Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die Herstellung von humanen konstruierte Herzgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten. Wir stellen eine Methode Kontraktionskraft und beispielhafte Veränderung der Kontraktionsmuster durch den hERG-Kanal-Hemmer E-4031 zu analysieren. Dieses Verfahren zeigt hohe Robustheit und die Eignung für das Herz Wirkstoff-Screening.

Zusammenfassung

Cardiac Tissue Engineering beschreibt Techniken dreidimensionale Krafterzeugungs engineered Gewebe zu bilden. Für die Umsetzung dieser Verfahren in der Grundlagenforschung und die präklinische Entwicklung von Medikamenten, ist es wichtig, Protokolle zur automatisierten Generierung und Analyse unter standardisierten Bedingungen zu entwickeln. Hier präsentieren wir eine Technik Engineered Herzgewebe (EHT) von Kardiomyozyten verschiedener Spezies zu erzeugen (Ratte, Maus, Mensch). Die Technik beruht auf der Anordnung eines Fibrin-Gel, das dissoziiert Kardiomyozyten zwischen elastischer Polydimethylsiloxan (PDMS) Einträgen in einem 24-Well-Format. Dreidimensionale, krafterzeugende EHTs bilden innerhalb von zwei Wochen nach dem Gießen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erzeugung von mehreren hundert EHTs pro Woche und ist technisch nur durch die Verfügbarkeit von Kardiomyozyten (0,4-1,0 × 10 ⁶ / EHT) begrenzt. Bewertung der auxotonisches Muskelkontraktionen in einem modifizierten Inkubationskammer mit einem mechan durchgeführtische Verriegelung für 24-Well-Platten und eine Kamera auf der Oberseite dieser Kammer angeordnet. Eine Software steuert eine Kamera auf einem XYZ-Achsensystem an jede EHT bewegt. EHT Kontraktionen werden durch eine automatisierte Figur Erkennungsalgorithmus erkannt wird, und wird eine Kraft berechnet, basierend auf Verkürzung der EHT und die elastische Neigung und die Geometrie der PDMS Beiträge. Dieses Verfahren ermöglicht die automatisierte Analyse von hohen Zahl von EHT unter standardisierten und sterilen Bedingungen. Die zuverlässige Erkennung von Arzneimittelwirkungen auf Kardiomyozyten Kontraktion ist von entscheidender Bedeutung für die Herzarzneimittelentwicklung und Sicherheitspharmakologie. Wir zeigen, mit dem Beispiel der hERG Kanalinhibitor E-4031, dass das menschliche EHT System Arzneimittelantworten auf der Kontraktion Kinetik des menschlichen Herzens nachbildet, angibt, dass es ein vielversprechendes Werkzeug für die kardialen Arzneimittelsicherheit Screening sein.

Einleitung

Herznebenwirkungen wie die Arzneimittel-induzierte Long-QT-Syndrom haben Rücknahme aus dem Markt in den letzten Jahren geführt. Statistiken zeigen , dass etwa 45% aller Abhebungen fällig sind , um unerwünschte Auswirkungen auf das Herz - Kreislauf - System ^1. Dieses Medikament Versagen nach dem teueren Entwicklungsprozess und die Genehmigung ist das Worst-Case-Szenario für Pharmaunternehmen. Forschungs- und Entwicklungsabteilungen konzentrieren sich daher auf dem Nachweis von solchen unerwünschten kardiovaskulären Wirkungen frühzeitig zu erkennen. Aus wirtschaftlichen und ethischen Bedenken, die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren und ersetzen sie durch neue in - vitro - Screening - Tests sind im Gange.

Eine Reihe von etablierten Assays sind in den Vereinigten Staaten Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel - Agentur (EMA) Richtlinien für die präklinische Bewertung von proarrhythmischen Arzneimittelwirkungen ² enthalten. Die Technologie von somatischen Zellen durch Differenzierung gefolgt Umprogrammierung vonmenschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) verstärkt dieses Forschungsgebiet ^3. Es bietet nun die Möglichkeit , neue Medikamentenkandidaten auf dem menschlichen Kardiomyozyten in vitro zu screenen und vermeidet Probleme mit Wechselwirkungen zwischen den Arten Unterschieden. Aktuelle Herzdifferenzierungsprotokolle ^{4, 5} bieten unbegrenzte Versorgung von Kardiomyozyten ohne ethische Bedenken. Die Messung der Kontraktionskraft ist die wichtigste und am besten charakterisierte jedoch in vivo Parameter von Kardiomyozyten, nicht gut etabliert. Dies hängt mit der relativen Unreife ⁶ des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) im Vergleich zu dem erwachsenen Kardiomyozyten. Eine mögliche Weiterentwicklung ist 3-dimensionale Herzgewebe aus einzelnen Zellen zu konstruieren , ⁷ (engineered Herzgewebe, EHT). Das EHT - Protokoll basiert auf einzelnen murinen oder humanen Kardiomyozyten Einbettung ⁸ sup>, ^{9, 10} in Fibrinhydrogel zwischen zwei flexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) Pfosten ¹¹ in 24-Well - Format. Innerhalb von wenigen Tagen beginnen die Kardiomyozyten spontan als einzelne Zellen zu kontrahieren und starten Mobilfunknetze zu bilden. Nach 7-10 Tagen sind makroskopische Kontraktionen des gesamten Gewebes sichtbar. Während dieses Prozesses wird die extrazelluläre Matrix umgestaltet, was zu einer Abnahme des Durchmessers und der Länge führt. Die Verkürzung der EHT Ergebnisse in der PDMS Biege Post auch während der Ruhe, Kardiomyozyten in der Entwicklung von EHT zu Dauerbelastung ausgesetzt wird. EHTs weiterhin auxotonisches Muskelkontraktionen über mehrere Wochen durchzuführen. Human EHTs zeigen Reaktionen auf physiologische und pharmakologische Stimulation anzeigt , deren Eignung für Wirkstoff - Screening und Krankheit ⁷ modellieren.

In diesem Manuskript präsentieren wir ein robustes und einfaches Protokoll für die Generatiauf der menschlichen EHT, und die automatisierten Analyse von Kontraktilität konzentrationsabhängigen Veränderungen des Kontraktionsmusters in Gegenwart von hERG Kanalinhibitoren.

Protokoll

HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben ein Zellkultur-Protokoll. Bitte führen Sie unter sterilen Bedingungen und Verwendung vorgewärmten Medien.

1. Cardiac Differenzierung von hiPSC

1. Pflegen Sie den hiPSC
   1. Mantel 6-Well - Platten (1 ml / Well) oder T75 - Kolben (7 ml / Kolbe) mit reduziertem Wachstumsfaktor Basalmembranmatrix (zB geltrex, 1: 200; siehe Tabelle von Materialien) , verdünnt in Dulbeccos modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) für 30 min bei 37 ° C. Bereiten FTDA Medium ¹² durch Mischen von Grund DMEM / F-12 Medium mit 2 mM L-Glutamin, 0,5% Penicillin / Streptomycin, 5 mg / l Transferrin, 5 ug / l Selen, 0,1% menschliches Serumalbumin, 1x Lipid-Mischung, 5 mg / l Insulin, 50 nM Dorsomorphin, 2,5 ng / mL Activin A, 0,5 ng / ml menschliches TGFß1 und 30 ng / mL FGF-2.
   2. Seed hiPSC (~ 3 × 10 ^5/10 cm²) in FTDA Medium und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO _2, 21% O ₂ mit täglichem Mediumwechsel (Abbildung 1a). Bei 80% Konfluenz, Durchgang (1: 2-1: 6) mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 0,5 mM; Inkubationsdauer ~ 4 min).
2. Die Bildung von Embryoidkörpern (EB)
   1. Pflegen hiPSC in T75-Flaschen zu hohen Dichte.
      1. Waschen Kolben mit konfluenten Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Calcium und Magnesium (PBS) gewaschen und in 0,5 mM EDTA für ~ 10 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht vom Boden des Kolbens lösen.
      2. Entfernen EDTA mit Glaspipette, wegzuspülen Zellen mit 10 ml PBS, tap-Kolbe bei der Bank Zellen abzulösen.
         HINWEIS: Verwenden Sie Zellschaber, falls erforderlich.
      3. Collect Zellen in 50 ml konischen Röhrchen, fügt ¼ des Volumens (zB 10 ml RMPI auf 40 ml Zellsuspension) RPMI 1640 - Medium (oder ein beliebiges anderes Standardmedium enthaltend 1,8 mM Calcium) und Zentrifuge bei 250 × g für 5 min.
   2. Resuspendieren Zellpellet in FTDA Medium, das mit 4 mg / ml Polyvinylalkohol (PVA), ergänzt und10 uM Y27632 und die Zellen in einer Neubauer Kammer zählen.
   3. Füllen Sie das Rührkolben mit der Zellsuspension (30 x 10 ⁶ Zellen / 100 ml Medium mit PVA FTDA ergänzt und Y-27632; siehe Schritt 1.2.2) und initiieren EB Bildung in spinner flasks (justieren Rotordrehzahl von Magnetrührers bis 40 Umdrehungen pro Minute ) im Zellkultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO _2, 5% O ₂₎ über Nacht.
3. mesodermalen Differenzierung
   1. Während EB Bildung mantel Zellkulturflaschen für Suspensionskultur mit nicht-ionischem Tensid (14 ml / T175) über Nacht bei 37 ° C geeignet.
   2. Am nächsten Morgen, wasche Tensid beschichteten Kolben zweimal mit PBS (30 ml / T175). In PBS wieder und halten in den Inkubator, bis sie benötigt.
   3. Entfernen Sie die Spinnerflasche aus dem Inkubator.
      HINWEIS: Die Zellsuspension sollte mit kleinem makroskopisch sichtbarem EBs (Abbildung 1B) klar sein.
   4. Übertragung von 50 ml Suspension zu einer 50 ml konischen tubEBs e und lassen Sie regeln für 5-20 min.
   5. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 7 ml RPMI 1640, ergänzt mit 2% PVA und 10 & mgr; M Y-27632. Transfer Suspension zu einem graduierten 15 ml konischen Röhrchen und Schätzung EB Volumen (~ 50-100 ul).
   6. Übertragen Sie Inhalte der Spinnerflaschen zu unbeschichteten T175-Flaschen und lassen diese auf V-förmige Gestell für die Sedimentation für bis zu 20 min. Überstand entfernen und waschen Embryoidkörpern wie oben angegeben. Sie nicht den T175-Kolben mit mehr als 200 ml füllen, wie Sedimentation zu lange dauern würde. Wenn anfängliches Rührkolben Volumen 200 ml überschreitet, aufgeteilt EB Suspension auf mehr T175-Flaschen und kombiniert EBs nach dem Waschen wieder.
   7. Entfernen Waschmedium und Resuspension in Medium für mesodermalen Differenzierung, dh RPMI mit 4 mg ergänzt / ml PVA, 0,5% Penicillin / Streptomycin, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 0,05% Humanserum Albumin, 5 ug / ml Transferrin, 5 ng / ml Natriumselenit, 0,1% Lipid-Mischung, 250 uM phospho-Ascorbat, 10 uM Y-27632, 10 ng / mL knochenmorphogenen Protein-4 (BMP-4), und 3 ng / mL Activin A, 5 ng / ml stabil FGF2.
   8. Entfernen von PBS Tensid beschichteten T175-Kolben und füllt mit Zellsuspension (200 ul EBs in 40 ml) zugegeben. Verwenden Sie kleinere Flaschen für kleinere EB Volumen.
   9. Kultivieren EBs in Suspension für drei Tage (37 ° C, 5% CO _2, 5% O _2). Austausch von 50% des Mediums (gleiche Zusammensetzung wie in Schritt 1.3.7) jeden Tag (Verwendung V-förmige Sedimentation Rack). Bereiten Medium täglich frisch vor der Fütterung.
4. Herzdifferenzierung
   1. Bereiten Sie neue Tensid-beschichtete Gefäße am Tag vor und zu handhaben, wie oben (1.3.2) angegeben.
   2. Nach drei Tagen der mesodermalen Induktion, lassen EBs für bis zu 5 min auf Sedimentation Rack absetzen. Entfernen der größte Teil des Mediums und Waschen mit RPMI 1640, ergänzt mit 0,5% Penicillin / Streptomycin und 10 mM HEPES.
   3. Transfer 10 ml EB Suspension graduierte15 ml-Röhrchen und Schätzung EB Volumen nach der Sedimentation.
   4. Resuspendieren EBs sorgfältig in Medium kardiale Differenzierung, bestehend aus RPMI 1640, ergänzt mit 0,5% Penicillin / Streptomycin, 10 mM HEPES, 0,05% Humanserumalbumin, 5 ug / ml Transferrin, 5 ng / ml Natriumselenit, 0,1% Lipid-Mischung, 250 & mgr; M phospho -ascorbate, 1 uM Y-27632, 100 nM Wnt-Inhibitor DS-I-7 ^13.
   5. Übertragen EBs neue tensidhaltige beschichteten Zellkulturflaschen (~ 200 & mgr; l EBs in 46 mL / T175).
   6. 3 Tage inkubieren (37 ° C, 5% CO _2, 21% O ₂₎ mit 50% Mediumwechsel am zweiten und dritten Tag (mittlere Zusammensetzung Schritt 1.4.4 sehen). ändert das Medium nicht in den ersten 48 Stunden.
   7. Inkubiere in Medium , bestehend aus RPMI 1640 , ergänzt mit 500 & mgr; M 1-Thioglycerin, 10 mM HEPES, 0,5% Penicillin / Streptomycin, 1 & mgr; M Y-27632, 2% serumfreien neurale Zellkultur - Ergänzung (zB B27) mit Insulin, 100 nM Wnt -Inhibitor DS-I-7 mit täglichem Austausch von 50% Medium für die nächsten vier Tage. EBs sollte schlagen innerhalb dieser Frist beginnen.
   8. Nach einer Woche der Herzdifferenzierung, wechselt auf das gleiche Medium ohne Wnt-Hemmung und mit serumfreiem Ergänzung neurale Zellkultur. Ändern Sie 50% des Mediums jeden Tag, außer für den ersten Tag.
5. Die Dissoziation von menschlichen Kardiomyozyten
   HINWEIS: Nach zwei Wochen Differenzierung Protokoll, EBs spontane Kontraktionen (1C) zeigen. Wenn ja, Dissoziation beginnen und Kollagenase-Lösung herzustellen.
   1. Bereiten Kollagenase-Lösung durch Auswiegen und Lösung von 200 U / ml in calciumfreier balanced salt solution Hanks ohne Calcium / Magnesium (HBSS) und füge 1 mM HEPES, 10 & mgr; M Y-27632, 30 & mgr; M N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid ( BTS). Sterilisieren durch Filtration (0,2 um Filter) und Speicher-Aliquots bei -20 ° C. Auftauen Aliquots bei 4 ° C über Nacht.
   2. Settle EBs auf Sedimentation Rack,Aspirat Medium und Ersetzen mit 20-25 ml vorgewärmtem HBSS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.
   3. Aspirat HBSS und ersetzen mit vorgewärmtem Kollagenase-Lösung (15 ml / T175). Inkubieren für 4 h in dem Zellkultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO _2, 21% O _2).
   4. Bereiten Blockierungspuffer mit DMEM, ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin und DNase (12 & mgr; g / ml).
   5. Tippen Sie auf die Zellkulturflaschen auf der Bank, distanzierten EBs sollte auseinander zerfallen und fällt (wenn nicht, erhöht Inkubationszeit). Sanft triturate Zellsuspension und in ein konisches 50 ml-Röhrchen. Waschen Kolben mit Blockierungspuffern (15 ml / T175) aufnehmen und in Röhrchen.
   6. Zentrifuge für 10 min bei 100 x g. Die Zellen in warmer DMEM, verreiben und Zellen zählen.

2. Erzeugung von Engineered Herzgewebe (EHT)

1. Autoklaviert handelsüblichen PDMS Gestellen und Polytetrafluorethylen (PTFE) Abstandshalter (siehe Materialien undAusrüstung Tabelle; Abbildung 2) und die folgenden Lösungen unter sterilen Bedingungen vorbereitet, ein Tag vor der EHT - Generation.
   1. Bereiten 2% Agarose durch Abwiegen und Auflösen in geeigneten Volumen PBS, Autoklaven, sofort lagern bei 60 ° C.
   2. Bereiten Aprotinin (33 mg / mL) und durch Wägung in geeigneten Volumen an Aqua ad iniectabilia gelöst wird, Filter steril (0,22-um-Filter), Aliquot und Lagerung bei -20 ° C.
   3. Bereiten Fibrinogen (200 mg / ml) durch sterile Fibrinogen in geeigneten Volumen von sterilen 0,9% NaCl (lauwarmer) Auflösen, Aliquot und Lagerung bei -20 ° C.
   4. Bereiten Thrombin (100 E / ml) durch Auflösen sterile Thrombin in drei Teilen sterilem PBS und 2 Teilen Aqua ad iniectabilia, aliquoten Teilen von 3 & mgr; l in Röhrchen und Lagern bei -20 ° C.
   5. Bereiten 10x DMEM durch Auflösen von 670 mg 10-fach DMEM Pulver in 5 ml Aqua ad iniectabilia, das Filter steril und lagere bei 4 ° C.
   6. Bereiten Sie 2x DMEMdurch Mischen von 2 ml 10x DMEM mit 2 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 0,2 ml Penicillin / Streptomycin und 5,8 ml Aqua ad iniectabilia, das Filter steril und lagert bei 4 ° C.
   7. Bereiten EHT gießenden Medium (ECM) durch DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin (200 mM) bei 4 ° C gemischt wird.
2. Bereiten von Gießformen in Platten mit 24 Vertiefungen pipettiert , 1,6 ml warmem Agarose (2%, PBS) und Platzieren des PTFE - Abstandshalter (2A) in die Vertiefungen.
   HINWEIS: Legen Sie Abstandshalter unmittelbar nach dem Pipettieren in maximal 8 Vertiefungen - Agarose erstarrt sehr schnell. Sie nicht die Agarose bei Raumtemperatur für länger als 5 Minuten verlassen.
3. Nach Agarose Erstarren (~ 10 min, Agarose wird opake Umdrehung), entfernen Sie die PTFE Abstandshalter (2C) und die PDMS - Gestellen (2B) in die Gießformen platzieren , so dass Paare von PDMS - Stellen in jede Form (2D) erreichen.
4. Die Kardiomyozyten in ECM mit einer Konzentration von mindestens 15 x 10 ⁶ Zellen / ml resuspendieren.
5. Bereiten 110% des geschätzten Volumens der Rekonstitution Mischung in einem Rundboden-15-ml-Röhrchen auf ice.For 24 EHTs pipettieren die Rekonstitution Mischung, die in Tabelle 1 für Menschen, Ratte oder Maus-Cardiomyocyten, bzw. (10% zusätzliches ist enthalten).
   HINWEIS: Die Zellkonzentration der Rekonstitution Mischung ist unterschiedlich für humane (10 x 10 ⁶ Zellen / ml), Ratte (4,1 x 10 ⁶ Zellen / ml) und Maus (6,8 x 10 ⁶ Zellen / ml) EHTs. In Abhängigkeit von der Konzentration der Zellsuspension, fügen Sie zusätzliche ECM zu einem Endvolumen von 2640 ul. Fibrinogen hat zum Pipettieren lauwarm sein. Füllen langsam die Spitze der Pipette und nicht über die Oberfläche der kalt Rekonstitution Mischung mit dem Fibrinogen-enthaltenden pipet berühren, wenn Fibrinogen an die Rekonstitution Mischung Zugabe von - die Viskosität des Fibrinogens in der Pipettenspitze sofort erhöhen würde.
6. Verreibe den Rekonstitution mix 10 - 15 mal mit einer serologischen Pipette bis zum Fibrinogen Gerinnsel aufgelöst wird. Überprüfen Sie die Rekonstitution Mischung in der Pipette auf Homogenität.
7. Für jede EHT, Jeweils 100 & mgr; l der Rekonstitution Mischung in einem Thrombin - Aliquot (3 ul in 200 ul Röhrchen), mischen und die Mischung in den Agarose-Schlitze so schnell wie möglich (Figur 2E) pipettieren. Verwenden Sie für jede EHT eine neue Filterspitze. Resuspendieren der Rekonstitution Mischung (Verreibung mit serologischen Pipette 5-10mal) nach jeweils 8 EHTs.
8. Sobald alle Schlitze mit Rekonstitution Mischung gefüllt sind, schließen den Deckel der Zellkulturschale und inkubieren bei 37 ° C, 7% CO ₂ für 2 h.
9. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und unter einer sterilen Haube. Jeden Auftrag mit einer kleinen Menge an Medium (zB DMEM, etwa 200 bis 500 & mgr; l) und schüttelt die Platte vorsichtig und inkubiere wieder bei 37 ° C für mindestens 10 min. Die Zugabe von DMEM wird die Entfernung von Fibringelen aus Agarose-Gussformen erleichtern.
10. Bereiten Sie eine neue Platte mit 24 Vertiefungen mit 1,5 ml EHT-Medium pro Well, bestehend aus DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 10 ug / ml Insulin, 33 ug / ml Aprotinin.
11. Entfernen Sie vorsichtig die PDMS - Racks aus den Agarose - Gußformen und sie auf das Medium gefüllten 24-Well - Platte (2F). Die Schale zurück in den Inkubator (37 ° C, 7% CO _2, 40% O ₂ für die menschliche und Ratten - EHTs, 21% O ₂ für Maus EHTs) und Futter montags, mittwochs und freitags mit frisch hergestelltem EHT-Medium. EHTs sollten spontane Kontraktionen zeigen die Beiträge des PDMS - Racks 7-10 Tage nach dem Gießen (Figur 1D, 2G) ablenkt.
    1. Für Maus EHTs hinzuzufügen 25 ug / ml 5-Cytosin βDarabinofuranoside zu Kulturmedium für 48 h Fibroblastenproliferation zu begrenzen.

3. Übersetzung Analyse

HINWEIS: Die Kontraktion Analyse basiert aufVideo-optische Aufzeichnungs in einem kommerziell erhältlichen Analysegerät EHT (siehe Tabelle der Materialien). Die Zentraleinheit dieses Instruments ist eine Inkubationskammer (3A). Die Software mit dem Instrument zur Verfügung gestellt berechnet Kontraktionskraft basierend auf Durchbiegung der PDMS Pfosten mit bekannten Elastizitätsmodul und die Geometrie ¹¹ (Supplementary Abbildung 1).

1. Schalten Sie die Heizungseinrichtung der Maschine 2 h vor der Messung. Einschalten Gasversorgung und elektronische Versorgung des Achsensystems unmittelbar vor der Kontraktionsanalyse.
2. Zur Basislinienaufzeichnung (Referenzpunkt in der Analyse) werden die 24-Well-Platte mit dem EHTs in EHT-Medium in das Analyseinstrument EHT und die Kontraktion Analysesoftware gemäß Anbietern manuell starten.
   1. Klicken Sie auf das Register „Protokoll“ auf der rechten Seite und geben Sie relevanten Informationen über Studiennamen, Benutzer, spezies, cell Typ, Alter, Aufzeichnungslänge und zusätzliche Bemerkungen.
   2. Klicken Sie auf den „Kamera-Ansicht“ -Reiter auf der linken Seite und startet Kamera-Live-Modus mit automatischem Bild-Erfassungsmodus. Auf die „Setup“ Register auf der rechten Seite andadjust die Kameraposition mit der xyz-Koordinaten für jeden gut in der 24-Well-Schale. Stellen Sie sicher, dass das EHT in der Mitte des Fensters ist und im Fokus der Kamera.
      1. Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Zellkulturschale nicht neblig ist als diese Zahl Anerkennung und Kontraktion Analyse beeinträchtigen.
         HINWEIS: Die Abbildung Erkennungsalgorithmus auf der Erfassung hohen Kontrastbereiche basiert und die Überwachung ihrer Positionsänderung. In der Software dieser Bereiche der Figurenerkennung werden mit einem blauen Kreuz markiert werden, die mit den Kontraktionen des EHT bewegt.
      2. Vergewissern Sie sich, dass die Positionen der blauen Kreuz beide sind an den oberen und unteren Enden der EHTs und nur vertikal Bewegen die Kontraktionen der EHTs (3B) übereinstimmt. Save Einrichtpositionen jede Vertiefung durch den Button „Position ok“ drücken.
   3. Als nächstes klicken Sie auf die Registerkarte „Parameter“ auf der linken Seite. Die Parameter hier angezeigt definieren die Kriterien, nach denen die Software eine Kontraktion Spitze identifiziert und markiert sie mit einem grünen Quadrat. Diese Werte sind sehr wichtig für die korrekte Identifizierung der Kontraktion Peaks (Figur 3C) und keine falschen Datenpunkte (3E-F).
      HINWEIS: Eine Liste von Arten abhängigen Parameter und Beispiele ist in Abbildung 3 H dargestellt. Weitere Einzelheiten finden Sie in der Software-Handbuch.
   4. Klicken Sie auf die „Automatik“ Reiter auf der rechten Seite und starten Sie die Analyse durch die Schaltfläche „Start“ aktiviert wird. Die Software bewegt sich sequenziell von einer gut auf die nächste, Rekord EHT Kontraktionen und Kraft berechnen während der Aufnahme (angezeigt in der „Echtzeit“ Registerkarte auf der linken Seite). Am Ende der Analyse, ein PDF-Berichts summaridie Ergebnisse Zing wird automatisch generiert.
3. Speichern und analysieren das pdf des Systems berichten erzeugt, um die Ergebnisse zusammenzufassen.
4. Überwachen Sie die Kontraktionsparameter durch wiederholte Messung über mehrere Tage. Die EHT wird in Kontraktionskraft zu erhöhen, bis sie ein Plateau (in der Regel um Tag 15 der Kultur) erreicht haben.
5. Drogentest
   1. Bereiten proteinfreien Tyrode - Lösung eines Tag vor der Messung und äquilibrieren in Platten mit 24 Vertiefungen (2 ml / Vertiefung) in dem Zellkultur - Inkubator (37 ° C, 7% CO _2, 40% O ₂₎ über Nacht: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 0,1-5 mM CaCl _2, 0,4 mM NaH ₂ PO _4, 22,6 mM NaHCO _3, 5 mM Glucose, 0,05 mM Na ₂ EDTA, 25 mM HEPES. In Kalzium bis zu 1,8 mM oder das zuvor ermittelten [EC _50] positiv inotrope Effekte zu untersuchen.
   2. Wiegen und das Arzneimittel in DMSO auflösen und Sterilfilter, falls notwendig.Bereiten 6 verschiedene 1000x-Sub-Stammlösungen (in DMSO) der Arbeitskonzentration ( zum Beispiel 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 & mgr; M für den entsprechenden nanomolaren Bereich).
   3. Verdünne das jeweilige Lager in den Tyrode Platten (2 & mgr; L in jeweils 2 ml well) und gründlich mischen. Legen Sie die Platten in den Inkubator zurück, bis sie benötigt.
   4. Starten Sie die Basislinienmessung, indem die erste Tyrode-gefüllten 24-Well-Platte unter den sterilen Haube und die Position von Kohlenstoffelektroden in den Vertiefungen nehmen. Übertragen der PDMS-Racks mit dem EHTs auf der Oberseite der Kohlenstoffelektroden gelegt, den Deckel schließen, legt die Platte wieder in dem Inkubator und wartet auf einen Äquilibrierungszeitraum von ~ 30 min.
   5. Übertragen Sie die EHTs aus dem Inkubator auf die Verriegelung im EHT Analyseinstrument. Schließt das Instrument und aufzuzeichnen spontane Kontraktionsbasislinie (20 s / EHT).
   6. Eine Verbindung, die Kohlenstoffelektroden mit dem Schrittmacherkabel und beginnen elektrische Stimulation der EHTs (2,5 V, 4 ms Impulsdauer, human: ~ 1 Hz, Ratte: ~ 2Hz, Maus: ~ 4 Hz). Notieren Sie sich die "Tempo" Baseline (10 s / EHT). Stellen Sie sicher, dass alle EHTs richtig Tempo sind. Stimulationsfrequenz und Spannung kann variieren von Zelllinie zu Zelllinie.
   7. Nach Baseline-Aufzeichnung, die EHTs aus dem Gerät entfernen und die Elektroden mit dem Gestellen PDMS über Übergang auf die 24-well-Platte mit der ersten Wirkstoffkonzentration. Übertragen der EHTs zurück auf die Verriegelung des Analyseinstruments EHT sofort und inkubieren dort (Standard Arzneimittel Inkubationszeit zB 20 min).
   8. Schrittmacherkabel verbinden, Figur Erkennung anzupassen und EHT Kontraktionen Datensatz in der ersten Arzneimittelkonzentration reagiert.
   9. Für die folgenden Wirkstoffkonzentrationen Wiederholen Sie Schritt 3.5.7 und 3.5.8 mit den 24-Well-Platten, enthaltend höhere Arzneimittelkonzentrationen.
   10. Speichern Sie alle PDF-Aufnahmen. Überprüfen jeder Aufnahme für Fig Erkennung, die korrekte Positionierung der grünen Quadrate Kontraktionsspitzen identifiziert und Artefakte (siehe 3.2.1 und 3 ).
   11. Führen Sie zusätzliche Offline - Analyse , wenn nötig.
       1. Wählen Sie den entsprechenden Lauf aus der „Runs“ Datenbank auf der linken Seite von „Select Run“ klicken. Im Register „Parameter“ auf der linken Seite, ändern Parameter für die Kontraktion Analyse. Wählen Sie nun „Offline-Analyse“ in der „Offline“ Reiter auf der rechten Seite die Videos erneut zu analysieren.
       2. Zur Einstellung Anerkennung Figur und damit eine neue Videodatei aufnehmen, wählen Sie „Sample Bewertung“ nach der Zahl Anerkennung in der „Echtzeit“ Registerkarte Einstellung. HINWEIS: Beispiel Bewertung kann nur eine gut zu einem Zeitpunkt erneut analysieren, während der Offline-Analyse neue Parameter für alle Vertiefungen anwenden kann, indem Sie die Taste „auf allen Vertiefungen Mit dem Parameter“ klicken Sie im „Parameter“ auf dem linken. Beiden Arten von Offline-Analysen werden automatisch neue Dateien und pdf erstellen, um die Ergebnisse anzuzeigen.
   12. Analysieren Sie den Versuch durch die Ergebnisse der b Kombinationiologische repliziert und die Daten in Konzentrations - Wirkungskurven für Frequenz, Kontraktionskraft, Kontraktionszeit und Relaxationszeit (5D) und / oder graphische Anzeige des durchschnittlichen Kontraktionsspitzen (5C) zusammenfassen.
       HINWEIS: PDMS-Racks und PTFE Abstandshalter können mehrfach verwendet werden (PDMS Racks max 5mal, und PTFE-Abstandshalter endlos.). Nach dem Gebrauch reinigen Sie sie von Hand mit Wasser, kocht zweimal in demineralisiertem Wasser und Autoklaven. Seien Sie sich bewusst von möglichen Verschleppungseffekten, wenn wieder mit dem Racks, als Medikamente könnten durch die PDMS absorbiert werden.

Ergebnisse

Herzdifferenzierung und Herstellung von EHT

HiPSC wurde auf reduziertem Wachstumsfaktor Basalmembranmatrix erweitert, dissoziiert mit EDTA und embryoid bodies (EBs) über Nacht in Spinnerflaschen gebildet. Nach mesodermalen Induktion für drei Tage wurde kardiale Differenzierung mit dem Wnt-Inhibitor ausgelöst. Nach ~ 17 Tagen Differenzierung Protokoll wurde schlagen EBs in einzelne Zellen dissoziiert mit Kollagenase Typ II

Diskussion

Ausgeführt Herzgewebe bieten eine wertvolle Option für den Werkzeugkasten der kardiovaskulären Forschung. EHTs in dem 24-Well - Format haben für Krankheit Modellierung ^{8, 14,} Arzneimittelsicherheit Screening ^{7, 8, 10, 11, 15,} oder basisches Cardiovascular Research ^16,<...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 mL falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075