JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الشيخوخة الخلوية، والدولة لا رجعة فيها اعتقال دورة الخلية، يمكن الناجمة عن مختلف الضغوط الخلوية. هنا، نحن تصف بروتوكولات للحث على الشيخوخة وطرق الخلوية لتقييم علامات الشيخوخة.

Abstract

وردا على الإجهاد الخلوي أو ضرر، ويمكن الخلايا المتكاثرة لحث على برنامج معين الذي يبدأ حالة اعتقال دورة الخلية على المدى الطويل، ووصف الشيخوخة الخلوية. تراكم خلايا هرمة يحدث مع الشيخوخة عضوي ومن خلال زراعة المستمرة في المختبر. خلايا هرمة تؤثر العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، وإصلاح الأنسجة وتجديدها، وقمع الورم، والشيخوخة. وتشمل السمات المميزة للخلايا هرمة، ولكن لا تقتصر على، وزيادة النشاط β غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة (SA-β-غال)؛ INK4A P16، البروتين p53، وP21 المستويات؛ مستويات أعلى من الحمض النووي من التلف، بما في ذلك γ-H2AX. تشكيل المرتبطة الشيخوخة-المغاير البؤر (SAHF)؛ والاستحواذ على المصاحب الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP)، وهي ظاهرة تتميز إفراز عدد من السيتوكينات الموالية للالتهابات والجزيئات الإشارة. هنا، نحن تصف بروتوكولات لكلا تنسخي والشيخوخة DNA الأضرار التي يسببها في الخلايا المستزرعة. وبالإضافة إلى ذلك، نسلط الضوء تقنيات لمراقبة النمط الظاهري الشيخوخي باستخدام العديد من علامات الشيخوخة المرتبطة، بما في ذلك SA-β-غال، γ-H2AX وSAHF تلطيخ، ولقياس البروتين ومرنا مستويات المنظمين دورة الخلية والعوامل SASP. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتقييم الشيخوخة في مختلف النماذج والأنسجة.

Introduction

منذ أكثر من نصف قرن، ووصف Hayflick وزملاؤه كيف خلايا تتكاثر هو دون تغيير في الثقافة، ولكن فقط لفترة محدودة من الوقت 1. زراعة على المدى الطويل من الخلايا الليفية الإنسان تسبب الخلايا لوقف الانتشار. ومع ذلك، فإنها كانت نشطة عملية الأيض، وهذا ما يسمى الشيخوخة الخلوية. الشيخوخة يمكن أن تكون مفيدة لتثبيط تكون الأورام، ولكن أيضا يمكن أن يكون ضارا، كما هو يعتقد أن تساهم في فقدان القدرة على التجدد الذي يحدث مع الشيخوخة 2 و 3. وقد تبين أن خلايا هرمة تتراكم في الأنسجة كما البشر سن 4 و قد تورطت في عدد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح، وإصلاح الأنسجة، والمتعلقة بالعمر التهاب 2.

الركض المستمر للخلايا في ثقافة يدفع الشيخوخة تنسخي، والتي تم ربطهالالتيلومير الاستنزاف وعدم الاستقرار الجيني. الضغوط الخلايا المختلفة، بما في ذلك الحمض النووي من التلف والمسرطنة، ويمكن أيضا أن يسبب الشيخوخة 3. الشيخوخة التي تسببها العوامل الأخرى من الاستنزاف التيلومير وغالبا ما تسمى التوتر الناجم عن الشيخوخة المبكرة أو وعموما يعتمد على INK4A P16 / الروبيديوم مسار 5. وعلى الرغم من الانتشار، تظهر خلايا هو دون تغيير عادة المغزل في الشكل، ويمكن تحديد خلايا هرمة وجود بعض الخصائص، بما في ذلك شقة، مورفولوجيا كبير وزيادة النشاط β غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة (SA-β-غال) (الشكلان 1 و 2). كما تتراكم خلايا هرمة علامات الحمض النووي من التلف، بما في ذلك γ-H2AX (الشكل 3) 6، وربما، المرتبط الشيخوخة المغاير بؤر (SAHF) (الشكل 4) 7. خلايا هرمة لديهم مستويات أعلى من المنظمين دورة الخلية، بما في ذلك ع 16 (INK4A P16) و / أو P21 والبروتين p53 (الشكل 5) 8، 9. وعلاوة على ذلك، أظهرت بيانات حديثة أن خلايا هرمة يمكن أن يكون لها آثار غير المتمتعة بالحكم الذاتي عن طريق إفراز عدد من السيتوكينات الموالية للالتهابات وكيموكينات يسمى المرتبطة الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP) 10. على الرغم من أن هذه الظاهرة SASP قد تختلف من نوع من الخلايا إلى نوع من الخلايا، بصفة عامة، ويتجلى ذلك من خلال زيادة انترلوكين 6 (IL-6)، IL-8،-محببة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF)، النمو- α منظم الجين الورمي (GRO-α)، واللائحة العامة للمنظمة، β، من بين أمور أخرى (الشكل 6). الإجهاد معين أو الضرر الذي يسبب الشيخوخة قد تؤثر أيضا على النمط الظاهري إفرازية 11 و 12 و 13. يمكن الكشف عن SASP عن طريق قياس مستويات البروتينات يفرز باستخدام ELISAs أو صفائف خلوى / البروتينالصورة = "XREF"> 10 و 14. على الرغم من أن آليات ما بعد النسخي يمكن تنظيم مستويات البروتين SASP 11، 15، 16، 17، والتغيرات في مستويات مرنا ويمكن أيضا أن يتم الكشف في كثير من الحالات. هذه التغيرات عادة ما تكون أكثر حساسية وأسهل لتحديد من قياسات مستوى البروتين. ويمكن أيضا أن يتم تقييم علامات هرمة الأخرى، بما فيها بؤر الحمض النووي من التلف المستمر النووي، ودعا شرائح DNA مع بعض التعديلات لونين تعزيز الشيخوخة (DNA-ندوب) 18، والعديد من علامات أخرى 3 و 19 و 20.

هنا، نحن تصف التقنيات الشائعة لإحداث الشيخوخة في الخلايا في الثقافة وأيضا لقياس العديد من علامات الشيخوخة، بما في ذلك SA-β-غال، γ-H2AX، SAHF، والبروتين ومرنا من senesceجزيئات الامتحانات التنافسية الوطنية المصاحب.

Protocol

1. حمل تنسخي الشيخوخة

  1. ذوبان الجليد-مرور منخفض الليفية مضاعفا الإنسان (على سبيل المثال، WI-38 و IMR-90) أو خطوط الخلايا الأخرى.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام الخلايا الليفية مضاعفا الإنسان، ولكن هذه البروتوكولات يمكن استخدامها لتقييم الشيخوخة في أنواع الخلايا الأخرى، مثل البطانية، الظهارية، أو الخلايا الجذعية الوسيطة. قد يكون الأمثل ظروف زراعة لأنواع مختلفة من الخلايا المستخدمة نظرا لمعدلات النمو المختلفة أو ظروف النمو.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا المتكاثرة ولها مورفولوجيا المغزل (انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي والشكل 2 للحصول على أمثلة). من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون للخلايا سكان مضاعفة مستوى (PDL) من <30 في بداية التجارب لتفادي وجود خلايا هرمة تنسخي الممكنة.
    1. حساب PDL من الخلايا باستخدام المعادلة التالية PDL = سجل (N و / N 0) / log2، حيث N و هو عدد الخلايا النهائي و<م> N 0 هو عدد أولي خلايا المصنف 21.
  2. ثقافة WI-38 الخلايا في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
  3. تنمو IMR-90 الخلايا في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
  4. تنمو جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تنمو باستمرار الخلايا وتقسيم كل 2-4 د عندما تصل الخلايا ~ 70-80٪ التقاء. مراقبة التقاء الخلايا باستخدام المجهر الضوئي. تجنب الخلايا مع أعلى نقطة التقاء، وهذا يمكن أن يؤثر على نمو الخلايا بسبب الاتصال كبت.
  5. مراقبة الخلايا تحت المجهر الضوئي لظهور الصرفي خلايا هرمة (انظر الشكلين 1 و 2) وعندما لا يكون هناك تغيير في PDL من ثقافة فرعية واحدة إلى أخرى.

2. DNA الشيخوخة الناجمة عن الأضرار

  1. لوحة الخلايا (على سبيل المثال، WI-38، IMR-90، أو نوع من الخلايا آخر) في مناطق ذات كثافة قليلة (أي ~ 300000 خلية / 6 سم طبق) في طبق مناسب لنوع من التحليل (أي طبق 6 سم للبروتين / علامات RNA أو صحن 6 جيدا لتلطيخ SA-β-غال). استخدام الخلايا المبكر مرور التي هي الشباب والمتكاثرة (<30 PDL) ولوحة منها بحيث الخلايا تقريبا 50-60٪ متموجة في اليوم التالي.
  2. إزالة المتوسطة النمو باستخدام ماصة الزجاج متصلة فراغ وغسل الخلايا بإضافة مخزنة الفوسفات 1X المالحة (PBS). كرر هذه الخطوة ما مجموعه اثنين من يغسل. إضافة طبقة رقيقة من PBS (~ 750 ميكرولتر لطبق 6 سم) لكل حالة "وهمية" المعالجة ولإشعاع المؤين (IR) المعالجة.
  3. استخدام irradiator غاما للكشف عن الخلايا إلى جرعة واحدة من 10 غراي (غراي) من الأشعة تحت الحمراء. هذا هو التعرض نموذجية بالنسبة لمعظم خطوط الخلايا. في غطاء محرك السيارة، وإزالة PBS واستبدالها المتوسطة النمو. بدلا من ذلك، وعلاج الخلايا مع بleomycin في 20 ميكروغرام / مل لمدة 2 ساعة.
  4. تغيير المتوسطة على الخلايا كل ساعة 48 -7 2 ​​وتقسيم الخلايا إذا لزم الأمر.
  5. مراقبة الخلايا تحت المجهر الضوئي للتغيرات شكلية (انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي والشكل 2 للصور خلية تمثيلية) وفحص لعلامات هرمة 7-10 د بعد العلاج IR.
    ملاحظة: يصف هذا البروتوكول الشيخوخة الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء. ويمكن أيضا أن الشيخوخة الناجمة عن الضغوط الأخرى، بما في ذلك بليوميسين (انظر أعلاه للشروط)، H 2 O 2 22، 23، 24 أدوية العلاج الكيميائي، ودخان السجائر 25، وتحويل عامل النمو (TGF) -β1 26 و 27، وغيرها من الأساليب 21 و 28 و 29.

3. تلطيخ سلليرة سورية للالمرتبطة الشيخوخة-β غالاكتوزيداز

  1. قبل التلوين، فحص الخلايا تحت المجهر الضوئي لرصد التغيرات المورفولوجية.
    وعادة ما يتم توسيع هرمة الخلايا وشقة، على عكس الخلايا المتكاثرة، التي لديها مورفولوجيا المغزل (انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي والشكل 2 لنتائج ممثل): ملاحظة. الخلايا المتكاثرة يمكن استخدامها كعنصر تحكم السلبية، والخلايا تعامل مع الأشعة تحت الحمراء أو وكيل آخر الضارة DNA (انظر القسم 2) ويمكن استخدام الضوابط الإيجابية.
  2. قياس النشاط SA-β-غال باستخدام الكواشف من مجموعة تجارية (انظر الجدول المواد). ذوبان الجليد عن الكواشف وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة قبل ارتفاع درجات الحرارة بها إلى 37 درجة مئوية.
    1. حساب كمية حل تلطيخ والحل تثبيتي اللازمة.
      ملاحظة: عادة، وحجم 1 مل يكفي لبئر واحدة في لوحة 6 جيدا. الأحجام لوحة مختلفة يمكن استخدامها، ولكن حجم لوحة 6 جيدا هو أهلا وسهلال-مناسبة لإجراء فحص في ثلاث نسخ لكل حالة. عادة ما تقدم هذه الكثافة عدد كاف من الخلايا في الحقل لحساب دون استخدام عدد الزائد من الخلايا.
    2. تمييع الحل 1:10 تلطيخ مع الماء المقطر.
    3. تمييع الحل تثبيتي 01:10 بالماء المقطر.
    4. تشكل حلا 20x وتقييم X-غال (5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) في N، N-ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF، على سبيل المثال، 20 ملغ من X-غال في 1 مل من DMF). لتعظيم استخدام عدة، وقياس من X-غال لكمية المطلوبة لكل فحص ومن ثم إضافة كمية محسوبة من DMF إلى حل. بدلا من ذلك، تخزين الحل السهم عند -20 درجة مئوية في أنبوب محمية خفيفة لمدة شهر واحد. استخدام الوحيد البولي بروبلين (مبهمة) أنابيب للتمييع وتخزين حلول X-غال.
    5. إعداد بيتا غال تلطيخ الحل: 930 ميكرولتر من محلول تلطيخ 1X 10 ميكرولتر من تلطيخ الملحق A، 10 ميكرولتر من تلطيخ الملحق B، و 50 ميكرولتر من 20 ملغ / مل X-gal في DMF. جعل مزيج الرئيسي اعتمادا على عدد الآبار تحتاج إلى أن تكون ملطخة.
  3. إزالة بعناية متوسطة من الخلايا باستخدام ماصة نقل أو ما يعادلها.
  4. غسل بلطف خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة الغرفة 1X PBS.
  5. إضافة 1 مل من 1X تثبيتي حل كل بئر واحتضان لمدة 10-15 دقيقة في RT.
  6. إزالة الحل تثبيتي مع ماصة نقل.
    ملاحظة: الحل تثبيتي (1X) تحتوي على 2٪ الفورمالديهايد و 0.2٪ غلوتارالدهيد، وينبغي التخلص منها باعتبارها نفايات خطرة وفقا لتوصيات مكتب سلامة المختبرات.
  7. يغسل بلطف الخلايا مرتين مع 1X PBS.
  8. إزالة PBS تماما وإضافة 1X β-غال حل تلطيخ إلى الآبار (1 مل / بئر من لوحة 6 جيدا). تغطية لوحة تماما مع رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة 24 - 48 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية (ويفضل في حالة عدم وجود CO 2، وهذا يمكن أن تقلل من درجة الحموضة في المخزن المؤقت وتؤثر على تلطيخ).
    1. تحقق الخلايا في 24 ساعة لتلطيخ، وإذا كان وصمة عار خفيفة جدا، واحتضان لمدة 24 ساعة أخرى.
  9. بعد فترة حضانة، وإزالة الحل β-غال واستبدالها مع 1X PBS.
    ملاحظة: هذه الخطوة يزيل بعض من لون الخلفية عند التصوير، ويمنع أيضا إراقة الخطرة من الحل X-غال.
    ملاحظة: تخلص من الحل β-غال بشكل صحيح، وفقا لتوصيات مكتب سلامة المختبرات.
  10. فحص الخلايا على مجهر الضوء مع كاميرا مثبتة باستخدام الهدف 10X أو أعلى. خلايا SA-بيتا-غال إيجابية ستكون الأزرق. الحصول على العدد المطلوب من الصور للتجربة. إذا عد النسبة المئوية للخلايا SA-β-غال إيجابية، والحصول على العدد المناسب من الصور لتقدير (5>) لكل بئر. تأكد من أن الصور هي غير متداخلة من مختلف المجالات وجهة نظر داخل كل بئر.
  11. حساب عدد الحاملين لSA-β-غال (الأزرق) خلايا مقابل العدد الإجمالي للخلايالحساب النسبة المئوية للخلايا SA-β-غال إيجابية. عد> 100 خلية لكل حالة.
    ملاحظة: يمكن أيضا التمثيلية الصور أن تستخدم لشخصيات. لاحظ أن confluency الخلية أمر بالغ الأهمية إذا خلايا العد، وخلايا كثيرة تجعل من الصعب تمييز كل خلية وعدد قليل جدا قد لا تعطي عدد كاف من الخلايا للالكمي والاحصاءات. صور لشخصيات للنشر هي في أفضل قرار إذا حفظها كملفات TIFF.، على الرغم من ملفات بامتداد .jpeg هي أيضا مناسبة. يجب أن تكون الصور الملونة 300 نقطة في البوصة.

4. خلايا تلطيخ لγ-H2AX

  1. لوحة الخلايا من الأقسام 1 أو 2 على coverslips الزجاج في 24 لوحة جيدا.
  2. في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X. شطف بعناية، وخلايا هرمة لا تلتزم بشكل جيد لcoverslips ويمكن بسهولة إزالة أثناء يغسل. بدلا من ذلك، مباشرة إصلاح الخلايا دون غسل.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع الطازجة الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ في برنامج تلفزيوني ل10 دقيقة في RT.
  4. إزالة الحل وpermeabilize الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
  5. إزالة الحل وكتلة في 5٪ FBS في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة في RT.
  6. احتضان مع مكافحة الفوسفات γ-H2AX (Ser139) وFITC المترافقة في 5٪ FBS / PBS لمدة 2 ساعة عند 37 ° C أو O / N عند 4 درجات مئوية. احم من الضوء.
  7. يغسل 3 - 6X مع PBS عند 37 درجة مئوية لمدة ما مجموعه 30 - 60 دقيقة.
  8. وصمة عار مع دابي (المخفف 1: 15،000 في PBS) لمدة 10 دقيقة في RT.
  9. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
  10. يغسل بسرعة بالماء لإزالة الأملاح وجبل ساترة على شريحة زجاجية باستخدام 3-5 ميكرولتر من antifade كاشف. بدلا من ذلك، استخدام حل المتصاعدة التي تحتوي دابي.
  11. السماح لها الجافة O / N وتصور الخلايا الملون على المجهر الفلورسنت أو متحد البؤر باستخدام الهدف 63X أو أعلى.
  12. تحديد بؤر γ-H2AX باستخدام أي من طريقتين موضح أدناه. يسجل لأي بروتوكول بالعين باستخدام المجهر الفلورسنت. من الناحية المثالية، لناعصام المجهر متحد البؤر. خذ Z-أقسام وتتكثف في طائرة واحدة من أجل رؤية جميع البؤر كشفها (صور تمثيلية لتلطيخ γ-H2AX في نشر وهرمة الخلايا هو موضح في الشكل 3). عد البؤر بالعين باستخدام برنامج التصوير. بشكل عام، ~ 100-200 نوى كافية لفرز الأصوات.
    1. لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي لديها بؤر جاما-H2AX إيجابية، عد كل خلية لديها تركيز واحد على الأقل وضوحا والقسمة على العدد الكلي للنواة ملطخة دابي.
    2. لتحديد عدد من البؤر γ-H2AX، والاعتماد على بؤر γ-H2AX لكل خلية.
      ملاحظة: قد تختلف مستويات γ-H2AX اعتمادا على الضغوطات معين أو الضرر الذي يتسبب الشيخوخة.

5. خلايا تلطيخ لSAHF علامات

ملاحظة: خلايا هرمة الإنسان وغالبا ما يكون المناطق النووية المكثف DNA / لونين. في خلايا هرمة، هذه المناطق كروماتين مغايرويعتقد أن تحول دون التعبير عن الجينات الداعمة للانتشار، مثل أفراد الأسرة E2F. SAHF التي يمكن تصور إعادة تنظيم دابي. من خلال وجود علامات هيستون المرتبطة المغاير، بما في ذلك DI- وثلاثي مثيلة من Lys9 على هيستون H3 (H3K9Me2 وH3K9Me3)؛ والبروتينات إعادة تنظيم الكروماتين، بما في ذلك HP1 البروتين المغاير 1 (HP1)، هيرا (هيستون كاظمة A)، وASF1a (مكافحة إسكات وظيفة-1A) لونين 30. لقد اخترت استخدام نموذج الشيخوخة الناجمة عن الجين الورمي (OIS)، كما SAHF هو أكثر بروزا في نماذج OIS 30. خلايا IDH4 تتكاثر في وجود ديكساميثازون بسبب وجود SV40 كبير T مستضد ولكنها تصبح هرمة بعد زوال ديكساميثازون من متوسط 31. يمكن الكشف عن SAHF التي كتبها دابي تلطيخ وتلطيخ مع الأجسام المضادة ضد علامات محددة المذكورة أعلاه. هنا، نحن تصف دابي وH3K9Me2 تلطيخ لvisualizatأيون من SAHF في الخلايا 28.

  1. زراعة خلايا IDH4 في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 1 ميكروغرام / مل ديكساميثازون. للحث على الشيخوخة، وإزالة ديكساميثازون وتغيير المتوسطة بحيث يحتوي جردت الفحم FBS. بعد تزايد ل~ 10 يوما في هذه الوسيلة الجديدة، والخلايا IDH4 تصبح هرمة 31.
  2. خلايا IDH4 لوحة أو خلايا من الأقسام 1 أو 2، وصفت أعلاه، على coverslips الزجاج في 24 لوحة جيدا.
  3. في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X. شطف بعناية، وخلايا هرمة لا تلتزم بشكل جيد لcoverslips ويمكن إزالتها بسهولة أثناء يغسل. بدلا من ذلك، مباشرة إصلاح الخلايا دون غسل.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع الطازجة الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT.
  5. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
  6. إزالة الحل وpermeabilize الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  7. غسل الخلايا مع 1XPBS. إزالة برنامج تلفزيوني ومنع لل coverslips بإضافة عازلة تمنع تحتوي على 3٪ BSA (ث / ت) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT. تصفية دائما الحلول التي تحتوي على قبل BSA لاستخدامها لإزالة الجسيمات.
  8. إزالة عازلة تمنع واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية ضد علامات SAHF مثل أضداد H3KMe2 (الشكل 4، انظر الجدول المواد للحصول على التفاصيل). تمييع الأجسام المضادة في المخزن الحجب واحتضان لمدة 1-2 ساعة عند RT.
  9. إزالة حل الأجسام المضادة الأولية وغسل لل coverslips 3 مرات مع 1٪ (ت / ت) تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
  10. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة العازلة (مواد الجدول)، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. احم من الضوء.
  11. غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS. وصمة عار مع دابي (المخفف 1: 15000 في برنامج تلفزيوني، انظر الجدول مواد) لمدة 10 دقيقة في RT.
  12. غسل لل coverslips 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
    1. يغسل بسرعة بالماء لإزالة الأملاح منالثانية تركيب كل ساترة على شريحة زجاجية باستخدام 3-5 ميكرولتر من antifade كاشف. بدلا من ذلك، استخدام حل المتصاعدة التي تحتوي دابي.
    2. دعونا O جاف / N وتصور الخلايا الملون على المجهر الفلورسنت أو متحد البؤر باستخدام الهدف 63X أو أعلى (انظر ممثل النتائج في الشكل 4). قياس SAHF كما هو موضح في القسم 4.
      ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية isotype السيطرة أو أي الأجسام المضادة الأولية (أي الثانوية وحدها) وينبغي أن تستخدم كعنصر تحكم السلبية لتلطيخ المناعي.

6. تحليل البروتينات المرتبطة الشيخوخة عن طريق Immunoblotting

ملاحظة: يتميز النمط الظاهري الشيخوخي من upregulation من المنظمين دورة الخلية، بما في ذلك INK4A P16، P21، والبروتين p53. وهذا البروتوكول وصف الكمي لمستويات هذه البروتينات في الخلية لست]. هذه التقنيات يمكن استخدامها لتقييم الشيخوخة الناجمة عن استخدام مجموعة متنوعة منالأساليب 21 و 28 و 29.

  1. حمل الشيخوخة الخلوية كما هو موضح في البندين 1 و 2 أو باستخدام طريقة أخرى 21 و 28 و 29. لتحليل علامات الشيخوخة الخلوية، لوحة الخلايا في 6 سم أطباق وتحليل كل من البروتين والحمض النووي الريبي في وقت واحد (انظر القسم 7 للحصول على تعليمات RNA العزلة).
  2. إزالة مستنبت الخلية. وضع الخلايا على صينية من الجليد.
    1. غسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X البارد. إمالة طبق لضمان أن جميع PBS ويستنشق وذلك لتكون دقيقا من حيث الكميات المستخدمة لهذا الإجراء.
    2. بعد الشفط غسل الماضي من برنامج تلفزيوني، إضافة 200 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X (لطبق 6 سم) إلى الطبق. تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة الخلية.
    3. ماصة الخلية / PBS الخليط في أنبوب ريبونوكلياز خالية لعزل الحمض النووي الريبي. يستغرق ما يقرب من 150 و# 181؛ L من هذا الخليط وماصة عليه في أنبوب جديد. وسيتم استخدام هذا قسامة لتحليل البروتين، لذا يجب التأكد من ماصة نفس الكمية من كل أنبوب.
  3. ليز الخلايا بإضافة 75-100 ميكرولتر من عينة العازلة 2X Laemmli لتعديل (60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 12.5٪ الجلسرين، 2٪ SDS، 5٪ β-المركابتويثانول (BME)، وبرموفينول الأزرق، ويمكن أن تكون على النحو دفعة كبيرة، aliquoted، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام) أو عينة العازلة ما يعادلها.
    1. بدلا من ذلك، ليز الخلايا في 75-100 ميكرولتر من تحلل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلية. إزالة وطاف ماصة في أنبوب نظيفة. بروتين فحص برادفورد أو فحص البروتين يعادل يمكن استخدامها على لست] لضمان تحميل متساو من البروتين.
      لا يمكن إجراء فحوصات على عينات البروتين هي lysed في المخزن عينة: ملاحظة.
    2. أخرج ~ 25 ميكرولتر من المحللة وإضافته إلى 15 ميكرولتر من عينة العازلة 2X. ماصة والقيامسفل في المخزن المؤقت عينة لليز الخلايا.
      ملاحظة: يمكن تعديل وحدات التخزين من تحلل العازلة أو عينة العازلة اعتمادا على التقاء الخلايا. إذا كانت العينة "لزج" بسبب الناشر النووي، إضافة المزيد من عينة العازلة أو برنامج تلفزيوني لتخفيف. ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. تغلي العينات لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية في كتلة الحرارة (أو المعدات ما يعادلها) وتحميل ~ 40 ميكرولتر من العينة هي lysed في المخزن العينة على 18٪ هلام تريس، الجلايسين.
    ملاحظة: جل الانحدار (4-15٪) أو 14٪ هلام تريس، جليكاين هي أيضا كافية للكشف عن انخفاض البروتينات الوزن الجزيئي. ويمكن أيضا أنواع مختلفة من المواد الهلامية الأكريلاميد يمكن استخدامها، ولكن تأكد من أن المواد الهلامية ونظام كافية للكشف عن انخفاض البروتينات الوزن الجزيئي.
    1. تشغيل باستخدام 1X عازلة على التوالي في ثابت 100 فولت لمدة 20 دقيقة (من خلال هلام التراص) و~ 60 دقيقة في 180 V. مراقبة هلام حتى الجبهة صبغ يعمل قبالة أو في الجزء السفلي من هلام بحيث انخفاض الجزيئية البروتينات الوزن لا صالامم المتحدة الخروج من هلام.
  5. نقل هلام الأكريلاميد إلى غشاء PVDF (قبل غارقة مع الميثانول بنسبة 100٪ لتنشيط). إذا فعل نقل الرطب، وهناك حاجة فقط 1 ساعة لنقل (مقابل العادي ~ 1.75 ح). ضبط وفقا لنظام النقل المناسب. يمكن استخدام علامات الوزن الجزيئي الملون قبل مساعدة في تقييم كفاءة النقل.
  6. يغسل الغشاء في الماء. استخدام وصمة عار الشقائقية لمراقبة التحميل على قدم المساواة من العينات. غسل الشقائقية قبالة مع الماء.
    1. منع الغشاء في الحليب الجاف 5٪ الخالي من الدسم في TBST (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.1٪ توين 20) لمدة 1 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية مع الإثارة.
  7. غسل وصمة عار مرة واحدة مع TBST واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في 5٪ الحليب TBST (انظر الجدول مواد التخفيفات والتوصيات الضد) لمدة 1 ساعة عند RT.
  8. إجراء عمليتين يغسل سريعة مع TBST ثم يغسل مرتين على شاكر لمجموعه ~ 30 دقيقة (~ 15 دقيقة كان كلح).
  9. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 40 دقيقة في RT. كرر الخطوة 6.10.
  10. احتضان مع تقدم طازجة الركيزة طخة غربية وتطوير الفيلم أو قراءتها على القارئ التوهج.
  11. طخة مناعية التحقيق مع P16 INK4A الأجسام المضادة أولا (الشكل 5). تجريد الغشاء التي يحتضنها لمدة 15 دقيقة مع الماء، لمدة 15 دقيقة مع 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم، و 15 دقيقة بالماء. تواصل مع الخطوة 6.9 باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة P21.
  12. تجريد الغشاء باستخدام 62.5 ملي تريس، HCL الرقم الهيدروجيني 6.8 و 2٪ SDS مع 300 ميكرولتر من أضاف حديثا BME لكل 50 مل من تجريد الحل.
  13. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ويغسل نطاق واسع مع TBS ثم TBST. التحقيق مع أضداد أكتين أو مكافحة GAPDH لعناصر البروتين التحميل (يبين الشكل 5 نتائج ممثل).
    ويمكن أيضا أن يتم تقييم مستويات البروتين p53 على نفس الأغشية: ملاحظة. ومع ذلك، منذ البروتين p53 هو الوزن الجزيئي العالي، وأفضل حل هو على هلام نسبة أقل (على سبيل المثال، 10٪ تريس، جليكاين أو هلام التدرج (4-15٪)). ويمكن أيضا أن مستويات البروتين من علامات هرمة أخرى يتم تقييمها من قبل لست] immunoblotting، بما في ذلك γ-H2AX وعلامات SAHF.

7. تحليل مستويات مرنا من الشيخوخة علامات

ملاحظة: عندما عزل RNA، تأكد من أن أسطح العمل يتم تنظيف مع حلول إزالة ريبونوكلياز أو ما يعادلها وأن المواد كلها ريبونوكلياز خالية.

  1. باستخدام خلية / PBS خليط من الخطوة 4.2، إضافة 1 مل من الحمض النووي الريبي حل استخراج ودوامة لمدة 30 ثانية (يجب أن يكون هناك كتل مرئية أو الحطام الخلوي).
  2. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم ويهز بقوة لمدة 15 ثانية.
  3. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة (> 15000 x ج) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  4. إزالة ~ 400 ميكرولتر من الطبقة المائية كبار RNA وماصة عليه في أنبوب microfuge جديدة.
  5. إضافة 400 ميكرولتر من الأيزوبروبانول (1: 1 مع الحجم الكلي للطبقة المائية pipetted في الخطوة السابقة) و 4 ميكرولتر من العلاقات العامةecipitant إلى طبقة RNA.
  6. الطرد المركزي لمدة 15-30 دقيقة في أقصى سرعة (> 15000 x ج) و 4 ° C إلى بيليه RNA.
  7. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول 75٪ الجليد الباردة.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة (> 15000 x ج) و 4 ° C.
  9. إزالة طاف وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة على السرعة القصوى (> 15000 x ج) و 4 ° C.
  10. ماصة للخروج الكثير من السوائل وقت ممكن والهواء الجاف لمدة 2 دقيقة.
  11. اعادة تعليق في 10 ميكرولتر من 10X العازلة الدناز، 85 ميكرولتر من H 2 O، و 5 ميكرولتر من الدناز 1.
  12. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. إضافة 200 ميكرولتر عازلة NT2 (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgCl 2، و 0.05٪ Nonidet P-40) وإضافة 300 ميكرولتر من الطبقة السفلى من حامض الفينول CHCl 2.
  14. دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على السرعة القصوى (> 15000 x ج).
  15. جمع 250 ميكرولتر من الطبقة العليا RNA (2 × 125 ميكرولتر)، إضافة 25ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 5.2، 625 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ المثلج، و 5 ميكرولتر من مرسب. تخلط جيدا ويعجل O / N عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  16. في اليوم التالي، مزيج وتدور في أقصى سرعة (> 15000 x ج) و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل طاف.
  17. كرر الخطوات من 6،8-6،11.
  18. إعادة تعليق بيليه في 12 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن أن تستخدم الإجراءات ومجموعات RNA العزلة أخرى كذلك.
  19. أداء النسخ العكسي مع hexamers عشوائي وSSII عكس الناسخ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: نظرا لكمية قليلة من الحمض النووي الريبي معزولة عن خلايا هرمة، فمن الأفضل لاستخدام كل من الحمض النووي الريبي (12 ميكرولتر) لتركيب النسخ العكسي. بدلا من ذلك، RNA يمكن قياسها كميا باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وكميات متساوية من RNA يمكن أن تستخدم في النسخ العكسي.
  20. تحليل مستويات مرنا في الوقت الحقيقي باستخدام كمية QPCR (RT-QPCR) amplificأوجه وPCR مزيج الرئيسي-SYBR الأخضر مع الاشعال الجينات المحددة.
    1. كما هو الحال في نموذجي رد فعل RT-QPCR، تمييع [كدنا 01:30 (في ريبونوكلياز / المياه خالية من الدناز) وإضافة 3 ميكرولتر إلى الوقت الحقيقي لوحة 96-جيدا لتحسين دقة pipetting ل. إعداد مزيج رد فعل سيد جين معين إلى الأمام وعكس الاشعال (تركيز 2.5 ميكرومتر، إضافة 5 ميكرولتر / رد فعل)، مزيج PCR-SYBR الأخضر (6.25 ميكرولتر / رد فعل، واستخدام أقل من توصية الشركة الصانعة)، و 5.75 ميكرولتر من ريبونوكلياز / المياه خالية من الدناز لحجم رد الفعل النهائي من 20 ميكرولتر (17 ميكرولتر من الاشعال /-SYBR الأخضر / المياه و 3 ميكرولتر من [كدنا]).
    2. أداء RT-QPCR التضخيم باستخدام الوقت الحقيقي PCR الآلة؛ اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: قائمة الإنسان المصادق إلى الأمام وعكس الاشعال الوقت الحقيقي يمكن العثور عليها في الجدول رقم 1. وتشمل هذه الجينات البروتينات SASP وغيرها من علامات الشيخوخة المرتبطة و / أو الجينات. وتظهر نتائج تمثيلية من الشيخوخة الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء في الشكل (6).

8. مستويات البروتين تحديد مقدار SASP

  1. حمل الشيخوخة باستخدام أقسام 1 أو 2 أو باستخدام طريقة أخرى. لوحة الخلايا إما 6 أو 10 سم لوحات، على النحو المبين أعلاه (~ 250000 خلية / 6 سم لوحة أو ~ 650،000 / 10 سم لوحة).
  2. إما مع خلايا 10 د بعد IR العلاج أو مع خلايا هرمة تنسخي (وخلايا المراقبة المناسبة)، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة المصل خالية المتوسطة مع المضادات الحيوية في حجم صغير (2.5 مل لمدة 6 سم أو 5 مل لمدة 10 سم).
  3. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة زراعة الأنسجة. في اليوم التالي، وجمع المتوسطة ووضعها في أنبوب مخروطي على الجليد.
  4. غسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافة 1 مل من التربسين (لطبق 6 سم). عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات لضبط وقت لاحق من التركيزات وفقا لعدد الخلايا.
  5. أجهزة الطرد المركزي في المتوسط ​​لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
  6. FILTإيه المتوسطة باستخدام فلتر حقنة 0.45 ميكرون.
  7. قسامة المتوسطة وتجميد في -80 درجة مئوية حتى استخدامها أو الفحص مباشرة باستخدام ELISA أو فحوصات مماثلة.
  8. حساب عدد الخلايا تركيز / مل من خلال اتخاذ مجموع عدد الخلايا / حجم المتوسطة التي تم جمعها.
  9. إجراء الفحص المناسب انزيم مرتبط المناعي (ELISA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. انظر الجدول مواد لمجموعات ELISA الموصى بها لمعايرة لIL-6، IL-8، GROα، وغيرها من السيتوكينات / كيموكينات (الشكل 6B).
  10. للتأكد من أن العوامل التي يتم قياسها ضمن نطاق خطية من عدة ELISA، وجعل التخفيفات من المتوسط ​​خلية الشيخوخي مقارنة المتوسطة خلية المتكاثرة. حساب لهذه التخفيفات وحجم عند حساب كمية IL-6. للحصول على كمية من IL-6 يفرز للخلية يوميا، وحساب قيمة IL-6 التي تم الحصول عليها من عدة (في الحكم) في تركيز خلية المخفف لكل مليلتر (الابام الخطوة 7.8).
    ملاحظة: أساليب أخرى، مثل المصفوفات خلوى، ويمكن استخدامها للكشف عن مستويات البروتين SASP وقد تكون مناسبة لفحص عدد كبير من العوامل SASP. مستويات البروتين من العوامل SASP قد تختلف بناء على الوقت بعد تحريض الشيخوخة، ونوع من الخلايا، أو نوع من الشيخوخة التي يسببها.

النتائج

أرقام 2-6 تظهر نتائج ممثلة من تلطيخ SA-β-غال. تلطيخ لγ-H2AX وSAHF. تقييم مستويات البروتين من INK4A P16، P21، والبروتين p53. ومرنا ومستويات البروتين من جزيئات هرمة المصاحب. تحدث زيادة تلطيخ SA-β-غال مع تنسخي والحمض النووي الناجم عن الضرر الشيخوخة. أ...

Discussion

هنا، التي وصفناها طرق تنسخي والحمض النووي الضرر الناجم عن الشيخوخة باستخدام الخلايا الليفية مضاعفا الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين تقنيات لقياس البروتين ومستويات مرنا من مختلف البروتينات المرتبطة الشيخوخة، فضلا عن تلطيخ لSA-β-غال ولDNA-الضرر علامة γ-H2AX. هذه الب?...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للشيخوخة. الكتاب أود أن أشكر ميريام غوروسب وقطب عبدالمحسن بالنسبة لكثير من المناقشات المفيدة حول الشيخوخة وقطب عبدالمحسن للأيضا قراءة نقدية للمخطوطة. كما نشكر أعضاء المختبر لدينا، خاصة دوغلاس دلوزين لقراءة نقدية للمخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Tris-glycine gelsInvitrogenXP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3AmbionAM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibodyInvitrogenA110311:300 dilution
Cell liftersCorning Inc.3008Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibodyAmershamNA931V
ECL Plus Western Blotting SubstratePierce32132ECL
DAPIMolecular ProbesMP01306stock 5 mg/mL in dH2O
GAPDH antibodySanta Cruzsc-322331:1,000 - 5,000 dilution
GlycoBlueAmbionAM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibodyAbcam12201:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assayR&D systemsD6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assayR&D systemsD8000C
Human GROa Quantikine ELISA assayR&D systemsDRG00
N-N-dimethylformamide SigmaD4551DMF
p16 monoclonal antibodyBD Biosciences51-1325gr1:500 dilution
p21 monoclonal antibodyMillipore05-3451:750 dilution
p53 monoclonal antibodySanta Cruzsc-1261:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibodyCell Signaling97191:2,000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix Applied Biosystems4367659
Pre-stained molecular weight markersBiorad161-0374
ProLong Gold Antifade InvitrogenP36930
PVDF membrane Thermo Scientific88518
Senescence β-Galactosidase Staining KitCell Signaling9860
TRIzolAmbion/Life Tech10296028

References

  1. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  3. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
  4. Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
  5. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  6. Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
  7. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  8. Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
  9. Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
  10. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  11. Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
  12. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
  13. Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
  14. Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
  15. Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
  16. Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
  17. Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
  18. Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
  19. Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
  20. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  21. Rubio, M. A., Kim, S. -. H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
  22. Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
  23. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
  24. Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  25. Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
  26. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  27. Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
  28. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
  29. Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
  30. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
  31. Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
  32. Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
  33. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
  34. Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
  35. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  36. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  37. Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  38. Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
  39. Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
  40. Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
  41. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
  42. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  43. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  44. Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
  45. Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
  46. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  47. Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123 SASP SA H2AX P16 P21 p53 IL6 SAHF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved