Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

Riepilogo

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Abstract

In risposta allo stress cellulare o danno, le cellule proliferanti possono indurre un programma specifico che avvia uno stato di arresto del ciclo cellulare a lungo termine, chiamato senescenza cellulare. Accumulo di cellule senescenti verifica con l'invecchiamento organismal e mediante coltura continua in vitro. cellule senescenti influenzano molti processi biologici, compreso lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti e la rigenerazione, soppressione del tumore, e l'invecchiamento. Caratteristiche di cellule senescenti includono, ma non sono limitati a, maggiore attività β-galattosidasi senescenza-associato (SA-β-gal); p16 ^INK4a, p53, p21 e livelli; Livelli più elevati di danno al DNA, tra γ-H2AX; la formazione di senescenza associata Eterocromatina Foci (SAHF); e l'acquisizione di un senescenza associata secretoria fenotipo (SASP), un fenomeno caratterizzato dalla secrezione di alcune citochine pro-infiammatorie e molecole di segnalazione. Qui, descriviamo i protocolli sia per replicativo esenescenza DNA danno-indotta in cellule coltivate. Inoltre, si segnalano tecniche per monitorare il fenotipo senescente utilizzando diversi marcatori senescenza-associata, tra SA-β-gal, γ-H2AX e SAHF colorazione, e per quantificare i livelli di proteine ​​e mRNA di regolatori del ciclo cellulare e fattori SASP. Questi metodi possono essere applicati alla valutazione della senescenza in vari modelli e tessuti.

Introduzione

Più di mezzo secolo fa, Hayflick e colleghi hanno descritto come le cellule proliferano non trasformata in cultura, ma solo per un periodo limitato di tempo ^1. coltura a lungo termine di fibroblasti umani ha causato le cellule per fermare la proliferazione; tuttavia, erano metabolicamente attiva, e questo è stato chiamato senescenza cellulare. Senescenza può essere utile per inibire la tumorigenesi, ma può anche essere dannoso, in quanto si ritiene contribuiscano alla perdita di capacità rigenerativa che si verifica con l'invecchiamento ^{2, 3.} Cellule senescenti hanno dimostrato di accumularsi nei tessuti come esseri umani ⁴ anni e sono stati implicati in una serie di processi biologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, la riparazione dei tessuti e l'infiammazione legata all'età ^2.

passaging continuo di cellule in coltura induce senescenza replicativa, che è stato collegatodi telomero attrito e instabilità genomica. Varie sollecitazioni cellulari, comprese danno al DNA e oncogeni, possono anche causare senescenza ^3. Senescenza causata da fattori diversi telomere attrito è spesso chiamato da stress o senescenza prematura e dipende generalmente dalla p16 ^INK4A / Rb pathway ^5. Sebbene proliferanti, cellule non trasformate compaiono tipicamente mandrino in forma, cellule senescenti possono essere identificati come aventi determinate caratteristiche, tra cui una TV, ampio morfologia e una maggiore attività β-galattosidasi senescenza-associato (SA-β-gal) (Figure 1 e 2). Cellule senescenti accumulano anche marcatori di danno del DNA, tra cui γ-H2AX (figura 3) ^6, e, potenzialmente, senescenza associata eterocromatina foci (SAHF) (Figura 4) ^7. cellule senescenti hanno livelli elevati di regolatori del ciclo cellulare, tra cui p 16 ^(INK4A p16) e / o p21 e p53 (Figura 5) ^{8, 9.} Inoltre, i dati recenti hanno dimostrato che le cellule senescenti possono avere effetti non autonomi secernendo un numero di citochine pro-infiammatorie e chemochine chiamato senescenza associata secretoria fenotipo (PSAS) ^10. Sebbene questo fenomeno SASP può variare da tipo cellulare a tipo cellulare, in generale, è dimostrato da un aumento di interleuchina-6 (IL-6), IL-8, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), alla crescita α regolata oncogene (GRO-α) e GRO-β, tra gli altri (Figura 6). Lo stress particolare o danni che induce senescenza possono anche influenzare il fenotipo secretorio ^{11, 12, 13.} SASP può essere rilevata misurando i livelli di proteine ​​secrete mediante ELISA o array citochine / proteinas = "xref"> ^{10, 14.} Sebbene i meccanismi post-trascrizionali possono regolare i livelli proteici SASP ^{11, 15, 16, 17,} cambiamenti nei livelli di mRNA possono essere rilevati anche in molti casi. Questi cambiamenti sono generalmente più sensibili e più facile da quantificare rispetto misurazioni del livello di proteine. Altri marcatori senescenti possono anche essere valutati, compresi persistente danno al DNA foci nucleari, detti segmenti di DNA con alterazioni della cromatina rinforzo senescenza (DNA-SCARS) ^18, e vari altri marcatori ^{3, 19, 20.}

Qui, descriviamo comuni tecniche per indurre senescenza in cellule in coltura e per la misura diversi marcatori di senescenza, tra SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, e la proteina e mRNA di senescemolecole SNO-associata.

Protocollo

1. Induzione replicativo senescenza

1. Disgelo basso passaggio fibroblasti diploidi umane (ad esempio, WI-38 e IMR-90) o altre linee cellulari.
   NOTA: Qui, fibroblasti diploidi umane sono stati usati, ma questi protocolli può essere utilizzato per valutare la senescenza in altri tipi di cellule, come cellule endoteliali, epiteliali, o cellule staminali mesenchimali. condizioni di coltura possono essere ottimizzate per i diversi tipi cellulari utilizzati a causa dei diversi tassi di crescita o condizioni di crescita.
   NOTA: Le cellule devono essere proliferare e hanno una morfologia mandrino (vedere Figura 1 per una schematica e la figura 2 per gli esempi). Idealmente, le cellule devono avere un raddoppio della popolazione Livello (PDL) di <30 all'inizio degli esperimenti per evitare di avere eventuali cellule senescenti replicative.
   1. Calcolare la PDL delle cellule utilizzando la seguente equazione PDL = log (N _f / N ₀₎ / log2, dove N è il numero _f cellulare finale e N ₀ è il numero iniziale di cellule seminate ^21.
2. Cultura WI-38 cellule in coltura di Dulbecco modificato (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), aminoacidi non essenziali 1% e l'1% di penicillina / streptomicina.
3. Grow IMR-90 cellule in DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina.
4. Crescere tutte le cellule a 37 ° C e 5% CO _2. continuo crescere le cellule e dividere ogni di 2 - 4 d quando le cellule raggiungono ~ 70 - 80% di confluenza. Monitorare confluenza cella utilizzando un microscopio ottico. Evitare le cellule con una maggiore convergenza, in quanto questo può influenzare la crescita delle cellule a causa del contatto inibizione.
5. Monitorare le cellule con un microscopio ottico per l'aspetto morfologico delle cellule senescenti (vedi figure 1 e 2) e per cui non v'è alcun cambiamento nella PDL da una subcultura all'altro.

2. DNA senescenza danni indotti

1. Cellule piastra (ad esempio, WI-38, IMR-90, o un altro tipo di cellula) ad una densità sparse (cioè ~ 300.000 cellule / 6 cm piatto) in un piatto appropriato per il tipo di analisi (cioè un piatto 6 centimetri per le proteine / marcatori RNA o un piatto 6 pozzetti per SA-β-gal colorazione). Usare le cellule early-passaggio che sono giovani e proliferanti (<30 PDL) e la piastra in modo che le cellule sono più o meno 50 - 60% confluenti il ​​giorno successivo.
2. Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una pipetta di vetro collegato ad un vuoto e lavare le cellule aggiungendo 1x salina tamponata con fosfato (PBS). Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi. Aggiungere un sottile strato di PBS (~ 750 microlitri per un piatto 6 cm) sia una condizione trattata e per un radiazione ionizzante (IR) trattato "finto".
3. Utilizzare un irradiatore gamma per esporre le cellule ad una dose singola di 10 Gray (Gy) di IR; questa è un'esposizione tipica per la maggior parte linee cellulari. In una cappa, togliere il PBS e sostituirlo con terreno di crescita. In alternativa, trattare le cellule con bleomycin a 20 ug / ml per 2 h.
4. Cambiare il medio sulle cellule ogni 48 -7 2 ​​ore e, se necessario dividere le celle.
5. Monitorare le cellule con un microscopio ottico per modifiche morfologiche (vedi Figura 1 per una schematica e la figura 2 per le immagini rappresentative cellulari) e saggio per marcatori senescenti 7 - 10 d dopo il trattamento IR.
   NOTA: Questo protocollo descrive senescenza indotta da IR. Senescenza può anche essere indotta da altre sollecitazioni, comprese bleomicina (vedere sopra per condizioni), H ₂ O ₂ ^{22, 23, 24,} chemioterapici fumo di sigaretta ^25, fattore di crescita trasformante (TGF) -β1 ^{26, 27,} e altri metodi ^{21 , 28, 29.}

3. colorazione Cells per senescenza associata β-galattosidasi

1. Prima della colorazione, esaminare le cellule al microscopio ottico di monitorare i cambiamenti morfologici.
   NOTA: senescente cellule sono tipicamente ingrandite e piatta, a differenza delle cellule proliferanti, che hanno una morfologia mandrino (vedere Figura 1 per una schematica e la figura 2 per i risultati rappresentativi). cellule proliferanti possono essere usate come controllo negativo, e cellule trattate con IR o altro agente danneggiano il DNA (vedi sezione 2) possono essere usati come controlli positivi.
2. Quantificare l'attività SA-β-gal utilizzando reagenti da un kit commerciale (si veda la Tabella Materiali). Scongelare tutti i reagenti e portarli a temperatura ambiente riscaldandoli fino a 37 ° C.
   1. Calcolare la quantità di soluzione colorante e soluzione fissativa necessario.
      NOTA: Tipicamente, un volume di 1 ml è sufficiente per un pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Piatti di diverse dimensioni possono essere usate, ma di dimensioni 6-pozzetti è WELl-adatto ad eseguire un test in triplicato per ogni condizione. Questa densità di solito fornisce un numero sufficiente di cellule per campo di contare senza utilizzare un numero eccessivo di cellule.
   2. Diluire la soluzione 1:10 colorazione con acqua distillata.
   3. Diluire la soluzione fissativo 1:10 con acqua distillata.
   4. Ottenere una soluzione 20x archivio di X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolile-β-D-galattopiranoside) in N, N-dimetilformammide (DMF, ad esempio, 20 mg di X-gal in 1 mL di DMF). Per massimizzare l'utilizzo del kit, dosare X-gal per l'importo necessario per ogni test e quindi aggiungere la quantità calcolata di DMF a dissolversi. In alternativa, conservare la soluzione madre a -20 ° C in un tubo luminoso protetto per un mese. Utilizzare i tubi solo polipropilene (opachi) per diluire e memorizzare soluzioni X-gal.
   5. Preparare β-gal soluzione colorante: 930 ml di soluzione colorante 1x, 10 ml di colorazione supplemento A, 10 ml di colorazione integratore B, e 50 ml di 20 mg / mL X-Gal in DMF. Fare un master mix a seconda di quanti pozzi devono essere macchiato.
3. Rimuovere con attenzione il supporto dalle cellule utilizzando una pipetta di trasferimento o equivalente.
4. lavare delicatamente le cellule una volta con temperatura ambiente PBS 1x.
5. Aggiungere 1 ml di 1x soluzione fissativa ad ogni pozzetto e incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere la soluzione fissativo con una pipetta di trasferimento.
   NOTA: La soluzione fissativo (1x) contiene 2% formaldeide e 0,2% di glutaraldeide e devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi secondo le raccomandazioni dell'ufficio sicurezza in laboratorio.
7. lavare delicatamente le cellule due volte con PBS 1x.
8. Rimuovere il PBS completamente e aggiungere la soluzione di colorazione 1x β-gal ai pozzetti (1 ml / pozzetto di una piastra a 6 pozzetti). Coprire la piastra completamente con foglio di alluminio e incubare per 24 - 48 h in un incubatore a 37 ° (preferibilmente in assenza di CO _2, in quanto questo può abbassare il pH del tampone e incidere colorazione).
   1. Controllare le cellule a 24 ore per la colorazione, e se la macchia è troppo leggero, incubare per altre 24 ore.
9. Dopo il tempo di incubazione, rimuovere la soluzione β-gal e sostituirlo con PBS 1x.
   NOTA: Questo passaggio rimuove alcuni dei colore di sfondo quando l'imaging e impedisce anche fuoriuscita pericolosa della soluzione di X-gal.
   NOTA: Eliminare la soluzione di β-gal correttamente, secondo le raccomandazioni dell'ufficio sicurezza in laboratorio.
10. Esaminare le cellule su un microscopio ottico con una telecamera collegata utilizzando un obiettivo 10x o superiore; cellule SA-β-gal-positivi saranno blu. Acquisire il numero desiderato di immagini per l'esperimento. Se contando la percentuale di cellule SA-β-gal positive, acquisire il numero appropriato di immagini (> 5) per la quantificazione per pozzetto. Assicurarsi che le immagini non si sovrappongono da vari campi di vista all'interno di ciascun pozzetto.
11. Contare il numero di SA-β-gal-positivi (blu), le cellule rispetto al numero di cellule totaliper calcolare la percentuale di cellule SA-β-gal-positivi. Contare> 100 cellule per condizione.
    NOTA: Rappresentante immagini possono essere utilizzati anche per le figure. Si noti che confluenza delle cellule è fondamentale se le cellule che contano, come troppe cellule rendono difficile distinguere ogni cella e troppo pochi non può dare un numero sufficiente di cellule per la quantificazione e le statistiche. Immagini di cifre per la pubblicazione sono alla migliore risoluzione se salvato come file TIFF, anche se i file .jpeg sono adatti anche. Le immagini a colori devono essere di 300 dpi.

4. Cellule colorazione per γ-H2AX

1. Piastra le cellule da sezioni 1 o 2 su vetrini in una piastra a 24 pozzetti.
2. Il giorno dopo, lavare le cellule con PBS 1x. Sciacquare con cura, come le cellule senescenti non aderiscono bene al coprioggetto e possono essere facilmente rimossi durante i lavaggi. In alternativa, fissare direttamente le cellule senza lavaggio.
3. Rimuovere il PBS e fissare le cellule con appena preparato formaldeide 3,7% in PBS per10 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione e permeabilize le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS per 10 min.
5. Rimuovere la soluzione e blocco 5% FBS in PBS per 2 ore a RT.
6. Incubare con anticorpi anti-fosfo-γ H2AX (Ser139) e FITC coniugato in 5% FBS / PBS per 2 ore a 37 ° C o O / N a 4 ° C. Proteggere dalla luce.
7. Lavare 3 - 6x con PBS a 37 ° C per un totale del 30 - 60 min.
8. Macchia con DAPI (diluito 1: 15.000 in PBS) per 10 minuti a RT.
9. Lavare 3x con PBS.
10. Lavare rapidamente con acqua per rimuovere i sali e montare il vetrino su un vetrino utilizzando 3 - 5 ml di reagente antifade. In alternativa, utilizzare una soluzione di montaggio contenente DAPI.
11. Lasciare asciugare O / N e visualizzare le cellule colorate su un microscopio a fluorescenza o confocale utilizzando un obiettivo 63X o superiore.
12. Quantificare fuochi γ-H2AX utilizzando uno dei due metodi descritti di seguito. Punteggio per entrambi i protocolli ad occhio utilizzando un microscopio a fluorescenza. Idealmente, ciEA microscopio confocale. Prendere Z-sezioni e condensare in un unico piano per visualizzare tutti foci rilevabile (immagini rappresentative per γ-H2AX colorazione nelle cellule proliferanti e senescenti sono mostrati in figura 3). Contare il foci ad occhio utilizzando software di imaging; in generale, ~ 100 - 200 nuclei sono sufficienti per il conteggio.
    1. Per quantificare la percentuale di cellule che hanno foci γ-H2AX-positivi, contare ogni cella che abbia almeno un fuoco visibile e dividere per il numero totale di nuclei DAPI-macchiati.
    2. Per quantificare il numero di γ-H2AX focolai, contare il γ-H2AX focolai per cella.
       NOTA: I livelli di γ-H2AX possono variare a seconda delle condizioni di stress o danno specifico che ha indotto la senescenza.

5. Le cellule colorazione per SAHF Marcatori

NOTA: cellule senescenti umane hanno spesso regioni nucleari di condensato DNA / cromatina. In cellule senescenti, queste regioni heterochromaticsi pensa di inibire l'espressione di geni di proliferazione di promozione, come i membri della famiglia E2F. SAHF può essere visualizzata dalla riorganizzazione di DAPI; dalla presenza di segni istone eterocromatina associati, compreso il di- e tri-metilazione di Lys9 su istone H3 (H3K9Me2 e H3K9Me3); e da proteine cromatina riorganizzazione, tra HP1 eterocromatina proteina 1 (HP1), HIRA (istone repressore A), e ASF1a (anti-silenziamento funzione-1a) per cromatina ^30. Abbiamo scelto di utilizzare un modello di senescenza oncogene-indotta (OIS), come SAHF è più evidente nei modelli OIS ^30. Cellule IDH4 proliferano in presenza di desametasone per la presenza di grandi antigene T di SV40 ma diventano senescente dopo la rimozione del desametasone dal mezzo ^31. SAHF può essere rilevato da colorazione DAPI e dalla colorazione con anticorpi contro marcatori specifici elencati sopra. Qui, descriviamo DAPI e H3K9Me2 colorazione per la visualizatione di SAHF in cellule ^28.

1. Crescere le cellule IDH4 in DMEM supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 1 ug / mL di desametasone. Per indurre senescenza, rimuovere il desametasone e cambiare il supporto in modo che contenga carbonella-spogliato FBS; dopo la crescita di ~ 10 giorni in questo nuovo mezzo, le cellule diventano senescenti IDH4 ^31.
2. cellule IDH4 piastra o cellule da sezioni 1 o 2, sopra descritte, su vetrini in una piastra a 24 pozzetti.
3. Il giorno dopo, lavare le cellule con PBS 1x. Sciacquare con cura, come le cellule senescenti non aderiscono bene al coprioggetto e possono essere facilmente rimossi durante i lavaggi. In alternativa, fissare direttamente le cellule senza lavaggio.
4. Rimuovere il PBS e fissare le cellule con appena preparato formaldeide 3,7% in PBS per 10 minuti a RT.
5. Lavare le cellule 3 volte con PBS 1x.
6. Rimuovere la soluzione e permeabilize le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS per 5 min.
7. Lavare le cellule con 1xPBS. Rimuovere il PBS e bloccare i coprioggetti aggiungendo tampone bloccante contenente 3% BSA (w / v) in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. filtrata sempre soluzioni contenente BSA prima dell'uso per rimuovere il particolato.
8. Rimuovere il tampone di bloccaggio e incubare le cellule con anticorpi primari contro marcatori SAHF come anticorpi anti-H3KMe2 (Figura 4; vedere la Tabella Materiali per i dettagli). Diluire gli anticorpi in tampone bloccante e incubare per 1 - 2 ore a RT.
9. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare i coprioggetti 3 volte con 1% (v / v) Triton X-100 in PBS.
10. Diluire gli anticorpi secondari in tampone bloccante (materiali Tabella) e incubare per 1 ora a RT. Proteggere dalla luce.
11. Lavare le cellule due volte con PBS 1x. Macchia con DAPI (diluito 1: 15.000 in PBS, vedi la Tabella Materiali) per 10 min a RT.
12. Lavare i coprioggetti 3x con PBS 1x.
    1. Lavare rapidamente con acqua per rimuovere i sali unnd montare ogni vetrino su un vetrino utilizzando 3 - 5 ml di reagente antifade. In alternativa, utilizzare una soluzione di montaggio contenente DAPI.
    2. Lasciare asciugare O / N e visualizzare le cellule colorate su un microscopio a fluorescenza o confocale utilizzando un obiettivo 63X o superiore (vedere i Risultati rappresentativi in Figura 4). Quantificare il SAHF come descritto nella Sezione 4.
       NOTA: isotipo anticorpi primari controllo o nessun anticorpo primario (cioè secondario solo) dovrebbero essere utilizzati come controllo negativo per immunofluorescenza.

6. Analisi Proteine ​​senescenza associate mediante immunoblotting

NOTA: Il fenotipo senescente è caratterizzata dalla sovraregolazione di regolatori del ciclo cellulare, tra cui p16 ^INK4A, p21, e p53. Questo protocollo descrive la quantificazione dei livelli di queste proteine ​​in lisati cellulari. Queste tecniche possono essere utilizzate per valutare senescenza indotta utilizzando una varietà diMetodi ^{21, 28, 29.}

1. Indurre senescenza cellulare come descritto nelle sezioni 1 e 2 o utilizzando un altro metodo ^{21, 28, 29.} Per analizzare i marcatori senescenza cellulare, le cellule piastra in 6 piatti cm e analizzare sia le proteine ​​e l'RNA contemporaneamente (si veda la Sezione 7 per le istruzioni di isolamento RNA).
2. Rimuovere il terreno di coltura cellulare. Mettere le cellule su un vassoio di ghiaccio.
   1. Lavare le cellule 2 volte con PBS freddo 1x. Inclinare il piatto per assicurare che tutto il PBS viene aspirato in modo da essere il più preciso in termini di volumi utilizzati nella procedura.
   2. Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio di PBS, aggiungere 200 ml di PBS freddo 1x (a 6 centimetri piatto) al piatto. Raschiare le cellule utilizzando un raschietto cellulare.
   3. Pipettare la miscela / PBS cellule in una provetta RNasi-free per l'isolamento dell'RNA. Prendere circa 150 &# 181; L di questa miscela e pipetta in un nuovo tubo. Tale aliquota viene utilizzata per l'analisi di proteine, in modo da essere sicuri di pipetta la stessa quantità da ogni provetta.
3. Lisare cellule mediante aggiungendo 75 - 100 pl di tampone campione di 2x Laemmli modificato (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 12,5% glicerolo, 2% SDS, 5% β-mercaptoetanolo (BME), e blu di bromofenolo, può essere costituita come un grande rotolo, aliquotati e conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso) o un tampone campione equivalente.
   1. In alternativa, lisare le cellule nel 75 - 100 pl di tampone di lisi e centrifugare a 15.000 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Rimuovere il surnatante e pipetta in una provetta pulita. Un Metodo di Bradford o un saggio proteico equivalente possono essere utilizzati su lisati per assicurare il carico uguale di proteina.
      NOTA: saggi di proteine ​​non possono essere eseguite su campioni lisati in tampone campione.
   2. Estrarre ~ 25 microlitri di lisato e aggiungerlo a 15 ml di tampone campione 2x. Pipetta e farewn nel tampone campione per lisare le cellule.
      NOTA: I volumi di tampone di lisi o tampone campione possono essere regolati a seconda confluenza cellulare. Se il campione è "appiccicosa" per lisi nucleare, aggiungere più tampone campione o PBS per diluire. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso.
4. Bollire i campioni per 5 min a 95 ° C su un blocco di calore (o dispositivo equivalente) e carico ~ 40 microlitri di campione lisato in tampone campione su un gel Tris-Glicina 18%.
   NOTA: Un gel gradiente (4-15%) o un gel Tris-Glicina 14% sono sufficienti anche per rilevare proteine ​​a basso peso molecolare. Diversi tipi di gel di acrilammide possono anche essere usati, ma garantiscono che i gel e sistema sono adeguate per rilevare proteine ​​a basso peso molecolare.
   1. Eseguito utilizzando 1x tampone di corsa ad una costante 100 V per 20 minuti (attraverso il gel di impilamento) e ~ 60 minuti a 180 V. Monitorare il gel in modo che il fronte del colorante scorre appena fuori o è al fondo del gel in modo che la bassa molecolare proteine ​​peso no run off del gel.
5. Trasferire il gel di acrilammide a una membrana PVDF (pre-impregnato con 100% metanolo per attivare). Se facendo un trasferimento bagnato, solo 1 h è necessaria per il trasferimento (rispetto al normale ~ 1,75 h). Regolare di conseguenza per il sistema di trasferimento adeguato; utilizzando marcatori di peso molecolare pre-tinto può aiutare a valutare l'efficienza di trasferimento.
6. Lavare la membrana in acqua. Utilizzare una macchia Ponceau per controllare il carico uguale di campioni. Lavare il Ponceau con acqua.
   1. Bloccare la membrana nel latte secco 5% non grasso in TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, e 0,1% Tween-20) per 1 ora a RT o O / N a 4 ° C con agitazione.
7. Lavaggio tamponare una volta con TBST e incubare con l'anticorpo primario diluito in TBST 5% latte (vedere la Tabella Materiali per diluizioni e raccomandazioni anticorpo) per 1 ora a RT.
8. Eseguire due lavaggi rapidi con TBST e poi lavare due volte su un agitatore per un totale di circa 30 min (~ 15 min ognuno erah).
9. Incubare con un anticorpo secondario per 40 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il punto 6.10.
10. Incubare con fresco substrato Western blot e sviluppare la pellicola o leggere su un lettore di chemiluminescenza.
11. Immunoblot sonda con p16 anticorpi ^INK4A primi (Figura 5). Striscia la membrana incubando per 15 minuti con acqua, 15 minuti con 0,2 N NaOH, e 15 minuti con acqua. Continuare con il punto 6.9 utilizzando anticorpi anti-p21.
12. Striscia la membrana utilizzando 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 e 2% SDS con 300 ml di appena aggiunto BME per 50 ml di soluzione di strippaggio.
13. Incubare a 50 ° C per 30 minuti e lavare a lungo con TBS e poi TBST. Sonda con anticorpi anti-actina o anti-GAPDH per i controlli proteina-carico (Figura 5 mostra risultati rappresentativi).
    NOTA: i livelli di p53 possono anche essere valutati sulle stesse membrane. Tuttavia, dal momento che p53 è un peso molecolare più elevato, è meglio risolto su un gel inferiore percentuale (ad esempio, 10% Tris-glicina o un gel gradiente (4-15%)). livelli di proteina di altri marcatori senescenti possono anche essere valutati da lisati immunoblotting, tra cui γ-H2AX e pennarelli SAHF.

7. Analizzando i livelli di mRNA di senescenza Marcatori

NOTA: Quando si isola RNA, garantire che le superfici di lavoro vengono puliti con soluzioni di rimozione RNasi o un equivalente e che i materiali sono tutti RNase-free.

1. Mediante la miscela / PBS cella dal punto 4.2, aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione dell'RNA e vortex per 30 s (ci dovrebbero essere grumi visibili o detriti cellulari).
2. Aggiungere 200 ml di cloroformio e agitare vigorosamente per 15 s.
3. Centrifugare a velocità massima (> 15.000 xg) per 15 min a 4 ° C.
4. Rimuovere ~ 400 microlitri dello strato acquoso superiore RNA e pipettare in una nuova provetta per microcentrifuga.
5. Aggiungere 400 ml di isopropanolo (1: 1 con il volume totale dello strato acquoso pipettati nel passaggio precedente) e 4 ml di precipitant allo strato RNA.
6. Centrifugare per 15-30 min a velocità massima (> 15.000 xg) e 4 ° C per sedimentare il RNA.
7. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo al 75% ghiacciata.
8. Centrifugare per 1 min a velocità massima (> 15.000 xg) e 4 ° C.
9. Rimuovere il surnatante e centrifugare per 1 min a velocità massima (> 15.000 xg) e 4 ° C.
10. Pipetta come più liquido possibile e asciugare all'aria per 2 min.
11. Risospendere in 10 ml di 10x tampone DNasi, 85 ml di H ₂ O, e 5 ml di DNasi 1.
12. Incubare a 37 ° C per 30 min.
13. Aggiungere 200 microlitri NT2 tampone (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl _2, e 0,05% Nonidet P-40) e aggiungere 300 microlitri dello strato inferiore di acido fenolo-CHCl _2.
14. Vortex per 1 min e centrifugare a temperatura ambiente per 5 min a velocità massima (> 15.000 xg).
15. Raccogliere 250 microlitri dello strato RNA superiore (2 x 125 mL), aggiungere 25ml di 3 M acetato di sodio pH 5,2, 625 ml di etanolo al 100% ghiacciato, e 5 ml di precipitante. Mescolare bene e precipitare O / N a -20 ° C.
16. Il giorno successivo, mescolare e far girare a velocità massima (> 15.000 xg) e 4 ° C per 30 minuti e scartare il surnatante.
17. Ripetere i passaggi 6,8-6,11.
18. Risospendere il pellet in 12 ml di acqua priva di nucleasi e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
    NOTA: Altre procedure di isolamento di RNA e kit può essere utilizzato come bene.
19. Eseguire la trascrizione inversa con esameri casuali e SSII trascrittasi inversa secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: Data la bassa quantità di RNA isolato da cellule senescenti, è meglio usare tutto il RNA (12 mL) per la sintesi di trascrizione inversa. In alternativa, l'RNA può essere quantificato utilizzando uno spettrofotometro, e la stessa quantità di RNA può essere utilizzato per la trascrizione inversa.
20. Analizzare i livelli di mRNA utilizzando real-time qPCR (RT-qPCR) amplific quantitativazione e master mix PCR SYBR-verde con primer gene-specifici.
    1. Come in una tipica reazione di RT-qPCR, diluire il cDNA 01:30 (in RNasi / acqua priva di DNasi) e aggiungere 3 microlitri al tempo reale piastra da 96 pozzetti per una migliore precisione di pipettamento. Preparare una master mix reazione in avanti gene-specifica e reverse primer (concentrazione 2,5 micron, aggiungere 5 ml / reazione), miscela PCR SYBR-verde (6,25 ml / reazione; utilizzare meno raccomandazioni del costruttore), e 5,75 ml di RNasi / acqua priva di DNasi per un volume finale di reazione di 20 microlitri (17 ml di primer / SYBR-verde / acqua e 3 ml di cDNA).
    2. Eseguire RT-qPCR amplificazione utilizzando una macchina di PCR in tempo reale; seguire il protocollo del produttore.
       NOTA: un elenco di umana convalidato in avanti e retromarcia primer in tempo reale si possono trovare nella tabella 1. Questi geni includono proteine ​​SASP e altri marcatori di senescenza associati e / o geni. Risultati rappresentativi di senescenza IR-indotta sono mostrati in Figura 6.

8. livelli di proteina Quantificare SASP

1. Indurre senescenza utilizzando sezioni 1 o 2 o utilizzando un altro metodo. Piastra le celle 6 o 10 piatti cm, come descritto in precedenza (~ 250.000 cellule / 6 cm piastra o ~ 650.000 / 10 cm piastra).
2. Sia con celle 10 d trattamento post-IR o con cellule senescenti replicative (e cellule di controllo appropriati), lavare le cellule tre volte con PBS 1x e aggiungere terreno privo di siero con antibiotici in un piccolo volume (2,5 mL per 6 cm o 5 mL per 10 cm).
3. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO ₂ in un incubatore di coltura _tissutale. Il giorno dopo, raccogliere le medie e metterlo in un tubo conico sul ghiaccio.
4. Lavare le cellule 2 volte con PBS e poi aggiungere 1 ml di tripsina (per un piatto 6 cm). Contare le cellule utilizzando un emocitometro per regolare successivamente le concentrazioni in base al numero di cellule.
5. Centrifugare il mezzo per 5 minuti a 300 x g.
6. Filter mezzo utilizzando un filtro siringa da 0,45 micron.
7. Aliquotare e congelare il mezzo a -80 ° C fino al momento dell'uso o dosaggio direttamente tramite ELISA o saggi equivalenti.
8. Calcolare il numero di cellule / ml di concentrazione prendendo cella numero / volume totale del mezzo di raccolta.
9. Eseguire un adeguato saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) in base alle istruzioni del produttore. Vedere la Tabella Materiali di kit ELISA consigliati per il saggio per IL-6, IL-8, GROα, e altre citochine / chemochine (Figura 6B).
10. Per garantire che i fattori che vengono misurate sono all'interno della gamma lineare del kit ELISA, fare diluizioni del mezzo cellula senescente rispetto al mezzo cellule proliferanti. Conto di queste diluizioni e il volume quando si calcola la quantità di IL-6. Per acquisire la quantità di IL-6 secreta per cellula al giorno, calcolare il valore di IL-6 ottenuto dal kit (in pg) per concentrazione cellulare diluita per mL (frpasso om 7.8).
    NOTA: Altri metodi, ad esempio matrici citochine, può essere utilizzato per rilevare i livelli di proteine ​​SASP e può essere idoneo per lo screening di un gran numero di fattori SASP. I livelli proteici di fattori SASP possono variare in base al tempo dopo induzione senescenza, il tipo di cellula, o il tipo di senescenza indotta.

Risultati

Le figure 2 - 6 mostrano risultati rappresentativi SA-β-gal colorazione; colorazione per γ-H2AX e SAHF; valutazione dei livelli di proteina di p16 ^INK4A, p21, e p53; e mRNA e di proteina di molecole senescenti-associata. Aumento della colorazione SA-β-gal verifica con replicativa e danni al DNA indotto senescenza. Inoltre, osservare i cambiamenti morfologici che si verificano con senescenza. Cellule diventano allargata e piatta rispetto alla comparsa del ma...

Discussione

Qui, abbiamo descritto metodi per replicativo e danno del DNA senescenza indotta utilizzando fibroblasti diploidi umane. Inoltre, le tecniche di quantificazione delle proteine ​​e livelli di mRNA di varie proteine ​​senescenza associate sono inclusi, così come colorazione per SA-β-gal e per il marcatore DNA-danneggiamento γ-H2AX. Questi protocolli possono essere ampiamente utilizzati per valutare fenotipi senescenti sia in vitro che in vivo, sebbene esistano molti avvertimenti per la caratte...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Tris-glycine gels	Invitrogen	XP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3	Ambion	AM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A11031	1:300 dilution
Cell lifters	Corning Inc.	3008	Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibody	Amersham	NA931V
ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce	32132	ECL
DAPI	Molecular Probes	MP01306	stock 5 mg/mL in dH2O
GAPDH antibody	Santa Cruz	sc-32233	1:1,000 - 5,000 dilution
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody	Abcam	1220	1:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D8000C
Human GROa Quantikine ELISA assay	R&D systems	DRG00
N-N-dimethylformamide	Sigma	D4551	DMF
p16 monoclonal antibody	BD Biosciences	51-1325gr	1:500 dilution
p21 monoclonal antibody	Millipore	05-345	1:750 dilution
p53 monoclonal antibody	Santa Cruz	sc-126	1:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody	Cell Signaling	9719	1:2,000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix	Applied Biosystems	4367659
Pre-stained molecular weight markers	Biorad	161-0374
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
PVDF membrane	Thermo Scientific	88518
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling	9860
TRIzol	Ambion/Life Tech	10296028