JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم لك مجموعة من جيل البشرية هندسة أنسجة القلب من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات (hiPSC) -derived العضلية. نقدم طريقة لتحليل قوة التقلص وتغيير المثالي لنمط تقلص من قناة- herg قناة المانع E-4031. يظهر هذا الأسلوب مستوى عال من المتانة وصلاحيتها للفحص المخدرات القلب.

Abstract

يصف هندسة الأنسجة القلبية التقنيات لتشكل ثلاثة الأنسجة المهندسة الأبعاد توليد القوة. لتنفيذ هذه الإجراءات في البحوث الأساسية وتطوير العقاقير قبل السريرية، فمن المهم وضع بروتوكولات لتوليد وتحليل الآلي في ظل ظروف موحدة. هنا، نقدم تقنية لتوليد أنسجة القلب مهندسة (EHT) من العضلية من مختلف الأنواع (الجرذان والفئران والبشرية). وتعتمد هذه التقنية على التجميع من الليفين هلام يحتوي على العضلية فصل بين polydimethylsiloxane مرن (PDMS) المشاركات في شكل 24-جيدا. يشكل ثلاثي الأبعاد، EHTs توليد قوة في غضون أسبوعين بعد الصب. يسمح هذا الإجراء لتوليد عدة مئات من EHTs في الأسبوع، ويقتصر من الناحية الفنية إلا من خلال توافر العضلية (0،4-1،0 × 10 6 / EHT). يتم تقييم تقلصات العضلات متقلص ضد تزايد المقاومة في غرفة الحضانة تعديل مع ميكانالتعشيق كال ل24 لوحات جيدا وكاميرا وضعت على رأس هذه القاعة. يتحكم البرمجيات انتقلت الكاميرا على نظام محور XYZ لكل EHT. تم الكشف عن تقلصات EHT بواسطة خوارزمية التعرف على الرقم الآلي، ويتم احتساب القوة على أساس تقصير من EHT والميل مرونة والهندسة وظائف PDMS. يسمح هذا الإجراء للتحليل الآلي للارتفاع أعداد EHT في ظل ظروف موحدة ومعقمة. كشف موثوق بها من آثار المخدرات على انكماش cardiomyocyte هو أمر حاسم لتطوير الأدوية القلبية والصيدلة السلامة. علينا أن نبرهن، مع مثال على قناة- herg قناة المانع E-4031، أن النظام EHT البشري يتطابق الردود المخدرات على حركية انقباض القلب البشري، مشيرا إلى أن يكون أداة واعدة لفحص القلب سلامة الدواء.

Introduction

وقد أدت الآثار الجانبية القلبية مثل متلازمة QT الطويلة التي يسببها الدواء لسحب السوق خلال السنوات الماضية. وتشير الإحصاءات إلى أن حوالي 45٪ من جميع عمليات السحب ومن المقرر أن الآثار غير المرغوب فيها على نظام القلب والأوعية الدموية 1. هذا الفشل المخدرات بعد العملية التنموية مكلفة والموافقة هو السيناريو الأسوأ لشركات الأدوية. لذا تركز إدارات البحوث والتطوير في مجال الكشف عن هذه الآثار غير المرغوب فيها القلب والأوعية الدموية في وقت مبكر. لالمخاوف الاقتصادية والأخلاقية، والجهود المبذولة للحد من التجارب على الحيوانات واستبدالها فحوصات في المختبر فحص جديدة جارية.

وأدرجت مجموعة من المقايسات التي أنشئت في إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) مبادئ توجيهية لتقييم ما قبل السريرية من آثار المخدرات proarrhythmic 2. تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا الجسدية تليها تمايزالناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) عززت هذا المجال البحثي 3. الآن يوفر إمكانية لفرز المرشحين دواء جديد على العضلية البشرية في المختبر، ويتجنب القضايا مع وجود اختلافات بين الأنواع. الأخيرة البروتوكولات تمايز القلب 4، 5 توفر امدادات غير محدودة من العضلية دون القلق الأخلاقي. ومع ذلك، فإن قياس قوة مقلص، وأهم وأفضل وصف في المعلمة الجسم الحي الخلايا العضلية، لم يتم تأسيس جيدا. ويرتبط هذا إلى عدم النضج النسبي 6 من الجذعية المحفزة العضلية المشتقة من الخلايا البشرية التي يسببها (hiPSC-CM) بالمقارنة مع cardiomyocyte الكبار. وتقدم محتمل هو مهندس أنسجة القلب 3-الأبعاد من الخلايا واحد 7 (هندسة أنسجة القلب، EHT). ويستند البروتوكول EHT على تضمين الفئران واحد أو العضلية الإنسان 8 سوب>، 9، 10 في هيدروجيل الليفين بين اثنين polydimethylsiloxane مرن (PDMS) المشاركات 11 في شكل 24-جيدا. في غضون بضعة أيام تبدأ العضلية للتعاقد بشكل عفوي كما الخلايا واحد والبدء في تشكيل الشبكات الخلوية. بعد 7-10 أيام، تقلصات العيانية من الأنسجة كلها مرئية. وخلال هذه العملية يتم تشكيلها المصفوفة خارج الخلية، مما يؤدي إلى انخفاض قطرها وطولها. تقصير نتائج EHT في الانحناء للPDMS نشر حتى أثناء الراحة، إخضاع العضلية في EHT النامية لتحميل المستمر. تستمر EHTs لأداء تقلصات العضلات متقلص ضد تزايد المقاومة على مدى عدة أسابيع. تظهر EHTs البشري الردود على التحفيز الفسيولوجية والدوائية مبينا مدى ملاءمتها لفحص المخدرات والمرض النمذجة 7.

في هذه المخطوطة نقدم بروتوكول قوية وسهلة للالجيلعلى من EHT الإنسان، وتحليل انقباض الآلي للتغيرات التي تعتمد تركيز نمط انكماش في وجود مثبطات قناة قناة- herg.

Protocol

ملاحظة: تصف الخطوات التالية بروتوكول زراعة الخلايا. الرجاء أداء تحت ظروف معقمة واستخدام وسائل الاعلام قبل تحسنت.

1. القلب تمايز hiPSC

  1. زراعة hiPSC
    1. لوحات معطف 6-جيدا (1 مل / جيد) أو قوارير T75 (7 مل / قارورة) مع انخفاض عامل نمو الغشاء القاعدي المصفوفة (على سبيل المثال geltrex، 1: 200، وانظر الجدول المواد) المخفف في المتوسط النسر تعديل Dulbecco و(DMEM) ل 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إعداد FTDA المتوسطة 12 عن طريق خلط DMEM الأساسي / F-12 متوسطة مع 2 مم L-الجلوتامين، و 0.5٪ البنسلين / الستربتومايسين، 5 ملغ / L ترانسفيرين، 5 ميكروغرام / L السيلينيوم، 0.1٪ ألبومين المصل البشري، 1X الدهون مزيج، 5 ملغم / لتر الأنسولين، 50 نانومتر dorsomorphin، 2.5 نانوغرام / مل activin A، 0.5 نانوغرام / مل الإنسان TGFß1 و 30 نانوغرام / مل FGF2.
    2. hiPSC البذور (~ 3 × 10 10/05 سم ²) في FTDA المتوسطة والثقافة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، 21٪ O 2 مع تغيير المتوسطة اليومي (الشكل 1A). في 80٪ confluency، والمرور (1: 2-1: 6) مع الاثيلين ديامين حمض tetraacetic (EDTA؛ 0.5 ملم، حضانة الوقت ~ 4 دقائق).
  2. تشكيل هيئات مضغي (EB)
    1. زراعة hiPSC في قوارير T75 إلى الكثافة السكانية العالية.
      1. غسل القوارير مع خلايا متكدسة مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS)، واحتضان في 0.5 ملي EDTA ل~ 10 دقيقة. تأكد من أن الخلايا لا فصل من الجزء السفلي من القارورة.
      2. إزالة EDTA مع ماصة الزجاج، وطرد من الخلايا مع 10 مل PBS، قوارير الصنبور في مقاعد البدلاء لفصل الخلايا.
        ملاحظة: استخدام الخلايا مكشطة إذا لزم الأمر.
      3. جمع الخلايا في أنبوب 50 مل المخروطية، إضافة ¼ من حجم (على سبيل المثال 10 مل RMPI إلى 40 مل تعليق خلية) RPMI 1640 المتوسطة (أو أي وسيلة أخرى القياسية التي تحتوي على 1.8 ملي الكالسيوم) وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. إعادة تعليق بيليه خلية في FTDA المتوسطة تستكمل مع 4 ملغ / مل البولي فينيل الكحول (PVA) و10 ميكرومتر Y27632 وعدد الخلايا في غرفة نويباور.
    3. ملء قارورة الدوار مع تعليق خلية (30 × 10 6 خلية / 100 مل FTDA المتوسطة تستكمل مع PVA وY-27632، وانظر الخطوة 1.2.2) وبدء EB تشكيل في قوارير الدوار (ضبط سرعة الدوار من محرك مغناطيسي إلى 40 دورة في الدقيقة ) في حاضنة الثقافة الخلية (37 ° C، 5٪ CO 2، 5٪ O 2) خلال الليل.
  3. أرومية متوسطة التمايز
    1. خلال تشكيل EB، زراعة الخلايا معطف قارورة مناسبة للثقافة تعليق مع السطحي غير الأيونية (14 مل / T175) أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية.
    2. في صباح اليوم التالي، وغسل قوارير المغلفة السطحي مرتين مع برنامج تلفزيوني (30 مل / T175). إضافة PBS مرة أخرى ونضع في الحاضنة لحين الحاجة إليها.
    3. إزالة قارورة الدوار من الحاضنة.
      يجب أن يكون التعليق الخلية واضح مع EBS مرئية ظاهريا صغيرة (الشكل 1B): ملاحظة.
    4. نقل 50 مل تعليق لحوض مخروطي 50 مله والسماح EBS تسوية ل5-20 دقيقة.
    5. إزالة طاف ويغسل بيليه مع 7 مل من RPMI 1640 تستكمل مع 2٪ PVA و 10 ميكرومتر Y-27632. تعليق نقل إلى تخرج 15 مل أنبوب مخروطي وتقدير حجم EB (~ 50-100 ميكرولتر).
    6. نقل محتويات قوارير الدوار إلى قوارير T175 غير المصقول وترك هذا على رف على شكل V للترسيب لمدة تصل إلى 20 دقيقة. إزالة طاف ويغسل الهيئات مضغي كما هو مذكور أعلاه. لا تملأ قارورة T175 مع أكثر من 200 مل كما الترسيب سيستغرق وقتا طويلا. إذا تجاوز حجم الأولي الدوار قارورة 200 مل، وتقسيم EB تعليق لعدة قوارير T175 والجمع بين EBS مرة أخرى بعد الغسيل.
    7. إزالة غسل المتوسطة وresuspend في المتوسط ​​للتمايز أرومية متوسطة، وهذا هو RPMI تستكمل مع 4 ملغ / مل PVA، و 0.5٪ البنسلين / الستربتومايسين، 10 ملم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 0.05٪ مصل الإنسان الزلال، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 5 نانوغرام / مل سيلينيت الصوديوم، 0.1٪ دهن المزيج، 250 ميكرومتر الفوسفات أسكوربات، 10 ميكرومتر Y-27632، 10 نانوغرام / مل morphogenic العظام البروتين 4 (BMP-4)، و 3 نانوغرام / مل activin A، 5 نانوغرام / مل FGF2 مستقرة.
    8. إزالة PBS من قوارير T175 المغلفة السطحي وملء مع تعليق خلية (200 ميكرولتر EBS في 40 مل). استخدام قوارير صغيرة لحجم EB أصغر.
    9. زراعة EBS في تعليق لمدة ثلاثة أيام (37 ° C، 5٪ CO 2، 5٪ O 2). صرف 50٪ من المتوسط ​​(نفس التكوين كما في الخطوة 1.3.7) كل يوم (على شكل V-استخدام رف الترسيب). إعداد الطازجة المتوسطة كل يوم قبل التغذية.
  4. التمايز القلب
    1. إعداد السفن الجديدة المغلفة السطحي قبل يوم والتعامل معها كما هو مذكور أعلاه (1.3.2).
    2. بعد ثلاثة أيام من تحريض أرومية متوسطة، والسماح EBS تستقر لمدة تصل إلى 5 دقائق على الرف الترسيب. إزالة معظم المتوسطة ويغسل مع RPMI 1640 تستكمل مع 0.5٪ البنسلين / الستربتومايسين و 10 ملي HEPES.
    3. نقل 10 مل من تعليق EB لتخرج15 مل أنبوب وتقدير حجم EB بعد الترسيب.
    4. إعادة تعليق EBS بعناية في وسط تمايز القلب يتألف من RPMI 1640 تستكمل مع 0.5٪ البنسلين / الستربتومايسين، 10 ملي HEPES، 0.05٪ ألبومين المصل البشري، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 5 نانوغرام / مل سيلينيت الصوديوم، 0.1٪ مزيج الدهن، و 250 ميكرومتر الفوسفات -ascorbate، 1 ميكرومتر Y-27632، 100 نانومتر WNT المانع DS-I-7 13.
    5. نقل EBS إلى قوارير جديدة زراعة الخلايا المغلفة السطحي (~ 200 ميكرولتر EBS في 46 مل / T175).
    6. احتضان لمدة ثلاثة أيام (37 ° C، 5٪ CO 2، 21٪ O 2) مع تغيير المتوسطة 50٪ (تكوين متوسطة راجع الخطوة 1.4.4) في اليوم الثاني والثالث. لا تغيير المتوسطة ضمن 48 ساعة الأولى.
    7. احتضان في المتوسط تتكون من RPMI 1640 تستكمل مع 500 ميكرومتر 1-Thioglycerol، 10 ملي HEPES، و 0.5٪ البنسلين / الستربتومايسين، 1 ميكرومتر Y-27632، 2٪ خالية من المصل ملحق زراعة الخلايا العصبية (مثل B27) مع الأنسولين، و 100 نانومتر WNT -inhibitor DS-I-7 مع الصرف اليومي من 50٪ متوسط ​​خلال الأيام الأربعة المقبلة. وينبغي أن تبدأ EBS الضرب خلال هذه الفترة.
    8. بعد أسبوع واحد من التمايز في القلب، والتحول إلى نفس وسيط وبدون WNT تثبيط ومع العصبي ملحق ثقافة الخلية خالية من المصل. تغيير 50٪ من المتوسط ​​كل يوم، باستثناء اليوم الأول.
  5. تفكك العضلية الإنسان
    ملاحظة: بعد أسبوعين من بروتوكول التمايز، يجب EBS تظهر تقلصات عفوية (الشكل 1C). إذا كان الأمر كذلك، بدء التفكك وإعداد حل كولاجيناز.
    1. يعد حل كولاجيناز من وزنها وحل 200 U / مل في هانكس "محلول ملحي متوازن خال من الكالسيوم دون الكالسيوم / المغنيسيوم (HBSS) وإضافة 1 ملي HEPES، 10 ميكرومتر Y-27632، 30 ميكرومتر sulphonamide N-البنزيل-ف التولوين ( BTS). تعقيم بواسطة تصفية (فلتر 0.2 ميكرون)، وأجزاء مأخوذة مخزن في -20 ° C. ذوبان الجليد aliquots في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. تسوية EBS على الرف الترسيب،نضح المتوسطة واستبدالها مع HBSS استعد قبل 20-25 مل. كرر هذه الخطوة غسل مرة أخرى.
    3. نضح HBSS واستبدالها مع حل كولاجيناز قبل تحسنت (15 مل / T175). احتضان لمدة 4 ساعات في حاضنة الثقافة الخلية (37 ° C، 5٪ CO 2، 21٪ O 2).
    4. إعداد عازلة تمنع مع DMEM تستكمل مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والدناز (12 ميكروغرام / مل).
    5. الاستفادة من قوارير زراعة الخلايا على مقاعد البدلاء، فصل EBS يجب أن تتفكك وتنهار (إن لم يكن، وزيادة فترة حضانة). تعليق خلية يسحن بلطف ونقل إلى المخروطية أنبوب 50 مل. غسل القوارير مع عازلة تمنع (15 مل / T175) ونقل إلى أنبوب.
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 100 × ز. إعادة تعليق الخلايا في DMEM الحارة، يسحن وعدد الخلايا.

2. توليد المهندسة القلب الأنسجة (EHT)

  1. الأوتوكلاف رفوف PDMS المتاحة تجاريا وبوليتيترافلوريثيليني (PTFE) الفواصل (انظر المواد ومعدات جدول. الشكل 2) وإعداد الحلول التالية تحت ظروف معقمة، قبل يوم واحد إلى جيل EHT.
    1. إعداد 2٪ الاغاروز من وزنها وإذابة في حجم مناسب من برنامج تلفزيوني، الأوتوكلاف، تخزين فورا في 60 ° C.
    2. إعداد أبروتينين (33 ملغ / مل) من خلال وزنها وإذابة في حجم مناسب من iniectabilia إعلان المائية، وتصفية العقيمة (فلتر 0.22 ميكرون)، قسامة ومخزن في -20 ° C.
    3. إعداد الفيبرينوجين (200 ملغ / مل) عن طريق إذابة الفيبرينوجين العقيمة في حجم مناسب لمعقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم (فاترة)، قسامة ومخزن في -20 ° C.
    4. إعداد الثرومبين (100 U / مل) عن طريق إذابة الثرومبين العقيمة في ثلاثة أجزاء عقيمة PBS و 2 أجزاء iniectabilia إعلان المائية، وأجزاء قسامة من 3 ميكرولتر في أنابيب صغيرة ومخزن في -20 ° C.
    5. إعداد 10X DMEM عن طريق إذابة 670 ملغ مسحوق 10X DMEM في 5 مل iniectabilia إعلان المائية، تصفية العقيمة وتخزينها في 4 ° C.
    6. إعداد 2X DMEMعن طريق خلط 2 مل 10X DMEM مع 2 مل مصل الحصان الحرارة المعطل 0.2 مل البنسلين / الستربتومايسين و 5.8 مل iniectabilia إعلان المائية، تصفية العقيمة وتخزينها في 4 ° C.
    7. إعداد EHT الصب المتوسطة (ECM) عن طريق خلط DMEM مع 10٪ للحرارة المعطل مصل العجل الجنين، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 1٪ L-الجلوتامين (200 ملم)، وتخزين عند 4 درجات مئوية.
  2. إعداد قوالب الصب في 24 لوحات جيدا قبل pipetting 1.6 مل الاغاروز الدافئ (2٪، PBS) ووضع PTFE هل (الشكل 2A) في الآبار.
    ملاحظة: مكان هل مباشرة بعد pipetting لفي مدة أقصاها 8 آبار - الاغاروز يتصلب بسرعة جدا. لا تترك الاغاروز في درجة حرارة الغرفة لمدة تزيد عن 5 دقائق.
  3. بعد التصلب الاغاروز (~ 10 دقيقة، الاغاروز سوف تتحول مبهمة)، إزالة الفواصل PTFE (الشكل 2C) ووضع PDMS رفوف (الشكل 2B) في قوالب الصب بحيث أزواج من المشاركات PDMS تصل إلى كل قالب (الشكل 2D).
  4. Resuspend والعضلية في ECM مع الحد الأدنى من تركيز 15 × 10 6 خلية / مل.
  5. إعداد 110٪ من الحجم المقدر من مزيج إعادة في أسفل أنبوب 15 مل مستديرة حول ice.For 24 EHTs، ماصة المزيج إعادة المدرجة في الجدول 1 للإنسان، الفئران أو الماوس العضلية، على التوالي (يتم تضمين 10٪ اضافية).
    ملاحظة: تركيز خلية من مزيج إعادة هو مختلف عن (6.8 × 10 6 خلية / مل) EHTs الإنسان (10 × 10 6 خلية / مل)، الفئران (4.1 × 10 6 خلية / مل) والفأرة. اعتمادا على تركيز لتعليق الخلية، إضافة ECM إضافية إلى الحجم النهائي من 2640 ميكرولتر. الفيبرينوجين يجب أن يكون فاتر لpipetting ل. ببطء ملء غيض من الماصة ولا تلمس سطح المزيج إعادة البارد مع الماصة التي تحتوي على الفيبرينوجين عند إضافة الفيبرينوجين إلى المزيج إعادة - اللزوجة من الفيبرينوجين في الطرف ماصة سيزيد على الفور.
  6. يسحن المزيج إعادة 10-15 مرات مع ماصة المصلية حتى تجلط الفيبرينوجين يذوب. تحقق من مزيج إعادة في ماصة للتجانس.
  7. لكل ميكرولتر مزيج EHT، الماصة 100 إعادة في قسامة الثرومبين واحد (3 ميكرولتر في 200 أنبوب ميكرولتر)، ومزيج الماصة الخليط في الاغاروز فتحات في أسرع وقت ممكن (الشكل 2E). استخدام الفلتر جديد لكل EHT. إعادة تعليق المزيج إعادة (سحن مع المصلية ماصة 5-10 مرات) بعد كل 8 EHTs.
  8. مرة واحدة يتم ملء جميع فتحات مع مزيج إعادة، أغلق غطاء للطبق زراعة الخلايا واحتضان عند 37 ° C، 7٪ CO 2 لمدة 2 ساعة.
  9. إزالة لوحة من الحاضنة ومكان تحت غطاء العقيمة. تغطية كل جيدا مع كمية صغيرة من المتوسطة (مثل DMEM، ما يقرب من 200-500 ميكرولتر)، يهز لوحة بلطف واحتضان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل. وإضافة DMEM تخفيف إزالة من المواد الهلامية الليفين من قوالب الصب الاغاروز.
  10. إعداد لوحة 24-جيدا جديدة مع 1.5 مل EHT المتوسطة في تتألف أيضا من DMEM تستكمل مع 10٪ مصل الحرارة المعطل حصان، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 10 ميكروغرام / مل الانسولين، 33 ميكروغرام / مل أبروتينين.
  11. إزالة بعناية رفوف PDMS من قوالب الصب الاغاروز ونقلها إلى لوحة مليئة المتوسطة 24-جيدا (الشكل 2F). وضع الطبق مرة أخرى في حاضنة (37 ° C، 7٪ CO 2، 40٪ O 2 لEHTs الإنسان والفئران، 21٪ O 2 لEHTs الماوس) والأعلاف الاثنين والأربعاء والجمعة مع الطازجة EHT متوسطة. يجب EHTs تظهر تقلصات عفوية تشتيت المشاركات من الرفوف PDMS 7-10 أيام بعد الصب (1D الشكل، 2G).
    1. فأرة الحاسوب EHTs إضافة 25 ميكروغرام / مل من βDarabinofuranoside 5 السيتوزين إلى مستنبت لمدة 48 ساعة للحد من انتشار الخلايا الليفية.

تحليل 3. انكماش

ملاحظة: يعتمد التحليل على الانكماشفيديو بصري تسجيل في صك تحليل EHT المتاحة تجاريا (انظر الجدول المواد). الوحدة المركزية من هذا الصك هو غرفة الحضانة (الشكل 3A). البرامج المقدمة مع الصك بحساب قوة الانكماش على أساس انحراف من المشاركات PDMS مع معامل المرونة المعروفة والهندسة 11 (الشكل التكميلي 1).

  1. بدوره على جهاز التدفئة من الجهاز 2 ساعة قبل القياس. بدوره على امدادات الغاز وإمدادات الإلكترونية من نظام محور الفور قبل التحليل الانكماش.
  2. للتسجيل الأساسي (النقطة المرجعية في التحليل)، ضع جيدا لوحة 24 مع EHTs في EHT متوسطة إلى أداة تحليل EHT وبدء برامج التحليل الانكماش وفقا لدليل المورد.
    1. انقر على "بروتوكول" علامة على اللوحة اليمنى وإدخال المعلومات ذات الصلة فيما يتعلق اسم الدراسة، المستخدم، والأنواع، منوع ليرة لبنانية، والعمر، طول تسجيل والملاحظات الإضافية.
    2. انقر على "كاميرا الرؤية" علامة على اللوحة اليسرى والبدء في وضع الكاميرا الحية مع وضع كشف الرقم التلقائي. انقر على "إعداد" علامة على اللوحة اليمنى andadjust موقف الكاميرا مع XYZ إحداثيات كل بئر في جيدا طبق 24. تأكد من أن EHT هو في وسط النافذة والتركيز في الكاميرا.
      1. تأكد من أن غطاء للطبق زراعة الخلايا ليست ضبابية حيث سيؤدي ذلك إلى إضعاف الاعتراف شخصية وتحليل الانكماش.
        ملاحظة: يعتمد خوارزمية التعرف على شخصية على الكشف عن المناطق عالية التباين ورصد التغير في الموقف. في البرنامج سيخصص هذه المناطق من الاعتراف الرقم مع الصليب الأزرق الذي يتحرك مع تقلصات في EHT.
      2. تأكد من أن مواقف الصلبان الزرقاء هي في كلا نهايات العلوية والسفلية من EHTs وتتحرك فقط مطابقة عموديا تقلصات في EHTs (الشكل 3B). Sمواقف الإعداد افي من كل بئر عن طريق الضغط على زر "موقف طيب".
    3. التالي، انقر فوق "معلمات" علامة على اللوحة اليسرى. المعلمات المعروضة هنا تحدد المعايير التي يحدد البرنامج ذروة الانكماش ويصادف ذلك مع الساحة الخضراء. هذه القيم هي مهمة جدا لتحديد الصحيح من قمم الانكماش (الشكل 3C) وأي نقطة بيانات غير صحيحة (الشكل 3E-F).
      ملاحظة: قائمة الأنواع المعلمات التابعة والأمثلة هو مبين في الشكل 3H. لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى دليل البرامج.
    4. انقر على "تلقائي" علامة على اللوحة اليمنى، والشروع في تحليل من خلال تفعيل زر "ابدأ". يقوم البرنامج تتحرك بالتتابع من بئر واحدة ل، سجل تقلصات EHT المقبلة وحساب القوة أثناء التسجيل (عرض في علامة التبويب "الوقت الحقيقي" على اللوحة اليسرى). في نهاية التحليل، تقريرا الشعبي summariزينغ النتائج سيتم إنشاؤه تلقائيا.
  3. حفظ وتحليل قوات الدفاع الشعبي تقرير النظام ولدت لتلخيص النتائج.
  4. مراقبة المعلمات مقلص من قياس المتكررة على مدى عدة أيام. سوف EHT زيادة في قوة الانكماش حتى وصلت إلى الهضبة (عادة حوالي يوم 15 من الثقافة).
  5. فحص المخدرات
    1. إعداد البروتين الحلول المجانية تايرود قبل يوم واحد لقياس وتتوازن في 24 لوحات جيدا (2 مل / جيد) في حاضنة الثقافة الخلية (37 ° C، 7٪ CO 2، 40٪ O 2) ليلة: 120 مم كلوريد الصوديوم، 5.4 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 0،1-5 ملم CaCl 2، 0.4 ملي ناه 2 PO 4، 22.6 ملم NaHCO 3 و 5 ملي الجلوكوز، 0.05 ملي نا 2 EDTA 25 ملي HEPES. إضافة الكالسيوم تصل إلى 1.8 ملم أو التي سبق تحديدها [EC 50] للتحقيق آثار إيجابية تقلصية القلب.
    2. تزن وحل المخدرات في DMSO وتصفية العقيمة، إذا لزم الأمر.إعداد 6 مختلفة حلول 1000X شبه الأسهم (في DMSO) من تركيز العمل (على سبيل المثال 0.3، 1، 3، 10، 30، 100 ميكرومتر لمجموعة nanomolar المعنية).
    3. تمييع الأسهم منها في لوحات تايرود (2 ميكرولتر في كل مل 2 أيضا) وتخلط جيدا. وضع لوحات مرة أخرى في حاضنة لحين الحاجة إليها.
    4. بدء قياس خط الأساس بأخذ الأولى المليئة تايرود 24-جيدا لوحة تحت غطاء محرك السيارة العقيمة والكربون موقف أقطاب في الآبار. نقل رفوف PDMS مع EHTs وضعت على رأس أقطاب الكربون، إغلاق الغطاء، ووضع لوحة مرة أخرى في حاضنة والانتظار لفترة موازنة من ~ 30 دقيقة.
    5. نقل EHTs من الحاضنة إلى التعشيق في الصك تحليل EHT. إغلاق الجهاز وتسجيل انقباض الأساسي العفوي (20 ق / EHT).
    6. قم بتوصيل أقطاب الكربون إلى كابل سرعة وبدء التحفيز الكهربائي للEHTs (2.5 V، 4 مللي مدة دفعة والبشرية: ~ 1 هرتز، الفئران: ~ 2هرتز، والماوس: ~ 4 هرتز). تسجيل "الايقاع" خط الأساس (10 ق / EHT). التأكد من أن جميع EHTs وتيرة بشكل صحيح. تردد التحفيز والجهد قد تختلف من خط الخلية إلى خلية خط.
    7. بعد تسجيل خط الأساس، وإزالة EHTs من الصك ونقل الأقطاب مع رفوف PDMS على القمة، وإلى بئر لوحة 24 مع تركيز الدواء الأول. نقل EHTs مرة أخرى على التعشيق من أداة تحليل EHT فورا واحتضان هناك (معيار حضانة المخدرات الوقت على سبيل المثال 20 دقيقة).
    8. إعادة الكابلات سرعة، وضبط الاعتراف الرقم وتسجيل تقلصات EHT الاستجابة لتركيز الدواء الأول.
    9. لتركيز الدواء التالية، كرر الخطوة 3.5.7 و3.5.8 مع 24-جيدا لوحات تحتوي على تركيزات أعلى المخدرات.
    10. حفظ جميع التسجيلات قوات الدفاع الشعبي. التحقق من كل تسجيل للتعرف على شخصية، وتحديد المواقع الصحيح من الساحات الخضراء تحديد القمم انكماش والتحف (انظر 3.2.1 والشكل 3 ).
    11. لتحليل متواجد حاليا إضافية إذا لزم الأمر.
      1. اختيار المدى منهما من قاعدة البيانات "يعمل" على اللوحة اليسرى بالنقر على "تحديد المدى". في "معلمة" علامة على اليسار، قم بتغيير المعلمة لتحليل الانكماش. الآن اختيار "تحليل غير متصل" في علامة التبويب "اتصال" على لوحة الحق في reanalyze الفيديو.
      2. لضبط الاعتراف شخصية وبالتالي تسجيل ملف فيديو جديد، اختر "استعراض نموذج" بعد تعديل الاعتراف الرقم في علامة التبويب "الوقت الحقيقي". ملاحظة: استعراض عينة يمكن reanalyze فقط بشكل جيد في وقت واحد، في حين أن تحليل غير متصل يمكن أن تنطبق معلمة جديدة لجميع الآبار عن طريق النقر على زر "استخدام المعلمة على جميع الآبار" في لوحة "معلمة" على اليسار. وكلا النوعين من التحليلات حاليا إنشاء ملفات البيانات الجديدة وقوات الدفاع الشعبي عرض نتائج تلقائيا.
    12. تحليل التجربة من خلال الجمع بين نتائج بiological يعيد وتلخيص البيانات في منحنيات استجابة تركيز للتردد، قوة الانكماش، الساعة التقلص والاسترخاء الوقت (الشكل 5D) و / أو عرض رسومية من متوسط قمم الانكماش (الشكل 5C).
      ملاحظة: رفوف PDMS وPTFE هل يمكن استخدامها مرارا وتكرارا (PDMS رفوف أقصى 5 مرات، وPTFE هل ما لا نهاية). بعد الاستخدام، وتنظيفها يدويا بالماء، وتغلي مرتين في الماء المنزوع المعادن والأوتوكلاف. يكون على بينة من الآثار المرحل المحتملة، عند إعادة استخدام الرفوف، كما قد يتم استيعاب المخدرات من قبل PDMS.

النتائج

القلب التمايز وإعداد EHT

تم توسيع HiPSC على انخفاض عامل نمو الغشاء القاعدي المصفوفة، فصلها مع EDTA والهيئات مضغي (EBS) التي تشكلت في قوارير الدوار بين عشية وضحاها. بعد تحريض أرومية متوسطة لمدة ثلاثة أيا?...

Discussion

تقدم المهندسة أنسجة القلب خيار قيمة إلى مربع أداة للبحوث القلب والأوعية الدموية. وقد أثبتت EHTs في شكل 24-جيدا قيمة لنمذجة مرض 8، 14، وفحص سلامة الدواء 7، 8، 10، 11،

Disclosures

IM، TE وAH هي شارك في تأسيس EHT تقنيات محدودة، وألمانيا.

Acknowledgements

المؤلفون ممتنون لأليساندرا موريتي ودينيس شايد للمساهمة عينية من المواد. ونحن نعترف الدعم الكبير من الفريق العامل الجذع وEHT في وزارة التجريبية الأدوية والسموم من UKE. ويدعم هذا العمل من المؤلفين من المنح المقدمة من DZHK (المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية) والوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (BMBF)، مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG إس 88 / 01/12، HA 3423 / 5-1 )، المركز الوطني البريطاني لاستبدال صقل والحد من الحيوانات في البحوث (NC3Rs CRACK-IT تمنح 35911-259146)، ومؤسسة القلب البريطانية RM / 13/30157، والمجلس الأوروبي للبحوث (متقدم غرانت IndivuHeart)، ومؤسسة القلب الألمانية وفراي اوند Hansestadt هامبورغ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EHT analysis intrumentEHT Technologies GmbHA0001Software is included
EHT PDMS rackEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE spacerEHT Technologies GmbHC0002
EHT electrodeEHT Technologies GmbHP0001
EHT pacing adapter/cableEHT Technologies GmbHP0002
24-well-plateNunc144530
6 well-cell culture plateNunc140675
15 mL falcon tube, graduated Sarstedt62,554,502
Cell scraperSarstedt831,830
Spinner flaskIntegra182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask Sarstedt 831,812,002
V-shaped sedimentation rack Custom made at UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-Thioglycerol Sigma AldrichM6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin-A R&D systems338-AC
Agarose Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insulin Gibco17504-044
BMP-4R&D systems314-BP
Collagenase II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, type V (from bovine spleen)Sigma D8764
Dorsomorphin abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Fetal calf serumGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinogen (bovine)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Horse serumLife technologies26050088
Human serum albumin Biological Industries05-720-1B
Insulin, humanSigma AldrichI9278
L-GlutaminGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-ToluenesulfonamideTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicillin/StreptomycinGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Polyvinyl alcohol Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Sodium seleniteSigma AldrichS5261
TGFß1Peprotech100-21
ThrombinSigma AldrichT7513
Transferrin Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCCustom made at UKE hamburgna
iCell cardiomyocytes kitCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kitPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kitAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio USA, Inc.Y10075

References

  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?. Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  4. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  5. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  6. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  7. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
  8. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  9. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  10. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  11. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
  12. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  13. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  14. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
  15. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  16. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
  17. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  18. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  19. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  20. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
  21. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  22. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  23. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved