JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Abstract

תאי גזע מושרים (iPSCs) מחזיקים הבטחה גדולה עבור מודלי מחלה וטיפולים רגנרטיבית. אנחנו שדווח בעבר השימוש וקטורים Episomal (EV) כדי ליצור iPSCs אינטגרציה נטולת מתאי דם היקפיים mononuclear (MNCs PB). הווקטורים episomal בהם נעשה שימוש הם פלסמידים DNA משולב עם אלמנטים oriP ו EBNA1 מן נגיף אפשטיין-באר (EB), המאפשרים retainment לטווח ארוך שכפול של פלסמידים בתאי יונקים, בהתאמה. עם אופטימיזציה נוספת, אלף מושבות iPSC ניתן להשיג 1 מיליליטר של דם היקפי. שני גורמים קריטיים להשגת יעילות תכנות מחדש גבוה הם: 1) השימוש של 2A "עצמי מחשוף" פפטיד לקשר Oct4 ו Sox2, ובכך להשיג ביטוי equimolar של שני הגורמים; 2) שימוש שני וקטורים להביע MYC ו KLF4 בנפרד. כאן אנו מתארים צעד-אחר-צעד פרוטוקול להפקת ה- IP אינטגרציה נטולתגיל מדגים דם היקפי מבוגר. IPSCs שנוצר הם אינטגרציה נטולת כמו פלסמידים episomal שיורית הם לגילוי לאחר חמישה קטעים. למרות היעילות תכנות מחדש דומה לזו של וירוס סנדאי (SV) וקטורים, פלסמידים EV הם הרבה יותר חסכוני מאשר וקטורים SV זמינים מסחרית. מערכת תכנות מחדש EV סביר זה טומן בחובו פוטנציאל ליישומים קליניים ברפואה רגנרטיבית ומספקת גישה עבור תכנות מחדש הישיר של MNCs PB לתאי גזע mesenchymal ללא אינטגרציה, תאי גזע עצביים, וכו.

Introduction

לאחר ביטוי בכפייה של גורמי שעתוק כמה (כלומר Oct4, Sox2, MYC ו KLF4), תאים סומטיים ניתן לתכנות מחדש לתאי גזע מושרים (iPSCs), המחזיקות הבטחה גדולה עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית והחלפת התא טיפול 1-3. נכון להיום, שיטות מגוונות פותחו כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של תכנות מחדש 4-7. וקטורים המושרים ויראלי תכנות מחדש נעשה שימוש נרחב עבור דור יעיל של iPSCs, כי שילוב ויראלי מוביל ברמה גבוהה, ביטוי היציב של גורמי תכנות מחדש. עם זאת, שילוב קבוע של ה- DNA וקטור לתוך הגנום התא עלול לגרום mutagenesis insertional 5. בנוסף, איון מספיק גורמי תכנות מחדש עלול להפריע iPSCs בידול 8. ככזה, השימוש iPSCs ללא שילוב של גורמי תכנות מחדש הוא הכרחי, במיוחד לשימוש ביישומי טיפול בתא.

> Episomal וקטורים (EVS) נמצאים בשימוש נרחב דור iPSCs אינטגרציה נטולת. הערך הגלום הנפוץ ביותר הוא פלסמיד המכיל שני אלמנטים, מקורו של שכפול נגיפי (oriP) ו EB גרעיני Antigen 1 (EBNA1), מן אפשטיין-באר (EB) וירוס 9. מרכיב oriP מקדם שכפול פלסמיד בתאי יונקים, בעוד אלמנט EBNA1 רצועות ה- DNA פלסמיד המכיל oriP ל- DNA כרומוזומלי המאפשר החלוק של episome במהלך חלוקת התא המארח. לשם השוואה לגישות אינטגרציה נטולת אחרים, כולל וירוס סנדאי (SV) ו transfection RNA, EVS להחזיק 5,6,10 יתרונות מרובים. כמו DNA פלסמיד, EVS ניתן לייצר בקלות שונה בבית, מה שהופך אותם מאוד יקרים. בנוסף, תכנות מחדש עם EV הוא תהליך שדורש פחות מאז transfection יחיד עם מכוניות חשמליות מספיק עבור דור iPSC, ואילו transfections RNA כמה נחוץ תכנות מחדש מוצלח.

Dפיברובלסטים ermal שימשו במחקרים תכנות מחדש רבים. עם זאת, ביופסיה של העור הוא לא רק תהליך פולשני וכואב, אלא גם זמן רב להרחבת תאים בכמות מספקת לתכנות מחדש. דאגה גדולה יותר, תאי עור של תורמים מבוגרים לעתים קרובות נחשפו לקרינת אור UV לטווח ארוכה, דבר שעלול להוביל מוטציות הקשורות גידולים, ובכך להגביל את בקשות iPSCs נגזר fibroblasts עור 11,12. לאחרונה, זה כבר דווח כי תאי עור אדם נורמלים לצבור מוטציות סומטיות וגני סרטן מרובים, כוללים רוב נהגי המפתח של קרצינומה של תאי קשקש עורית, נמצא תחת סלקציה החיובית חזקה 13.

בניגוד פיברובלסטים עור, דם היקפי (PB) תאים הם מקור עדיף של תאים לתכנות מחדש כי 1) תאי דם ניתן להשיג בקלות באמצעות תהליך פולשנית, 2) תאי דם היקפיים הם הצאצאים של תאי גזע hematopoieticהמתגורר מח עצם, ולפיכך הוא מוגן מפני קרינה מזיקה. תאי דם היקפיים mononuclear (MNCs PB) ניתן לאסוף תוך שעה מהשכבה מעיל באפי בעקבות צנטריפוגה שיפוע פשוטה באמצעות Ficoll-Hypaque (1.077 גרם / מ"ל). MNCs PB השיג מורכבים של לימפוציטים, מונוציטים וכמה ובתאים Hematopoietic (HPCs) 14. למרות לימפוציטים מסוג T האדם הם אחד מסוגי התאים העיקריים ב PB, בוגרת תאי T המכילים rearrangements של הקולטן של תאי T (TCR) גנים חסרים גנום שלם ובכך להגביל את הפוטנציאל שלהם ליישומים 15,16. עם זאת, התחדשות של תאי T באמצעות הדור iPSC ייתכן יישומים פוטנציאליים Chimeric Antigen קולטן (CAR) T-cell טיפול 17-19. לשם השוואה, יש HPCs גנום שלם הם reprogrammable בקלות. למרות רק 0.01 - 0.1 תאים% במחזור הפריפריה הם HPCs, תאים אלה ניתן להרחיב vivo לשעבר במדיום erythroid שדוגלת ריבוי erythrובתאי OID 14.

במחקר הקודם שלנו, השתמשנו גורם BCL-XL בנוסף הגורמים יאמאנאקה (Oct4, Sox2, MYC ו KLF4), אשר הביאה לעלייה 10x ב ויעילות תכנות מחדש PB 20. BCL-XL, הידוע גם בשם BCL2L1, הוא מעכב חזק של מוות של תאים, על ידי עיכוב ההפעלה של caspases 21,22. אבל, BCL-XL יכול גם לשחק תפקיד חשוב בשמירה על pluripotency 21,22. לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה נוספת מערכת תכנות מחדש EV שלנו על ידי בנפרד להביע MYC ו KLF4 עם שני וקטורים, מה שמוביל לעלייה כ 100x יעיל תכנות מחדש 23. באמצעות שיטה זו, את יעילות תכנות מחדש, המוגדר על ידי מספר מושבה המחולק החל מספר תא transfection, היא 0.2 - 0.5% מתורמים בריאים. כדלקמן, אנו מתארים את הליך הניסוי המפורט ליצירת iPSCs ללא אינטגרציה מן PB.

Protocol

כל הדגימות האנושיות PB התקבלו מתורמי מבוגרים אנונימי ללא פרטי זיהוי זמינים Tianjin דם מרכז באישור ועדת אתיקת מחקר המקומית.

1. אנדו ללא הכנה פלסמיד

  1. השתמש ערכה מסחרית פלסמיד טיהור מקסי לחלץ וקטורי episomal מ חיידק על פי הפרוטוקול של היצרן. עבור השלב הסופי, חיץ TE תחליף עם מים סטריליים ללא רעלן פנימי לפזר את גלולת DNA.
  2. מדוד ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר מסחרי UV / Vis. הריכוז הוא בדרך כלל גדול יותר 1 מיקרוגרם / μL, עם A260 / A280 ויחסי A260 / A230 גדול מ 1.8 ו -2.0, בהתאמה.

2. מדיה ותרבות

  1. הכן בינוני erythroid: בינוני הרחבת תא גזע Hematopoietic בתוספת 100 ng / פקטור תאי גזע אנושיים מ"ל (SCF), 10 ng / mL Interleukin-3 (IL3), 2 U / mL אריתרופויטין (EPO), 20 ng / Factor-1 אינסולין צמיחה מ"ל (IGF1), 1 מיקרומטר dexamethasone ו- 0.2 מ"מ 1-thioglycerol. סנן לעקר עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. בינוני erythroid יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
  2. הכן בינוני iPSC: DMEM / בינוני F12 (בינוני הנשר שונה של Dulbecco / מזין תערובת F-12) בתוספת גלוטמין L-1x, 1x פניצילין / סטרפטומיצין, פתרון חומצות אמינו 1x שאינם חיוניים, 50 ng / mL פיברובלסטים צמיחה 2 Factor (FGF2 ), תוספת אינסולין-transferrin-סלניט 1x () ITS, וחומצה אסקורבית 50 מ"ג / מ"ל. סנן לעקר עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. בינוני iPSC יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
  3. כן בינוני MEF: בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM; גלוקוז גבוהה) השלים עם פניצילין 1x / סטרפטומיצין ו -10% עובריים שור סרום (FBS). סנן לעקר עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. בינוני MEF יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש או טרי להוסיף לפני השימוש L- גלוטמין 1x.
  4. Pבינוני cryopreservation repare iPSC (2x): ממיסים 5 גרם של D-trehalose ב 30 מ"ל של מים סטריליים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. להביא את הטמפרטורה עד 4 ° C ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של FBS ו 10 מ"ל של dimethylsulfoxide (DMSO). סנן לעקר עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים 24.

3. בידוד של תאי הדם ההיקפי mononuclear (MNCs PB)

  1. שלב 10 מדגם PB טרי מ"ל ו -10 מ"ל חיץ PBS לתוך צינור 50 מ"ל ומערבבים היטב. תביאו PBS על RT או 37 ° C לפני השימוש.
    הערה: כ 1 - 3 x 10 6 MNCs (טריים או cryopreserved) ניתן להשיג 1 מ"ל של PB. לאחר 6 ד תרבות, מצפה לקבל 0.5 - 1 x 10 6 תאים בסך הכל בשל מוות של תאים בוגרים במהלך התרבות. כ 1 x 10 7 תאים ניתן להשיג 10 מיליליטר של PB הטרי.
  2. הוסף 10 מ"ל Ficoll אל החלק התחתון של הצינור באמצעות מזרק 10 מ"ל מצורף מחט ארוכה. פרו זהסס צריך להיעשות לאט כדי להבטיח כי שכבת Ficoll אינו מתערבב עם PB.
  3. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות בקצב האצה האטה נמוכה. לאחר צנטריפוגה, MNCs PB הנמצאים בשכבה לבנה (מעיל באפי) ממוקם בין פלזמה PB ואת Ficoll.
  4. לאט לשאוב ~ 10 פלזמה מ"ל PB מבלי להפריע את שכבת מעיל באפי. בזהירות מסיק את השכבה הלבנה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל לצינור 50 מ"ל חדש. ההיקף הכולל של תאים שנאספו מההשכבה הלבנה יהיה בין 3 - 6 מיליליטר.
  5. להוסיף PBS להביא את הנפח הכולל עד 30 מ"ל ומערבבים היטב עם טפטפת 10 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
  6. הסר את תא גלולה supernatant ו resuspend במדיום תרבות 20 מ"ל (בינוני של Dulbecco Modified של קרי Iscove, IMDM) ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות כדי להסיר את הרוב של טסיות.
  7. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 - 2 מ"ל IMDM. תאים עשויים לשמש fאו תרבות מיידית, או למטה קפוא לשימוש מאוחר יותר. עבור cryopreservation, להוסיף כמות שווה של המדיום cryopreservation. תאים Aliquot ב cryovials (0.5 - 1 מ"ל לכל בקבוקון) והעברת cryovials כדי מקפיא -80 מעלות צלזיוס מיד. MNCs PB ניתן לאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות או יועבר מיכל חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: כאשר להפשרת תאים קפואים, אם כי בינוני cryopreservation שלנו עלול להיגרם כדאיות התא, את מספר הסלולרי עשוי לקטון בשל מוות של תאים במהלך תהליך ההפשרה. מומלץ 1 - 10 x 10 7 תאים יוקפאו בכל בקבוקון.

4. הרחבת MNCs PB ב erythroid בינוני

  1. הכן 5 בינוני מ"ל IMDM בתוך שפופרת 15 מ"ל. במהירות להפשיר את MNCs PB קפוא בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להעביר אותם אל הרכבת התחתית עם המדיום IMDM.
    הערה: משך הזמן באמבט מים תלוי בנפח של תאים cryopreserved ואת u cryovialSED. בדרך כלל, התא הקפוא יפשיר בתוך דקות 1.
  2. צנטריפוגה ב 400 XG עבור 5 - 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום erythroid. הוסף 10 μL פתרון Trypan כחול עד 10 μL ההשעיה תא ומערבבים היטב. Trypan כחול מכתים תאים מתים בתוך 1 - 3 דקות. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
  3. MNCs תרבות PB בתרבות הלא רקמות (לא TC) שטופלו 6-גם צלחת עם 2 בינוני מ"ל לכל טוב, בצפיפות תא של ~ 5 x 10 6 תאים / מ"ל, ב 37 מעלות צלזיוס CO 5% 2 חממת humidified.
  4. הוסף 1 בינוני erythroid טרי מ"ל ישירות היטב כל מבלי לשנות את המדיום בבית D 3 ו -5.
  5. בשעה D 6, לקצור את MNCs PB עבור nucleofection.

5. PB MNC Nucleofection ו Reprogramming

  1. יום אחד לפני nucleofection, טרום מעיל TC שטופלו 6-גם צלחות עם ג'לטין 0.1% ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. פיברו מומת הפשרת Murine העובריהפיצוץ (MEF) תאים מזין בתוך אמבט מים 37 ° C ומיד ולהעבירם צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום MEF.
  2. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. הסר את הג'לטין מהצלחת 6-היטב, resuspend התא גלולה במדיום MEF, ולהעבירם את הג'לטין מראש שטופלו 6-גם צלחת. בכל טוב, זרע 2 - 4 x 10 5 תאים MEF מומת המרחפים 2 בינוני מ"ל MEF.
  3. תרבות תאי מזין MEF על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified 5% CO 2.
  4. ביום nucleofection, לשאוב את המדיום MEF ולהחליפו בינוני erythroid 1 מ"ל. טרום לאזן את צלחת התרבות במשך 10 - 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממת humidified 5% CO 2.
  5. הוסף 2 מיקרוגרם PEV-OCT4-2A-Sox2, 1 מיקרוגרם PEV-myc, 1 מיקרוגרם PEV-KLF4, ו -0.5 מיקרוגרם PEV-BCL-XL בתוך שפופרת Eppendorf 1.5 מ"ל סטרילי. מחממים את הצינור ב 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על מנת למנוע זיהום, להתקרר RT. לְהוֹסִיף57 μL Nucleofection חיץ 13 תוספת μL.
  6. קציר 2 x 10 6 MNCs PB תרבותי לצינור מ"ל 5 על ידי צנטריפוגה ב XG 200 עבור 7 דקות. הסר את supernatant ולהוסיף לתערובת חיץ פלסמיד nucleofection אל התא גלולה. מערבבים היטב על ידי מצליף את הצינור עם האצבע.
    הערה: נמוכה כמו 2 x 10 5 תאים עשויה לשמש nucleofection, אבל יעילות תכנות מחדש תחתונות צריכות להיות צפויות גם כן.
  7. מעביר את דנ"א השעית תא קובט המסופק בערכה וכובע קובט. בחר את תוכנית U-008 במכשיר nucleofection. הכנס את קובט לתוך מחזיק ולחץ על אישור כדי להחיל את תוכנית יו- 008.
  8. קח קובט מתוך המחזיק, להוסיף 0.5 - 1 מ"ל מחומם מראש בינוני erythroid בכל קובט, ותאי העברת לצלחת MEF מראש equilibrated מיד. בשל וריאציה היעילות התורם תכנות מחדש גבוהה, זריעת מספרים שונים של תאים הנעים בין 1-10 x 10 5 תאים pאה כן מומלץ מאוד.
  9. מעביר את צלחת תא היפוקסיה, ולשטוף את החדר עם גז מעורב המורכב 92% N 2, 5% CO 2 ו -3% O 2, 1 - 2 דקות בקצב של 20 ליטר / דקה. לאחר איטום החדר, התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס.
  10. ב D 2 שלאחר nucleofection, להוסיף 2 בינוני מ"ל iPSC ישירות היטב כל אחד.
  11. בשעה D 4 שלאחר nucleofection, להסיר 3 מ"ל של מדיום ולהוסיף 2 מ"ל בינוני iPSC טריים. בשעת D 4 שלאחר nucleofection, רוב תאי החיים יהיו מחובר שכבת המזין.
  12. אחרי D 6 שלאחר nucleofection, לשנות את המדיום כל 2 ד על ידי השארת 500 μL בילה בינוני והוספת 2 בינוני E8 טרי מ"ל בתוספת 0.25 מ"מ נתרן בוטיראט עד D 14 - 18.
    הערה: מזין תאים נוסף שיתווספו בארות ההתרבות בכל פעם ההתבוננות כי התאים המזינים שהופרדו. לאחר ההפשרה MEFs (ראה 5.1 ו -5.2), resuspend התא גלולה בנפח קטן של המדיום E8 (כלומר ~ 0.2 מיליליטר עבור אחד טוב של צלחת 6-היטב) ולאחר מכן להוסיף MEFs לתוך בארות התרבות. כ 2% FBS ניתן להוסיף כדי להגדיל מצורף התא. לחלופין, מדיום ממוזג MEF יכול לשמש גם, אבל זה יותר מייגע.

6. הרחבת iPSCs

הערה: ברוב המקרים, מספר רב של מושבות iPSC להופיע D 8 - 10 פוסט nucleofection. אחרי D 14, מושבות iPSC גדולות הן בדרך כלל מוכנות לקטיף.

  1. לפני לקטוף מושבות, להוסיף 500 בינוני μL E8 השלימו עם מעכב רוק, Y27632 (10 מיקרומטר), ב אחד טוב של מזין או Matrigel מצופה צלחת 24 גם. השתמש פיפטה μL 10 או 20 ושורטים לבחור מושבות תחת מיקרוסקופ. מעביר את החתיכות של כל מושבה כדי הבארות המכילות את מדיום התרבות.
    הערה: ריכוז Matrigel נבדל אצווה אחת לאחרת. בדרך כלל, אנו משתמשים 1: 100 דילול של Matrigel.
    1. על מנת למנוע מגע בין שני, להריםמושבות כי הם גדולים ומופרדים היטב מאחרים. IPSCs תרבות על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified 5% CO 2.
      הערה: זה צריך להיות לציין כי אוכלוסיית iPSC עשויה להיות polyclonal בשל נדידת תאים כאשר יש עשרות או מאות מושבות בכל טוב של צלחת 6 באר.
  2. אל תשנה בינוני עבור ד 2 הראשון. מעכב ROCK יכול לקדם הישרדות של מושבות קטנות 25.
  3. מ D 2 ואילך, לשנות בינוני כל יום על ידי הסרה בינונית בילה והוספת בינוני E8 טרי 500 μL בכל טוב.
  4. כ 1 שבוע לאחר מכן, כאשר המושבות הם גדולים מספיק, להסיר את המדיום ולטפל את התאים עם 300 פתרון ניתוק התא μL (0.5 מ"מ EDTA ב PBS) בשעה 37 מעלות צלזיוס במשך 1 - 3 דקות. הסר את הפתרון ניתוק התא ולהוסיף בינוני E8 המכילים מעכבי ROCK (10 מיקרומטר) להשעות iPSCs. אין לשבור מושבות לתוך תאים בודדים, דבר שעלול להוביל למות תאים מופרז. גושי התא עם 5 - 50 תאיםהים מתאים למעבר iPSC.
  5. העברת 50 - 100% של השעיה התא היטב כל צלחת 12 או 6 היטב כי כבר precoated עם מתקני האכלה או Matrigel.
  6. לתרבות לטווח ארוך צלחות מצופות Matrigel (ראה הערה 6.1), לשנות את המדיום מדי יום. כאשר התא confluency מגיע 40 - 60%, לטיפול בתאים עם 1 פתרון ניתוק התא מ"ל (0.5 mM EDTA ב PBS) בשעה 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 3 דקות. כאשר המושבות להתחיל להתכרבל, להסיר את הפתרון ניתוק התא ולהוסיף המכילים מעכבי ROCK בינוני E8 (10 מיקרומטר) להשעות את iPSCs. תאי מעבר עם גורם קריעה 4 - 8. מעכב ROCK יש להוסיף כאשר passaging תאים להגדיל הישרדות, ומוציאים 1 ד מאוחר יותר כדי למנוע בידול.
  7. כדי להקפיא למטה iPSCs, לטפל בתאים עם פתרון ניתוק התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 - 5 דקות על פי פרוטוקול של היצרן. כאשר המושבות iPSC להתחיל להתכרבל, לשאוב את המאגר ואת להוסיף 0.5 - 1 בגווני מ"ל E8.
  8. הוסף נפח שווה של המדיום cryopreservation על השעיית התא ומערבבים היטב. קפואים iPSCs ניתן לאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות או בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

בחירה 7. iPSCs ללא שיורית Episomal פלסמידים

  1. לאחר המעבר 5, iPSCs הקציר ולחלץ הדנ"א הגנומי.
    הערה: בדרך כלל לאחר 5 קטעים של תרבות, פלסמידים episomal שיורית הם לגילוי. לכן, כמעט כל המושבות iPSC ב מעברים מעל 5 (כלומר מעבר 10) חסרים פלסמידים episomal שיורית.
  2. השתמש הדנ"א הגנומי של MNCs untransfected PB כביקורת שלילית. הוסף פלסמיד 1.6 pg PEV-OCT4-2A-Sox2 לתוך ה- DNA בקרה שלילית 1 מיקרוגרם לחקות תאים עם עותק אחד של פלסמיד PEV לכל תא.
  3. הוסף 9 מים μL PCR כיתה כולל 100 הדנ"א הגנומי ng ו 1 μL פריימרים ספציפיים (10 מיקרומטר אחד של קדימה לאחור פריימרים) לתוך 10 μL באיכות גבוהה PCR מיקס מאסטר. לנרמל את amount של ה- DNA על ידי GAPDH. השתמש פריימרים הבאים עבור PCR: EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT, EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG, צפון אמריקנית בהמשך הקטע-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT, צפון אמריקנית בהמשך הקטע-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT, GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC, GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC.
  4. דגירת תערובת התגובה על 98 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות; ואחריו 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 ° C למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. אחרי 30 מחזורים; להאריך את התגובה על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. טען 5 מוצרים μL PCR בכל טוב של ג'ל agarose 1%. הפעל את ג'ל למשך 20 - 30 דקות ב 100 V. בחר שיבוטים iPSC עם להקות לגילוי עבור EBNA1 ואת צפון אמריקנית בהמשך הקטע לתרבות נוספת וניתוח במורד הזרם.

8. cytometry זרימה

  1. קציר iPSCs תוך התייחסות אליהם עם Accutase ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 - 5 דקות כדי לקבל השעיה תא בודד. הוסף 1 μL PE מצומדות אנטי-TRA-1-60 או 570 מצומדות eFluor אנטי SSEA4 או נוגדן Isotypic 100 μL של ההשעיה תא (1 - 5 x 10 5 תאים) צינורות 5 מ"ל. דגירת הצינורות במיקום בחושך ב RT במשך 20 דקות.
  2. לאחר מכתים עבור 20 דקות ב RT, להוסיף 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות. תאי Resuspend ב 300 μL PBS עבור מיון תא קרינה מופעלת (FACS) ניתוח באמצעות cytometry זרימת מנתח תא. 23,26

9. הדמיה Confocal

  1. iPSCs זרע שקופיות קאמרית מצופה Matrigel.
  2. אחרי 3 - 4 ד התרבות, הסר את מדיום הגידול ולתקן עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב RT במשך 30 דקות. שטוף תאים פעמים עם PBS.
    הערה: PFA הוא רעיל ומזיק.
  3. פנקו את התאים עם 0.1% Triton X-100 ב PBS (PBS-T) ב RT במשך 30 דקות. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS.
  4. חסום את התאים עם חיץ חסימה (סרום עיזים 5% ב PBS, V: V) ב RT במשך שעה 1.
  5. במהלך השלב חסימה, לדלל את הנוגדן הראשוני (100x) בחסימת המאגר.
    הערה: מידע הנוגדנים מופיע בטבלת החומרים / ציוד.
  6. דגירה תאים עם נוגדן מדולל ב 4 ° CO / N.
  7. פעמים לשטוף עם PBS-T במשך 15 דקות, ואחריו פעמים עם PBS במשך 15 דקות.
  8. דגירה תאים עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות בדילול ב RT עבור 2 שעות.
  9. פעמים לשטוף את התאים עם PBS-T במשך 15 דקות, ואחריו פעמים עם PBS במשך 15 דקות.
  10. הכתם הגרעין עם DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS ב RT במשך 10 דקות.
  11. שטוף תאים פעמים עם PBS במשך 15 דקות.
  12. צלמו תמונות עם מיקרוסקופ confocal. 23,27

10. teratoma Assay

קציר 1 x 10 6 iPSCs עם פתרון ניתוק התא (0.5 mM EDTA ב PBS) ותאי resuspend ב 200 μL DMEM / F12 מדולל (1: 1) Matrigel.

  1. תת עורי להזריק תאים לתוך החלקה האחורית האחורית של עכברי immunodeficient NOD / SCID.
  2. בשעה 8 - 12 בשבוע לאחר ההזרקה iPSC, לנתח ולתקן teratomas בפורמלין 10%. 28
  3. לאחר microsectioning וצביעה עם hematoxylin ו eosin (H & E), ולנתח דגימות. 29

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה, אנו יכולים להשיג מאות מושבות מ 1 x 10 5 nucleofected MNCs PB (איורים 1 א ו -1 B). יעילות תכנות מחדש היא כ 0.2 - 0.5% ואת המושבות להביע סמני pluripotency (1C הדמוי ו 1D). iPSCs שנוצר באמצעות פרוטוקול המתוארים הם ללא אינטגר...

Discussion

רכישת דגימות דם מתורמים או מטופלים בריאים נוחה ולא פולשנית, מה שהופך אותו מקור תא אטרקטיבי למחקר בסיסי טיפול בתאים קליני. כאן יש לנו תיאר פרוטוקול עבור הדור היעילה ביותר של iPSCs אינטגרציה נטולת מדגימות דם היקפיים. גישה לשחזור ובמחיר סביר זה אמור להועיל בתחום iPSC.

Disclosures

The authors have no competing or conflicting interests to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Hematopoietic Stem Cell Expansion MediumSigmaS0192Store at 4 °C
Human Stem Cell Factor (SCF)Peprotech300-07Store at -20 or -80 °C
Interleukin-3 (IL-3)PeprotechAF-200-03Store at -20 or -80 °C
Erythropoietin (EPO)Peprotech100-64Store at -20 or -80 °C
Insulin Growth Factor-1 (IGF-1)Peprotech100-11Store at -20 or -80 °C
DexamethasoneSigmaD4902Store at -20 or -80 °C
1-thioglycerol (MTG)SigmaM6145Store at -20 or -80 °C
DMEM/F12 mediumGibco112660-012Store at 4 °C
L-glutamine (100x)Gibco25030-081Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (100x)Gibco15140-122Store at -20 °C
Non-essential Amino Acids solution (100x)Gibco11140-050Store at 4 °C
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)Peprotech100-18BStore at -20 or -80 °C
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS, 100x)Gibco41400-045Store at 4 °C
Ascorbic acidSigma49752Store at -20 °C
DMEM (high glucose) mediumThermoSH30243.01BStore at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSV30087.01Store at -20 °C
FicollGE Healthcare, SIGMA17-5442-02Store at RT
TrehaloseSigmaT9531Store at 4 °C
Dimethylsulfoxide (DMSO)SigmaD2650Store at RT, protect from light
Endofree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362Store at RT
IMDMGibco21056-023Store at 4 °C
Human CD34+ Cell Nucleofection KitLonzaVPA-1003Store at RT, nucleofection buffer and supplement should be stored at 4 °C
Sodium ButyrateSigmaB5887Store at -20 or -80 °C
ROCK inhibitor - Y27632STEMGENT04-0012-10Store at -20 °C
Essential 8 basal medium (E8)GibcoA15169-01Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80 °C
MatrigelBD354277Store at -20 or -80 °C
2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye)TransGen BiotechAS111Store at -20 °C
Cell detachment solutionSTEMGENT01-0006Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single-cell suspension
DAPISigmaD9542-1MGStore at 4 or -20 °C
Anti-Nanog AF488BD560791Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used
Anti-OCT4abcamab19857Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used
AF488 donkey anti-mouse IgGInvitrogenA21202Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence,  dilute 1/500 when used
PE anti-human TRA-1-60-R antibodyBiolegend330610Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4eBioscience41-8843Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Isotype antibodyeBioscience11-4011Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Alkaline Phosphatase Detection KitSiDanSai1102-100Store at 4 °C
Genomic DNA Extraction KitTIANGENDP304-02Store at RT
Trypan Blue solutionSigmaT8154Store at RT
Flow cytometry cell analyzerBDLSRII
Spinning Disk Confocal microscope (SDC)PerkinElmerUltraVIEW VOXfor confocal imaging
Nucleofection deviceLonzaNucleofector 2bfor the nucleofection of PB MNC
ImageQuant LAS-4010GEto take photos of AP staining in bulk

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  4. Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
  5. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).
  7. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
  8. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
  9. Dorigo, O., et al. Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells. J Virol. 78, 6556-6566 (2004).
  10. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
  11. Harms, P. W., et al. Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation. Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).
  12. Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
  13. Martincorena, I., et al. Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin. Science. 348, 880-886 (2015).
  14. Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).
  15. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  16. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  17. Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. , (2015).
  18. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
  19. Gill, S., June, C. H. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).
  20. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8, e64496 (2013).
  21. Li, Y., et al. The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation. Nat Commun. 4, 2174 (2013).
  22. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  23. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).
  24. Zhang, X. B., et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion. 43, 265-272 (2003).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. , (2010).
  27. Castiel, A., et al. Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells. J Vis Exp. , e50568 (2013).
  28. Peterson, S. E., et al. Teratoma generation in the testis capsule. J Vis Exp. , e3177 (2011).
  29. Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation. J Vis Exp. , (2010).
  30. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. , (2016).
  31. Lo, C. A., et al. Quantification of Protein Levels in Single Living Cells. Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).
  32. Liu, S. P., et al. An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).
  33. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 13, 446-452 (2016).
  34. Chou, B. K., et al. A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach. Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).
  35. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 4, 3594 (2014).
  36. Howden, S. E., et al. Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts. Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).
  37. Meng, X., et al. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor. Cell research. 23, 658-672 (2013).
  38. Liao, W., et al. Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4. Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119mononuclear MNC PBhematopoietic HPCsepisomaliPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved