JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Abstract

الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) على وعود كبيرة للنمذجة المرض وعلاجات التجدد. ذكرنا فيما سبق استخدام Episomal المتجهات (EV) لتوليد iPSCs خالية من التكامل من الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PB الشركات المتعددة الجنسيات). ناقلات episomal المستخدمة هي البلازميدات الحمض النووي تدمج مع oriP وEBNA1 عناصر من فيروس ابشتاين بار (EB)، والتي تسمح للنسخ المتماثل وطويلة الأجل احتفاظه من البلازميدات في خلايا الثدييات، على التوالي. مع مزيد من التحسين، ويمكن الحصول على الآلاف من المستعمرات IPSC من 1 مل من الدم المحيطي. اثنين من العوامل الحاسمة لتحقيق كفاءة عالية برمجة هي: 1) استخدام 2A "انشقاق عن النفس" الببتيد لربط OCT4 وSOX2، وبالتالي تحقيق التعبير متساوي المولية للعاملين. 2) استخدام متجهين للتعبير عن MYC وKLF4 بشكل فردي. نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد خالية من التكامل الملكية الفكريةالمنبوذة من عينات الدم المحيطي الكبار. وiPSCs ولدت خالية من التكامل كما البلازميدات episomal المتبقية لا يمكن اكتشافها بعد خمسة مقاطع. وعلى الرغم من كفاءة إعادة برمجة هي مماثلة لتلك التي من سينداي فيروس (SV) ناقلات، البلازميدات EV هي إلى حد كبير أكثر اقتصادا من ناقلات SV المتاحة تجاريا. يحمل هذا النظام EV إعادة برمجة بأسعار معقولة المحتملين للتطبيقات السريرية في الطب التجديدي، ويقدم نهجا لإعادة برمجة مباشرة من الشركات المتعددة الجنسيات PB إلى الخلايا خالية من التكامل الجذعية الوسيطة، والخلايا الجذعية العصبية، وما إلى ذلك.

Introduction

بعد التعبير القسري لعدة عوامل النسخ (أي OCT4، SOX2، MYC وKLF4)، الخلايا الجسدية يمكن برمجتها لالناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، الذي عقد الوعد العظيم للتطبيقات في الطب التجديدي وخلية العلاج ببدائل 1-3. حتى الآن، وقد وضعت أساليب متنوعة لزيادة نسبة نجاح إعادة برمجة 4-7. يستخدم ناقلات فيروسية يسببها إعادة البرمجة على نطاق واسع لتوليد كفاءة iPSCs، لأن التكامل الفيروسي يؤدي إلى مستوى عال والتعبير مستقر من العوامل برمجة. ومع ذلك، والتكامل الدائمين في الحمض النووي ناقلات في جينوم الخلية قد تحفز الطفرات إقحامي 5. وبالإضافة إلى ذلك، تعطيل كافية من عوامل إعادة برمجة قد تزعج iPSCs التمايز 8. على هذا النحو، واستخدام iPSCs دون إدماج العوامل برمجة أمر لا بد منه، وخاصة للاستخدام في التطبيقات العلاج بالخلايا.

> Episomal المتجهات (المركبات الكهربائية) وتستخدم على نطاق واسع في توليد iPSCs خالية من التكامل. وEV الأكثر شيوعا هو البلازميد التي تحتوي على عنصرين أو الأصل من تكاثر الفيروس (oriP) وEB النووية مستضد 1 (EBNA1)، من فيروس ابشتاين بار (EB) 9. العنصر oriP يعزز تكرار البلازميد في خلايا الثدييات، بينما العنصر EBNA1 الحبال البلازميد الحمض النووي التي تحتوي على oriP على الحمض النووي الكروموسومات التي تسمح للتقسيم ويصبوغ أثناء انقسام الخلية المضيفة. بالمقارنة بنهج خالية من التكامل الأخرى، بما في ذلك سينداي فيروس (SV) وترنسفكأيشن الحمض النووي الريبي، المركبات الكهربائية تمتلك مزايا متعددة 5،6،10. كما DNA البلازميد، المركبات الكهربائية يمكن أن تنتج بسهولة وتعديلها في المنزل، مما يجعلها بأسعار معقولة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، إعادة برمجة مع EV هي عملية أقل كثيفة العمالة منذ ترنسفكأيشن واحد مع المركبات الكهربائية غير كافية لتوليد التوجيهية، في حين ضرورية لإعادة البرمجة ناجحة عدة تعداء الحمض النووي الريبي.

دوقد استخدمت الخلايا الليفية ermal في العديد من الدراسات برمجة. ومع ذلك، خزعة الجلد ليست فقط عملية الغازية ومؤلمة، ولكن أيضا وقتا طويلا لتوسيع الخلايا على كميات كافية لإعادة البرمجة. من قلق أكبر، وغالبا ما تتعرض خلايا الجلد من المانحين الكبار للإشعاع الأشعة فوق البنفسجية طويلة الأجل، مما قد يؤدي إلى حدوث طفرات المرتبطة الأورام، مما يحد من طلبات iPSCs المستمدة من الخلايا الليفية الجلد 11،12. مؤخرا، تم الإبلاغ عن أن خلايا الجلد البشري العادية تتراكم الطفرات الجسدية وجينات السرطان متعددة، بما في ذلك أكثر من الدوافع الرئيسية لالجلدية سرطان الخلايا الحرشفية، تحت اختيار إيجابية قوية (13).

وعلى النقيض من الخلايا الليفية الجلد والدم المحيطي (PB) الخلايا هي مصدر الأفضل الخلايا لإعادة برمجتها ل1) خلايا الدم يمكن الحصول عليها بسهولة من خلال عملية التنظيرية، 2) خلايا الدم الطرفية هي سلالة من الخلايا الجذعية المكونة للدمالمقيمين في نخاع العظام، وبالتالي حمايتها من الأشعة الضارة. الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PB الشركات المتعددة الجنسيات) يمكن جمعها في ساعة واحدة من طبقة معطف الشهباء بعد الطرد المركزي التدرج بسيط باستخدام Ficoll-Hypaque (1.077 غرام / مليلتر). وتتكون الشركات المتعددة الجنسيات PB التي تم الحصول عليها من اللمفاويات، وحيدات وعدد قليل من الخلايا المكونة للدم السلف (HPCS) 14. على الرغم من أن الخلايا اللمفية تي الإنسان هي واحدة من أنواع الخلايا الرئيسية في الجريدة الرسمية، ناضجة تحتوي على خلايا T إعادة ترتيب الخلية مستقبلات T (TCR) الجينات وتفتقر إلى الجينوم سليمة مما يحد من قدرتها على التطبيقات 15،16. ومع ذلك، قد يكون تجديد خلايا T عبر الجيل IPSC التطبيقات المحتملة في همي مستضد مستقبلات (CAR) علاج خلايا T 17-19. في المقابل، HPCS لها الجينوم سليمة وغير قابل للبرمجة بسهولة. على الرغم من أن فقط 0،01-،1٪ الخلايا في الدورة الدموية الطرفية هي HPCS، وهذه الخلايا يمكن توسيع فيفو السابقين في المتوسط محمر التي تفضل انتشار erythrالخلايا الاولية إمكانية احتواء 14.

في دراستنا السابقة، استخدمنا عامل بي سي إل-XL بالإضافة إلى العوامل ياماناكا (OCT4، SOX2، MYC وKLF4)، مما أدى إلى زيادة 10X في الجريدة الرسمية برمجة الكفاءه 20. بي سي إل-XL، المعروف أيضا باسم BCL2L1، هو المانع من امكانات موت الخلايا، عن طريق تثبيط تفعيل caspases 21،22. ولكن، بي سي إل-XL قد تلعب أيضا دورا هاما في الحفاظ على تعدد القدرات 21،22. في الآونة الأخيرة، لدينا المزيد الأمثل لدينا نظام EV إعادة برمجة بالإعراب بشكل منفصل MYC وKLF4 مع متجهين، الأمر الذي يؤدي إلى زيادة 100X تقريبا في كفاءة إعادة برمجة 23. باستخدام هذا الأسلوب، وكفاءة برمجة، يحددها عدد مستعمرة مقسوما بدءا عدد الخلايا في ترنسفكأيشن، هو 0،2-0،5٪ من المتبرعين الأصحاء. على النحو التالي، ونحن تصف الإجراء التجريبي التفصيلي لتوليد iPSCs خالية من التكامل من الجريدة الرسمية.

Protocol

تم الحصول على جميع عينات PB الإنسان من المانحين الكبار مجهولة من دون تحديد المعلومات المتاحة من مركز الدم تيانجين مع موافقة لجنة أخلاقيات البحوث المحلية.

إعداد البلازميد 1. إندو خالية

  1. استخدام البلازميد تنقية ماكسي كيت التجارية لاستخراج ناقلات episomal من كولاي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. للخطوة النهائية العازلة TE البديل مع الماء المعقم الخالي من الذيفان الداخلي بحل بيليه الحمض النووي.
  2. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام تجاري للأشعة فوق البنفسجية / فيس معمل. تركيز عادة ما يكون أكبر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر، مع A260 / A280 و A260 نسب / A230 أكبر من 1.8 و 2.0 على التوالي.

2. وسائل الإعلام الثقافة

  1. إعداد المتوسطة محمر: الجذعية المكونة للدم التوسع خلية متوسطة تستكمل مع 100 نانوغرام / مل الجذعية البشرية خلية عامل (SCF)، و 10 نانوغرام / مل انترلوكين 3 (IL3)، 2 U / مل إريثروبويتين (Eعامل 1 ف ب)، 20 نانوغرام / مل النمو الأنسولين (IGF1)، 1 ميكرومتر ديكساميثازون و 0.2 ملم 1-thioglycerol. تصفية تعقيم مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون. ويمكن تخزين المتوسطة محمر عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. إعداد IPSC المتوسطة: المتوسطة DMEM / F12 (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة / المغذيات خليط F-12) تستكمل مع 1X L-الجلوتامين، 1X البنسلين / الستربتومايسين، 1X غير الضرورية الأحماض الأمينية الحل، 50 نانوغرام / مل الخلايا الليفية عامل النمو 2 (FGF2 )، ملحق 1X الانسولين ترانسفيرين-السيلينايت (ITS)، و 50 ملغ / مل حامض الاسكوربيك. تصفية تعقيم مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون. ويمكن تخزين IPSC المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. إعداد MEF المتوسطة: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM؛ ارتفاع نسبة الجلوكوز) تستكمل مع 1X البنسلين / الستربتومايسين و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). تصفية تعقيم مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون. متوسطة MEF يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد أو حديثا إضافة 1X L-الجلوتامين قبل الاستخدام.
  4. Prepare IPSC متوسطة الحفظ بالتبريد (2X): ذوب 5 غرام من مد طرهالوز في 30 مل من الماء المعقم في 37 ° C حمام الماء. تحقيق درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية ثم قم بإضافة 10 مل من FBS و 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تصفية تعقيم مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر 24.

3. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة (PB الشركات المتعددة الجنسيات)

  1. الجمع بين 10 مل عينة PB جديدة و 10 مل عازلة برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل وتخلط جيدا. جلب برنامج تلفزيوني لRT أو 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    ملاحظة: حوالي 1-3 × 10 6 شركات متعددة الجنسيات (الطازجة أو cryopreserved) يمكن الحصول عليها من 1 مل من PB. بعد 6 د للثقافة، ونتوقع أن يكون 0،5-1 × 10 6 مجموع الخلايا بسبب موت خلايا ناضجة خلال الثقافة. حوالي 1 × 10 7 خلايا يمكن الحصول عليها من 10 مل من PB جديدة.
  2. إضافة 10 مل Ficoll إلى أسفل الأنبوب باستخدام حقنة 10 مل تعلق على إبرة طويلة. هذا المواليةوينبغي أن يتم سيس ببطء للتأكد من أن طبقة Ficoll لا يمتزج مع PB.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة بمعدل تسارع وتباطؤ منخفضة. بعد الطرد المركزي، والشركات المتعددة الجنسيات PB هي في الطبقة البيضاء (الشهباء معطف) الواقعة بين البلازما PB وFicoll.
  4. ببطء نضح ~ 10 مل PB البلازما دون إزعاج طبقة معطف الشهباء. حصاد بعناية الطبقة البيضاء باستخدام ماصة 1 مل إلى 50 مل أنبوب جديد. فإن الحجم الكلي للخلايا التي تم جمعها من الطبقة البيضاء ما بين 3-6 مل.
  5. إضافة برنامج تلفزيوني لتبرزي حجم الإجمالي إلى 30 مل وتخلط جيدا مع ماصة 10 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. إزالة طاف و resuspend بيليه الخلية في 20 مل الثقافة المتوسطة (أي Iscove في التعديل المتوسطة Dulbecco و، IMDM) وتخلط جيدا. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الغالبية العظمى من الصفائح الدموية.
  7. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 1 - 2 مل IMDM. ويمكن استخدام الخلايا وأو ثقافة فورية أو المجمدة إلى أسفل لاستخدامها لاحقا. لحفظ البرودة، إضافة مبلغ مساو من المتوسط ​​الحفظ بالتبريد. الخلايا قسامة في cryovials (0،5-1 مل في القارورة) وcryovials نقل إلى -80 درجة مئوية الثلاجة فورا. قد يتم تخزين الشركات المتعددة الجنسيات PB في الفريزر -80 درجة مئوية لعدة أسابيع أو نقلها إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: عند ذوبان الخلايا المجمدة، وعلى الرغم من موقعنا متوسطة الحفظ بالتبريد قد تحافظ على بقاء الخلية، قد يقلل من عدد الخلايا بسبب موت الخلايا أثناء عملية الذوبان. فمن المستحسن أن 1-10 × 10 7 خلايا ستجمد في كل قارورة.

4. التوسع في الشركات المتعددة الجنسيات PB في محمر المتوسطة

  1. إعداد 5 مل المتوسطة IMDM في أنبوب 15 مل. ذوبان الجليد بسرعة الشركات المتعددة الجنسيات PB المجمدة في 37 ° C حمام الماء ثم نقلها إلى أنبوب مع المتوسط ​​IMDM.
    ملاحظة: طول الوقت في حمام مائي يعتمد على حجم الخلايا cryopreserved وش cryovialالحوار الاقتصادي الاستراتيجي. عادة، فإن الخلايا المجمدة ذوبان الجليد في 1 دقيقة.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5-10 دقائق. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في المتوسط ​​محمر. إضافة 10 ميكرولتر حل التريبان الأزرق إلى تعليق خلية 10 ميكرولتر وتخلط جيدا. التريبان الأزرق بقع الخلايا الميتة داخل 1-3 دقيقة. عد الخلايا تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات.
  3. الشركات المتعددة الجنسيات ثقافة PB في الثقافة غير الأنسجة (غير TC) معاملة لوحة 6 جيدا مع 2 مل المتوسطة لكل بئر، في مناطق ذات كثافة خلية من ~ 5 × 10 6 خلية / مل، عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
  4. إضافة 1 مل محمر الطازجة المتوسطة مباشرة إلى كل بئر من دون تغيير المتوسطة في د 3 و 5.
  5. في د ​​6، حصاد الشركات المتعددة الجنسيات PB لnucleofection.

5. PB MNC Nucleofection وإعادة برمجة

  1. قبل يوم واحد nucleofection، قبل معطف TC المعاملة 6 لوحات بشكل جيد مع الجيلاتين 0.1٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ذوبان المعطل الفئران الجنينية بالاليافانفجار (MEF) الخلايا المغذية في 37 ° C حمام الماء وعلى الفور نقلها إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من المتوسط ​​MEF.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. إزالة الجيلاتين من لوحة 6 جيدا، resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​MEF، ونقلها إلى الجيلاتين قبل المعالجة لوحة 6 جيدا. في كل بئر، والبذور 2-4 × 10 5 خلايا MEF المعطل علقت في 2 مل MEF المتوسطة.
  3. ثقافة الخلايا المغذية MEF عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
  4. في يوم nucleofection، نضح في والمتوسطة MEF واستبدالها مع 1 مل محمر المتوسطة. قبل تتوازن لوحة الثقافة ل10-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
  5. إضافة 2 ميكروغرام PEV-OCT4-2A-SOX2، 1 ميكروغرام PEV-MYC، 1 ميكروغرام PEV-KLF4، و 0.5 ميكروغرام PEV-بي سي إل-XL في أنبوب 1.5 مل العقيمة إيبندورف. تسخين أنبوب عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لمنع التلوث، ويبرد لRT. إضافة57 ميكرولتر nucleofection العازلة و 13 ملحق ميكرولتر.
  6. الحصاد 2 × 10 6 مثقف الشركات المتعددة الجنسيات PB إلى أنبوب 5 مل بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 7 دقائق. إزالة طاف وإضافة البلازميد وnucleofection مزيج عازلة لبيليه الخلية. مزيج جيد من قبل عبها الأنبوب مع إصبعك.
    ملاحظة: ما يصل الى 2 × 10 5 خلايا يمكن أن تستخدم لnucleofection، ولكن ينبغي يتوقعون انخفاض كفاءة إعادة برمجة كذلك.
  7. نقل الحمض النووي وتعليق خلية لكفيت المنصوص عليها في عدة وسقف كفيت. حدد برنامج U-008 على الجهاز nucleofection. إدراج كفيت في حامل واضغط موافق لتطبيق برنامج U-008.
  8. خذ كفيت خارج حامل، إضافة 0.5 - استعد قبل 1 مل المتوسطة محمر في كل كفيت، ونقل الخلايا إلى لوحة MEF معايرتها قبل على الفور. ويرجع ذلك إلى كفاءة إعادة برمجة عالية وتباين المانحة وزرع البذور أرقام مختلفة من الخلايا تتراوح 1-10 × 10 5 خلايا صإيه جيدا وتشجيع للغاية.
  9. نقل لوحة لغرفة نقص الأكسجة، ومسح الغرفة مع غاز مختلط يتكون من 92٪ N 2، 5٪ CO 2 و 3٪ O 2، 1 - 2 دقيقة بمعدل 20 لتر / دقيقة. بعد اغلاق غرفة والثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  10. في D 2 بعد nucleofection، إضافة 2 مل IPSC المتوسطة مباشرة إلى كل بئر.
  11. في D 4 بعد nucleofection، وإزالة 3 مل من المتوسط ​​وإضافة 2 مل المتوسطة IPSC جديدة. في D 4 بعد nucleofection، سيكون قد تعلق معظم الخلايا الحية إلى الطبقة المغذية.
  12. بعد D 6 بعد nucleofection، تغيير المتوسط ​​كل د 2 من خلال ترك 500 ميكرولتر قضى المتوسطة وإضافة 2 مل المتوسطة E8 جديدة تستكمل مع 0.25 ملي الصوديوم الزبدات حتى D 14-18.
    ويمكن إضافة إضافية الخلايا المغذية في الآبار ثقافة كلما مشيرا إلى أن الخلايا المغذية تم فصل: ملاحظة. بعد ذوبان MEFS (انظر 5.1 و 5.2)، resuspend الكرية خلية في حجم صغير من E8 المتوسطة (أي ~ 0.2 مل لجانب واحد من لوحة 6 جيدا) ثم قم بإضافة MEFS في آبار الثقافة. ما يقرب من 2٪ FBS ويمكن أن يضاف لزيادة مرفق الخلية. بدلا من ذلك، المتوسطة MEF مكيفة يمكن أن تستخدم أيضا، لكنه أكثر شاقة.

6. توسيع iPSCs

ملاحظة: في معظم الحالات، تظهر أعداد كبيرة من المستعمرات التوجيهية في D 8-10 آخر nucleofection. بعد D 14، المستعمرات IPSC كبيرة وعادة ما تكون جاهزة للقطف.

  1. قبل اختيار المستعمرات، إضافة 500 ميكرولتر E8 المتوسطة تستكمل مع مثبط ROCK، Y27632 (10 ميكرون)، في بئر واحدة من تغذية أو Matrigel المغلفة لوحة 24 أيضا. استخدام 10 أو 20 ميكرولتر ماصة الى نقطة الصفر واختيار المستعمرات تحت المجهر. نقل قطع من كل مستعمرة إلى الآبار التي تحتوي على مستنبت.
    ملاحظة: إن تركيز Matrigel يختلف من دفعة واحدة إلى أخرى. عادة، ونحن نستخدم 1: 100 التخفيف من Matrigel.
    1. من أجل تجنب انتقال التلوث، واختيارالمستعمرات التي تكون كبيرة ويفصل جيدا من الآخرين. iPSCs الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
      ملاحظة: يجب أن يكون لاحظ أن السكان التوجيهية قد تكون بولكلونل بسبب هجرة الخلايا عندما تكون هناك عشرات أو مئات من المستعمرات في كل بئر من لوحة 6 جيدا.
  2. لا تغيير المتوسطة للد 2 الأولى. ROCK المانع يمكن أن تعزز بقاء مستعمرات صغيرة 25.
  3. من D 2 فصاعدا، تغيير المتوسط ​​كل يوم عن طريق إزالة المتوسطة المستهلك واضاف المتوسطة E8 500 ميكرولتر جديدة في كل بئر.
  4. وبعد حوالي 1 أسبوع، عندما المستعمرات هي كبيرة بما فيه الكفاية، وإزالة المتوسطة وعلاج الخلايا مع 300 ميكرولتر حل الخلية المفرزة (0.5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني) عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقيقة. إزالة حل الخلية المفرزة وإضافة المتوسطة E8 تحتوي على مثبط ROCK (10 ميكرومتر) تعليق iPSCs. لا تتحلل المستعمرات إلى الخلايا واحد، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا المفرط. كتل الخلية مع 5-50 خليةالصورة هي مناسبة لIPSC مرور.
  5. نقل 50-100٪ من خلية إلى تعليق كل بئر من على بعد 6 جيدا لوحة 12- أو التي تم المكسوة مسبقا والمحمولة مع مغذيات أو Matrigel.
  6. للثقافة على المدى الطويل في لوحات Matrigel المغلفة (انظر الملاحظة في 6.1)، تغيير المتوسط ​​كل يوم. عندما يصل confluency خلية 40 - 60٪، وعلاج الخلايا مع 1 مل من محلول خلية مفرزة (0.5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني) عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 3 دقائق. عندما تبدأ المستعمرات لعقص، وإزالة حل الخلية المفرزة وإضافة E8 المتوسط ​​تحتوي على مثبط ROCK (10 ميكرومتر) تعليق iPSCs. الخلايا مع مرور عامل تقسيم 4 - 8. ينبغي أن يضاف المانع ROCK عند الركض الخلايا لزيادة البقاء على قيد الحياة، وإزالتها في وقت لاحق 1 د لمنع التمييز.
  7. لتجميد أسفل iPSCs، وعلاج الخلايا مع حل الخلية المفرزة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. عندما تبدأ المستعمرات التوجيهية لعقص، ونضح المخزن المؤقت وإضافة 0،5-1 مل E8 المتوسطة.
    8. <لى> إضافة حجم مساو من المتوسط ​​الحفظ بالتبريد إلى تعليق الخلية وتخلط جيدا. المجمدة iPSCs يمكن تخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية لعدة أسابيع أو في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

7. اختيار iPSCs دون المتبقية Episomal البلازميدات

  1. بعد مرور 5، iPSCs الحصاد واستخراج الحمض النووي الجيني.
    ملاحظة: عادة بعد 5 مقاطع من الثقافة، البلازميدات episomal المتبقية لا يمكن اكتشافها. وهكذا، وكلها تقريبا من المستعمرات التوجيهية في الممرات فوق 5 (أي مرور 10) تفتقر البلازميدات episomal المتبقية.
  2. استخدام الحمض النووي الجيني من الشركات المتعددة الجنسيات PB untransfected كعنصر تحكم السلبية. إضافة 1.6 خريج PEV-OCT4-2A-SOX2 البلازميد إلى 1 ميكروغرام الحمض النووي السيطرة السلبي لتقليد الخلايا مع نسخة واحدة من PEV البلازميد لكل خلية.
  3. إضافة 9 ميكرولتر PCR الصف المياه بما في ذلك 100 نانوغرام الحمض النووي الجيني و 1 ميكرولتر الاشعال محددة (10 ميكرومتر كل من الأمام وعكس الاشعال) إلى 10 ميكرولتر عالية الدقة PCR ميكس ماجستير. تطبيع صباحاount من الحمض النووي عن طريق GAPDH. استخدام البادئات التالية لPCR: EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT، EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG، WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT، WPRE-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT، GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC، GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC.
  4. احتضان خليط التفاعل في 98 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. تليها 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بعد 30 دورات، تمديد رد الفعل عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تحميل 5 منتجات ميكرولتر PCR في كل بئر من هلام الاغاروز 1٪. تشغيل هلام ل20 - 30 دقيقة في 100 خامسا اختيار الحيوانات المستنسخة IPSC مع العصابات لا يمكن اكتشافها عن EBNA1 وWPRE لمزيد من الثقافة وتحليل المصب.

8. التدفق الخلوي

  1. حصاد iPSCs بمعاملتها مع Accutase عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة للحصول على تعليق خلية واحدة. إضافة 1 ميكرولتر PE-مترافق مكافحة TRA-1-60 أو eFluor 570 مترافق مكافحة SSEA4 أو الأجسام المضادة إسوية النمط إلى 100 ميكرولتر من تعليق خلية (1-5 × 10 5 خلايا) في 5 مل أنابيب. احتضان الأنابيب في مكان مظلم في RT لمدة 20 دقيقة.
  2. بعد تلطيخ لمدة 20 دقيقة في RT، إضافة 2 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني لتحليل مضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) باستخدام التدفق الخلوي محلل الخلية. 23،26

9. متحد البؤر التصوير

  1. iPSCs البذور في الشرائح غرفة Matrigel المغلفة.
  2. بعد 3-4 د الثقافة، وإزالة المتوسطة النمو وإصلاح مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في RT لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: PFA غير سامة وضارة.
  3. علاج الخلايا مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (PBS-T) في RT لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  4. منع الخلايا مع عازلة تمنع (مصل الماعز 5٪ في برنامج تلفزيوني، والخامس: V) في RT لمدة 1 ساعة.
  5. خلال خطوة حجب، يخفف من الأجسام المضادة الأولية (100X) في عرقلة العازلة.
    ملاحظة: يتم سرد المعلومات الأجسام المضادة في جدول المواد / المعدات.
  6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة المخفف في 4 درجات CO / N.
  7. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني-T لمدة 15 دقيقة، تليها مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
  8. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية-fluorophore مترافق المخفف في RT لمدة 2 ساعة.
  9. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني-T لمدة 15 دقيقة، تليها مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
  10. وصمة عار على نواة مع دابي (1 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني على RT لمدة 10 دقيقة.
  11. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
  12. التقاط الصور مع المجهر متحد البؤر. 23،27

10. مسخي الفحص

حصاد 1 × 10 6 iPSCs مع حل الخلية المفرزة (0.5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني) والخلايا resuspend في 200 ميكرولتر DMEM / F12 المخفف (1: 1) Matrigel.

  1. تحت الجلد حقن الخلايا في الكفل الخلفي من الفئران العوز المناعي NOD / SCID.
  2. في 8-12 أسبوع بعد حقن التوجيهية، تشريح وتحديد مسخي المبيض في 10٪ من الفورمالين. 28
  3. بعد microsectioning وتلطيخ مع هيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، تحليل العينات. 29

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا الحصول على مئات المستعمرات من 1 × 10 5 nucleofected PB الشركات المتعددة الجنسيات (الشكلان 1A و 1B). كفاءة إعادة برمجة حوالي 0،2-0،5٪ والمستعمرات تعبر عن علامات تعدد القدرات (أرقام 1C و1D). iPSC...

Discussion

الحصول على عينات الدم من المتبرعين الأصحاء أو المرضى غير مريحة وموسع، مما يجعلها مصدر خلية جذابة للبحوث الأساسية والعلاج بالخلايا السريري. هنا وصفناها بروتوكول لتوليد كفاءة عالية من iPSCs خالية من التكامل من عينات الدم الطرفية. هذا النهج استنساخه وبأسعار معقولة ينبغي...

Disclosures

The authors have no competing or conflicting interests to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Hematopoietic Stem Cell Expansion MediumSigmaS0192Store at 4 °C
Human Stem Cell Factor (SCF)Peprotech300-07Store at -20 or -80 °C
Interleukin-3 (IL-3)PeprotechAF-200-03Store at -20 or -80 °C
Erythropoietin (EPO)Peprotech100-64Store at -20 or -80 °C
Insulin Growth Factor-1 (IGF-1)Peprotech100-11Store at -20 or -80 °C
DexamethasoneSigmaD4902Store at -20 or -80 °C
1-thioglycerol (MTG)SigmaM6145Store at -20 or -80 °C
DMEM/F12 mediumGibco112660-012Store at 4 °C
L-glutamine (100x)Gibco25030-081Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (100x)Gibco15140-122Store at -20 °C
Non-essential Amino Acids solution (100x)Gibco11140-050Store at 4 °C
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)Peprotech100-18BStore at -20 or -80 °C
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS, 100x)Gibco41400-045Store at 4 °C
Ascorbic acidSigma49752Store at -20 °C
DMEM (high glucose) mediumThermoSH30243.01BStore at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSV30087.01Store at -20 °C
FicollGE Healthcare, SIGMA17-5442-02Store at RT
TrehaloseSigmaT9531Store at 4 °C
Dimethylsulfoxide (DMSO)SigmaD2650Store at RT, protect from light
Endofree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362Store at RT
IMDMGibco21056-023Store at 4 °C
Human CD34+ Cell Nucleofection KitLonzaVPA-1003Store at RT, nucleofection buffer and supplement should be stored at 4 °C
Sodium ButyrateSigmaB5887Store at -20 or -80 °C
ROCK inhibitor - Y27632STEMGENT04-0012-10Store at -20 °C
Essential 8 basal medium (E8)GibcoA15169-01Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80 °C
MatrigelBD354277Store at -20 or -80 °C
2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye)TransGen BiotechAS111Store at -20 °C
Cell detachment solutionSTEMGENT01-0006Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single-cell suspension
DAPISigmaD9542-1MGStore at 4 or -20 °C
Anti-Nanog AF488BD560791Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used
Anti-OCT4abcamab19857Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used
AF488 donkey anti-mouse IgGInvitrogenA21202Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence,  dilute 1/500 when used
PE anti-human TRA-1-60-R antibodyBiolegend330610Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4eBioscience41-8843Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Isotype antibodyeBioscience11-4011Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Alkaline Phosphatase Detection KitSiDanSai1102-100Store at 4 °C
Genomic DNA Extraction KitTIANGENDP304-02Store at RT
Trypan Blue solutionSigmaT8154Store at RT
Flow cytometry cell analyzerBDLSRII
Spinning Disk Confocal microscope (SDC)PerkinElmerUltraVIEW VOXfor confocal imaging
Nucleofection deviceLonzaNucleofector 2bfor the nucleofection of PB MNC
ImageQuant LAS-4010GEto take photos of AP staining in bulk

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  4. Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
  5. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).
  7. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
  8. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
  9. Dorigo, O., et al. Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells. J Virol. 78, 6556-6566 (2004).
  10. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
  11. Harms, P. W., et al. Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation. Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).
  12. Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
  13. Martincorena, I., et al. Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin. Science. 348, 880-886 (2015).
  14. Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).
  15. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  16. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  17. Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. , (2015).
  18. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
  19. Gill, S., June, C. H. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).
  20. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8, e64496 (2013).
  21. Li, Y., et al. The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation. Nat Commun. 4, 2174 (2013).
  22. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  23. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).
  24. Zhang, X. B., et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion. 43, 265-272 (2003).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. , (2010).
  27. Castiel, A., et al. Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells. J Vis Exp. , e50568 (2013).
  28. Peterson, S. E., et al. Teratoma generation in the testis capsule. J Vis Exp. , e3177 (2011).
  29. Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation. J Vis Exp. , (2010).
  30. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. , (2016).
  31. Lo, C. A., et al. Quantification of Protein Levels in Single Living Cells. Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).
  32. Liu, S. P., et al. An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).
  33. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 13, 446-452 (2016).
  34. Chou, B. K., et al. A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach. Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).
  35. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 4, 3594 (2014).
  36. Howden, S. E., et al. Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts. Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).
  37. Meng, X., et al. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor. Cell research. 23, 658-672 (2013).
  38. Liao, W., et al. Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4. Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119 PB MNC HPCS episomal iPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved