجم الأجسام المضادة تختلف وفقا لحجم القسم. وينبغي أن يشمل المبلغ الذي قسم بسخاء. في معظم الحالات حجم ما بين 100 و 200 ميكرولتر.
  11. استخدام 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) باعتباره وصمة عار النووية في التخفيف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 ميكرولتر إلى 1 مل برنامج تلفزيوني واستخدام دابي في خطوة غسل الماضية. إضافة وسائط تصاعد مائي لزلة غطاء ووضعه على الشريحة.
  12. تحليل الأقسام fluorescently المسمى بواسطة المجهر متحد البؤر باستخدام الهدف النفط 40X. استخدام الإثارة الأطوال الموجية 488 وانبعاث موجات أكبر من 530 نانومتر لCD64 وNIMP. كان متحمس دابي مع 360 نانومتر، وتنبعث عند 460 نانومتر في اللون الأزرق. التمييز حيدات / الضامة والعدلات (ن = 10 صور في الضد من 3 الفئران مختلفة في كل مجموعة) عن طريق وضع العلامات على مختلف وعدها. التعبير عن البيانات وعدد الخلايا فرزها.

6. خلية توسع الأوعية تابع بعد IRF5 تثبيط

  1. تخدير C57BL / 6J السيطرة على الفئران وتصك / + الفئران مع وبدون علاج الببتيد مع الكيتامين (80-100 ملغ / كلغ) / زيلازين (10-12،5 ملغ / كلغ) الخليط. حقن خليط الكيتامين / زيلازين البريتونى. كبح الماوس يدويا.
    1. استخدام مقياس 25 أو إبرة أصغر. ادخال الإبرة في الربع السفلي الأيمن من البطن. سحب الغواص قبل الحقن لضمان أن الإبرة لا يدخل أحد الأوعية الدموية أو الأمعاء.
  2. مرة واحدة وقد وصلت إلى مستوى كاف من التخدير، وتأمين الماوس في موقف ضعيف، يمسح الفراء مع الكحول غارقة الشاش، واستخدام زوج من مقص فتح التجويف الصدري وإزالة القلب.
    ملاحظة: سوف استنزاف الموت ببطء الماوس وجعل تشريح أسهل عن طريق تخفيف الضغط في الأوعية الدموية مما يقلل النزيف عندما قطع الأوعية الدموية.
    1. فتح النقيب الجلدجا زوج من مقص، وقطع حتى من جانبي الصدر إلى عظم الفك مع الرعاية حتى لا تعكر صفو الأنسجة الكامنة نحو الجزء الأمامي من الفك.
    2. تشريح الشريان الوجهي عن طريق إزالة الأنسجة الناعمة المحيطة بها.
    3. تحذير: لا تجرح السفينة أو الساحبة على الشريان الوجهي مع الحفاظ على النسيج يتعرض استحم في المخزن اجتماعات الأطراف (2.0 ملي CaCl 2 · 2H 2 O، 0.02 ملي EDTA، 5.0 ملي الجلوكوز، 4.7 ملي بوكل، 1.17 ملي MgSO 4 · 7H 2 O، 3.0 اجتماعات الأطراف مم، 145 مم كلوريد الصوديوم، 1.2 ملي ناه 2 ص 4 · H 2 O، 2.0 ملي حمض البيروفيك) لمنع جفاف. أداء تحت التكبير تشريح ستيريو المجهر مجهر (التكبير من 3.5X إلى 45X) ومصدر ضوء الألياف البصرية.
  3. عزل الشريان الوجهي.
    1. فهم الأقرب الوجهية إلى التشعب الأول والبعيدة إلى حيث سيتم قطع الشريان. قطع الشريان من الشريان الأم، الشريان السباتي الخارجي. إزالة arterie الوجهيةالصورة من السيطرة على الفئران، تصك / + الفئران مع وبدون علاج IRF5D.
    2. في حين لا يزال يمسك الشريان في ملقط، وقطع فرعين نزوله الوجهية، والسماح للسفينة أن رفع بلطف بينما يمكن تحديد أي نوع من الأنسجة المحيطة المصقول، وقطعت.
    3. الاستمرار بهذه الطريقة حتى يتم الوصول إلى التشعب قطع كلا الشرايين ابنة لتحرير السفينة. ليست هناك حاجة لكبح السفن قبل قطع بسبب خففت الضغط في الأوعية الدموية من إزالة القلب. وضع السفينة في المخزن اجتماعات الأطراف في حين يتم تشريح الشريان الوجهي الآخرين ومعزولة.
    4. يقني؛ يدخل القنية السفن عن طريق ربط لهم على الماصات الزجاجية التي يبلغ قطرها محطة من 125-175 ميكرون. تهيئة تحميلها على الماصات الزجاجية وخزانات عازلة العازلة مع اجتماعات الأطراف.
      تنبيه: منع فقاعات الهواء من تشكيل في ماصات.
    5. ربط السفن على ماصات باستخدام الخيوط الجراحية في طب العيون.
  4. جبل غرف السفينة بناء على ميكر triocular مقلوبoscope مع مرفق كاميرا الفيديو. تشغيل الفيديو من خلال نظام قياس الفيديو الفرجار لفي قياسات الشاشة من السفن. 20
    1. تضغط عليهم في عملية من خطوتين. أولا، مع خزانات مملوءة اجتماعات الأطراف، على ارتفاع فوق سفينة تساوي الضغط 20 مم زئبق، يدويا فتح الصمامات والديوك في خطوط الخزان إلى السفينة. تفتيش السفينة بحثا عن علامات على تسرب حول العلاقات ونزولا على طول السفينة. ثانيا، رفع الخزانات إلى 60 مم زئبق وreinspect السفينة.
    2. مرة واحدة الضغط على 60 مم زئبقي، والسماح للسفن لتتوازن لمدة 30 دقيقة.
  5. من أجل تقييم توسع الأوعية ردا على أستيل كولين (10 -7 إلى 10 -4 م)، preconstrict السفينة إلى قطر 50-75٪ من الحد الأقصى قطرها باستخدام 1-3،0 × 10 -8 إلى 10 -7 M U46619. بعد السماح للسفينة لتحقيق الاستقرار لمدة 6 دقائق، إضافة أستيل إلى الحمام في خطوات مدة 2 دقيقة مثل أنتركيزات النهائي في الحمام هي 10 -7 و 10 -6، 10 -5 و 10 -4. قياس توسع الأوعية في المجموعات الثلاث.

7. عزل القلب خارج الخلية مصفوفة

  1. تخدير C57BL / 6J السيطرة على الفئران وتصك / + الفئران مع وبدون علاج الببتيد مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب.
  2. وضع قلوب إزالتها في كوب وإضافة 15 مل مفرط التوتر 1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS). تستنهض الهمم قلوب في حل SDS 1٪ لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة لتفريق الخلايا عن طريق إضافة شريط ضجة في حل SDS 1٪ ووضع الكأس على طبق من ضجة.
    تحذير: كن على علم بأن المصفوفة خارج الخلية سوف تتفكك إذا تركت فترة طويلة جدا في حل مفرط التوتر. على العكس من ذلك، إذا لم يتم تحريكها قلوب طويلة بما فيه الكفاية في حل مفرط التوتر، ثم سوف الخلايا غير صحيححل، وسوف يكون هناك حطام الخلايا المتبقية في الكأس.
  3. يغسل لمدة 30 دقيقة في 15 مل 0.5٪ تريتون X-100. ثم يغسل لمدة 15 دقيقة مع 15 مل من برنامج تلفزيوني. Decellularize كل قلب على حدة.
  4. الأداة الإضافية تجميد المصفوفة خارج الخلية في النيتروجين السائل وpowderize المصفوفة خارج الخلية القلب المجمدة مع هاون تبرد قبل ومدقة.
  5. جعل التعليق من المصفوفة المسحوق في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ المضادات الحيوية. حجم المضافة في معظم الحالات هو 300 ميكرولتر. يصوتن تعليق ل30 - 60 ق على الجليد على الإعداد عالية.
    ملاحظة: من المهم جدا أن العينة تبقي الباردة. كن على علم بأن تعليق غير لزجة جدا ويرجع ذلك إلى ارتفاع محتوى البروتين غليكان.
  6. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
    ملاحظة: تأكد من وجود مضادات حيوية ومضادات للفطريات في التعليق. البنسلين / الستربتوميسين هي الأكثر شيوعا والموصى بها.

8. تقييم إزفاء النووية من قبل Immunohistochemistراي

  1. لأطباق معطف والشرائح استخدام تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل من المصفوفة خارج الخلية القلبية في برنامج تلفزيوني. الماصة 500 ميكرولتر من محلول القلب خارج الخلية مصفوفة في صحن 100 مم للطلاء و 150 ميكرولتر من حل المصفوفة خارج الخلية النهائي على شريحة.
  2. تمنع IRF5 بإضافة IRF5D في تركيز 50 ميكروغرام / مل لمدة 24 ساعة على الفئران myocytes القلب حديثي الولادة في الثقافة. ترك السيطرة الثقافات العضلية دون علاج.
  3. تقييم الاتجار IRF5 من العصارة الخلوية إلى النواة باستخدام المناعي وتحليل المجهري متحد البؤر. التعرف على العلامات الأخضر لIRF5، وتحديد دابي وصمة عار الأزرق للنواة
  4. تطبيق الأجسام المضادة الأولية مكافحة IRF5. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية في التخفيف 1: 200 في برنامج تلفزيوني. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، واتبع مع ثلاث خطوات غسل 5-مين. والأجسام المضادة الثانوية الماعز اليكسا 488 المسمى مكافحة فأر مفتش الأضداد.
  5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1: 1000 دي lution في برنامج تلفزيوني. احتضان الضد الثانوية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تحقيق وصمة عار النووية مع دابي. تمييع دابي 1: 1000 في برنامج تلفزيوني. تغسل الشرائح ما مجموعه 3 مرات لمدة 5 دقائق وإضافة دابي إلى الخطوة غسل الثالثة والأخيرة.
  6. الاتجار التقاط باستخدام المجهر متحد البؤر وحدة قياس مضان في نوى والعصارة الخلوية كما سبق وصفها 10. التعرف على العلامات الأخضر لIRF5، وتحديد دابي وصمة عار الأزرق للنواة. الخلايا التي تظهر نوى الزرقاء مع وضع العلامات الأخضر في نفوسهم تحتوي على تنشيط IRF5، التي يتم الاتجار بهم من العصارة الخلوية إلى النواة. وجدت لصق البطاقات الخضراء عندما لم يتم تنشيط IRF5 في العصارة الخلوية.
  7. تحليل الخلايا fluorescently المسمى بواسطة المجهر متحد البؤر باستخدام الهدف النفط 40X. استخدام الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر، وانبعاث موجات أكبر من 530 نانومتر لIRF5. استخدام الطول الموجي الإثارة من 360 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات من 460 نانومتر لرؤية دابي.

الحمار = "jove_title"> 9. الإحصاء

  1. إجراء تحليل التباين (ANOVA) لاتخاذ تدابير المتكررة داخل وبين المجموعات. اتبع أنوفا مع تعديل بونفيروني للطلاب اختبار (ت). التعبير عن البيانات والخطأ المعياري للمتوسط.

النتائج

أظهرت النتائج أظهرت في الشكل 1 كيفية تصميم الببتيد. الرقم 1، أعلى اليسار، يظهر المنطقة (بين الأسهم الصفراء 2، والأحماض الأمينية (أأ) 425-436) في IRF5 الذي فسفرته من قبل عدد من تحركات. الرقم 1، الجزء العلوي الأيمن، يظهر البيضاوي ال?...

Discussion

وكان الهدف هو تصميم المانع IRF5 لتوضيح دور IRF5 على الالتهاب والتليف، وظيفة الأوعية الدموية في قلوب تصك / + الفئران. النتائج هي التي IRF5D لم لحث على الانتشار أو موت الخلايا المبرمج. وعلاوة على ذلك، تم تخفيض الالتهاب وظيفة الأوعية الدموية تحسنت. وتشير هذه البيانات إلى أن IRF5 ت...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grants HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) and HL-102836 (KAP) and Cimphoni Life Sciences (part of DW salary). The authors thank Meghann Sytsma for editing the manuscript.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 Triton X 100Sigma AldrichX100- 100ml
Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody Thermo FisherA11001
Bardford reagentThermo Fisher23200Pierce 
BiosensorsForte-BioMR18-0009
CD64 (H-250)Santa Cruz Biotechnologiessc-15364
CellEvent Caspase-3/7 SubstrateThermo Fisher/Life TechnologiesC10427
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kitPromegaG3580Promega
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo FisherD-13061:1,000 dilution in PBS
donkey anti rat Alexa 488Thermo FisherA-212081:1,000 dilution in PBS
ECL plusGE healthcare/AmershamRPN2133After a lot of trial and error we came back to this one
Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning softwareNikon
goat anti rabbit Alexa 488Thermo FisherA-110081:1,000 dilution in PBS
HRP  anti-goatSanta Cruz Biotechnologiessc-516086!:10,000 dilution in TBS
HRP donkey anti-mouseSanta Cruz Biotechnologiessc-23151:10,000 dilution in TBS
ICAM-1 antibodySanta Cruz Biotechnologiessc-15111:200 dilution in PBS
IRF5 antibody (H56)Santa Cruz Biotechnologiessc-98651
Micro plate reader Elx800Biotek
NIMP neutrophil markerSanta Cruz Biotechnologiessc-1338211:200 dilution in PBS
Octet REDForte Bioprotein-protein binding
Peptide design  Medit SA softwareRCSB.org
Recombinant IRF5 protein synthesisTopGene Technologiesprotein expression, synthesis service
sodium dodecyl phosphateSigma Aldrich436143detergent
KetaminePharmacySchedule III controlled substance, presciption required 
XylazineMedVet
3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED LightsAm ScopeSKU: SM-1TSX-L6W
Zeba Desalting ColumnsThermofisher2161515
Endothelial Basal Media EBM Bullet kitLonzaCC-3124kit contains growth supplemets
VIA-100K Boeckeler Instruments
4 - 15% TGX gelBio-Rad5671081
MedSuMo softwareMedit, Palaiseau, France
Laemmli BufferBioRad

References

  1. Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
  2. Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
  3. Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
  4. Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
  5. Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
  6. Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
  7. Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
  8. Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
  9. Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
  10. Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
  11. Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
  12. Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, D233-D237 (2005).
  13. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  14. Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
  15. Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
  16. Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
  17. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
  18. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  20. Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
  21. Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
  22. Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
  23. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  24. Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
  25. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  26. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  27. Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
  28. Roy, S., P, P., Mavragani, C. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. , 35 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121 IRF5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved