تكييف قنبلة ذبابة الفاكهة كتدبير للتعلم والذاكرة

Summary

يصف هذا البروتوكول التعلم ذبابة الفاكهة والذاكرة فحص يسمى تكييف التوافه. ويستند هذا الفحص الكلاسيكي على الحد من سلوك المغازلة الذكور بعد الرفض الجنسي من قبل الإناث غير تقبل فرضية. هذا الشكل الطبيعي من اللدونة السلوكية يمكن استخدامها لاختبار التعلم، والذاكرة على المدى القصير، والذاكرة على المدى الطويل.

Abstract

وقد تم توضيح العديد من الأفكار في الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم والذاكرة من خلال استخدام المقايسات السلوكية البسيطة في الكائنات نموذج مثل ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر . ذبابة الفاكهة مفيد لفهم علم الأعصاب الأساسي الكامن وراء العجز المعرفي الناجم عن الطفرات في الجينات المرتبطة بالاضطرابات المعرفية البشرية، مثل الإعاقة الذهنية (إد) والتوحد. يصف هذا العمل منهجية لاختبار التعلم والذاكرة باستخدام النموذج الكلاسيكي في ذبابة الفاكهة المعروفة باسم تكييف التودد. الذكور الذباب الإناث المحكمة باستخدام نمط متميز من السلوكيات التعرف عليها بسهولة. الإناث في مرحلة ما قبل الولادة ليست مستعدة للتزاوج وسوف ترفض محاولات الانتصاب الذكور. وردا على هذا الرفض، تقلل ذباب الذكور من سلوكهم في التودد. ويقاس هذا الحد من التعلم في السلوك المغازلة مع مرور الوقت، بمثابة مؤشر للتعلم والذاكرة. النوم الأساسيالناتج ريكال من هذا الفحص هو مؤشر التوازي (سي)، الذي يعرف بأنه النسبة المئوية من الوقت أن الذكور تنفق المغازلة خلال 10 دقيقة الفاصل الزمني. مؤشر التعلم (لي) هو الانخفاض النسبي لل سي في الذباب التي تعرضت إلى الإناث المفترسة مقارنة مع الذباب السذاجة مع أي لقاءات الاجتماعية السابقة. للمقارنة الإحصائية بين ليس بين الأنماط الجينية، يتم استخدام اختبار العشوائية مع بوتسترابينغ. لتوضيح كيف يمكن استخدام مقايسة لمعالجة دور الجينات المتعلقة بالتعلم والذاكرة، وتميز ضربة قاضية عصبية عموم من ديهيدروكسياسيتون فوسفات أسيلترانزفيراس ( داب في ) هنا. و أورثولوغ الإنسان من داب في ، غليسيرونيفوسفهات O- أسيلترانزفيراس ( غبت )، وتشارك في غضروفي تنسج غضروفي نوع بونكتاتا 2، متلازمة جسمية المتنحية التي تتميز إد الشديد. باستخدام مقايسة تكييف التهوية، فقد تقرر أن داب في في مطلوب للذاكرة طويلة الأجل، ولكن ليس لذاكرة قصيرة المدي. هذه النتيجة بمثابة أساس لمزيد من التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة.

Introduction

يتم حفظ الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم والذاكرة في كثير من الأنواع. وقد وفر العمل الرائد فحص خطوط ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر للعيوب في التعلم الشم والذاكرة رؤى الجزيئية الرئيسية في العمليات الكامنة وراء التعلم والذاكرة ¹ . حددت هذه الدراسات بعض الجينات الأولى المشاركة في التعلم والذاكرة، مثل روتاباغا ² ، أمنيزياك ³ ، و دونس ⁴ ، وكشف عن دور حاسم لإشارات الأدينوسين أحادي الفوسفات (كامب) ⁵ .

تم إجراء الشاشات الوراثية في وقت مبكر لمسوخ الذاكرة في المقام الأول باستخدام تكييف الشم. ومع ذلك، ظهرت عدة طرق لقياس أشكال أخرى من التعلم والذاكرة مع مرور الوقت. واحدة من نماذج التعلم والذاكرة الأكثر استخداما، والمقايسة الموصوفة هنا، ويعرف باسم جتكييف الهواء، والتي وصفت لأول مرة من قبل سيجل والقاعة ⁶ ، ثم تم صقله لاحقا من قبل عدة مجموعات بحثية أخرى ^{7 ، 8 ، 9} . ويتوقف تكييف الكراهية على وجود فرمون محدد، خلات الفيسينيل (كفا)، على بطن الإناث، الذي يودعه الذكور أثناء الجماع. استشعار سفا على بطن الإناث يقلل بشكل طبيعي من سلوك المغازلة، وعندما يقترن مع فعل الرفض من قبل الإناث، وتأثير سفا على الحد من الذكور الانخراط في تعزيز كبير. استجابة الذباب الذئاب في هذا الفحص يمكن قياسها بسهولة من خلال مراقبة سلوكها التهام مميزة، والتي تتميز بالتوجه نحو وبعد الإناث، والتنصت، وتمديد وتهتز الجناح والعق، ومحاولة الجماع ¹⁰ ( الشكل 1A ). الذباب الذكور تعلم ديستنغويس (ح) بين الإناث المتقلبات البكر وغير المستقبلة ¹¹ ، وبعد الرفض الجنسي، فإنها تعرض سلوك التودد أقل تجاه الإناث غير المستقبلة لمدة تصل إلى 9 أيام ⁸ . ويمكن استخدام هذا السلوك الطبيعي لتوضيح الآليات الكامنة وراء التعلم، الذاكرة على المدى القصير (ستم)، والذاكرة على المدى الطويل (لتم) ^{8 ، 9 ، 12} . ويعرف التعلم بأنه التخفيض الفوري في سلوك المغازلة التي تحدث خلال فترة التدريب وغالبا ما يشار إليها باسم الذاكرة استدعاء فورية، وقياس 0 - 30 دقيقة بعد التعرض للإناث متزاوج ^{6 ، 8} . يتم قياس ستم بين 30 دقيقة و 1 ساعة بعد التدريب، في حين يتم قياس لتم في معظم الأحيان 24 ساعة بعد التدريب ⁸ ( الشكل 1B ). ستم يمكن أن يسببها باستخدام فترة التدريب 1-ساعة، لكنه يستمر فقط لمدة 2-3 ساعةs = "كريف"> 6 ^{، 8} . في معظم نماذج التعلم، يمكن أن يتم تحفيز لتم فقط من نوبات متباعدة من التدريب المتكرر. مكبريد وآخرون . (1999) ⁸ أن ثلاث دورات تدريبية متباعدة، لمدة ساعة واحدة كانت كافية للحث على ذاكرة المغازلة لمدة تصل إلى 9 أيام، على النقيض من 2-3 ساعة الناجم عن دورة تدريبية واحدة ساعة واحدة. ماكبرايد وآخرون . ⁸ أيضا أن دورة تدريبية واحدة لمدة 5 ساعات تنتج استجابة لتم مماثلة لمدة تصل إلى 9 أيام. الذباب لا المحاكم باستمرار خلال هذه الفترة 5-ساعة، في الواقع إنتاج التدريب الخاصة بهم متباعدة للحث على لم في دورة تدريبية واحدة. هذا مهم جدا من منظور عملي، زيادة كبيرة في سهولة التي يمكن أن تستخدم هذه المقايسة للتحقيق لتم. البروتوكولات الحالية تستخدم في الغالب دورة تدريبية واحدة من 7 ساعة ل لتم ^{11 ، 12} . وقد بحثت عدة دراسات مختلفةوالظروف الطافرة التي لها عيوب محددة في جوانب مختلفة من التعلم التعارف. على سبيل المثال، يؤثر الفطر الجسم الاجتثاث ستم و لتم، ولكن لا تعلم ⁸ . الطفرات في الجين أمنيزياك، الذي تم تعريفه أولا كمنظم محدد للذاكرة باستخدام تكييف الشم، ³ ، تؤثر على ستم ولكن لا تعلم ⁶ . تعطيل منظم الترجمة orb2 (oo18 رنا ملزمة (أورب) CPEB2 فصيلة فرعية وإشارات إديسون تؤثر حصرا لتم ^{9 ، 13} . وهكذا، فإن تكييف التمارين هو نموذج مفيد لتشريح الآليات الكامنة وراء مختلف مراحل التعلم والذاكرة.

هذا العمل يدل على الإعداد التجريبي الأمثل الذي يسمح للاختبار عالية الإنتاجية نسبيا من تكييف التودد. وعلاوة على ذلك، فإنه يصف سيناريو التحليل الإحصائي ويناقش العوامل الحاسمة للمقايسة. هو شالخاصة هنا أن الجين ذبابة الفاكهة ديهيدروكاسيتون الفوسفات أسيلترانزفيراس ( داب في ) هو مطلوب في الخلايا العصبية ل لتم، ولكن ليس ل ستم. يتم تحور أورثولوغ الإنسان من هذا الجين، غليسيرونيفوسفهات O- أسيلترانزفيراس ( غنبات )، في غضروفي تنسج غضروفي بونكتاتا نوع 2 ¹⁴ ، واضطراب جسمية المتنحية التي تتميز الإعاقة الفكرية الشديدة، والمضبوطات، والعديد من الخصائص السريرية الأخرى ¹⁵ . في هذا السياق، يمكن استخدام تكييف التورط في التحقق وظيفيا من دور الجينات المرضية البشرية في التعلم والذاكرة، وتوفير أساس للدراسات الميكانيكية.

Protocol

ملاحظة: في البروتوكول المبين أدناه، وصف واحد متماثل من جمع والتدريب والاختبار. من أجل اختبار استنساخ النتائج، يجب أن تتكرر هذه الخطوات بالتوازي، في عدة أيام، ومع مجموعات منفصلة من الذباب ( الجدول 1) . ويستند هذا البروتوكول على دورة حياة 10 أيام من البيض إلى الكبار، وهو أمر طبيعي عند تربية الذباب تحت ظروف ثابتة من 25 درجة مئوية، و 70٪ الرطوبة، و 12 ساعة ضوء / دورة مظلمة. جميع جوانب هذا البروتوكول تفترض أن يتم الاحتفاظ الظروف ثابتة طوال الفحص بأكمله. يشار إلى الأوقات قبل ساعات من تشغيل الأضواء (بلو) أو بعد تشغيل الأضواء (ألو) في الحاضنة، حيث يمكن ضبط ذلك بشكل مناسب اعتمادا على الوقت المفضل للباحث من اليوم. استخدام غاز ثاني أكسيد الكربون فقط لجمع الأولي من الذباب ساذجة الذكور وجمع من الإناث فرضت. ويتكون هذا البروتوكول لتكييف الخطوبة من الخطوات التالية:

1. Eتأسيس الثقافات جمع الإناث فرضت
2. إنشاء ثقافات لجمع موضوعات اختبار الذكور
3. إعداد كتل سكنية
4. إنشاء قوارير التزاوج لإنتاج الإناث المعتادة موحدة
5. مجموعة من الذكور اختبار المواضيع
6. تدريب
7. اختبارات
8. تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات

1 - إنشاء ثقافات جمع الإناث

1. إعداد بويرفود ¹⁶ . يغلي 0.8٪ (ث / ت) أجار، 8٪ (ث / الخامس) الخميرة، 2٪ (ث / ت) الخميرة استخراج، 2٪ (ث / ت) الببتون، 3٪ (ث / ت) السكروز، 6٪ ث / V) الجلوكوز، 0.05٪ (ث / ت) مغسو ₄ ، و 0.05٪ (ث / ت) كاكل ₂ في الماء لمدة 15 دقيقة. السماح للحل لتبرد إلى 70 درجة مئوية قبل إضافة 0.05٪ (ث / ت) ميثيل بارابين (تنبيه: سامة) و 0.5٪ (ت / ت) حمض البروبيونيك (تنبيه: سامة). تخلط جيدا عن طريق التحريك في حين تبريد أكثر من 50 درجة مئوية للحصول على حل متجانس.
2. قبل الطعام لذلكيضاف في درجة حرارة الغرفة، إضافة ~ 50 مل من بويرفود لكل 175 مل قارورة من البلاستيك. السماح للطعام لتبرد أبعد من ذلك. أغلق القارورة مع قابس.
   ملاحظة: باورفود هو خليط الغذاء المتخصصة وضعت خصيصا لإنتاج أعداد كبيرة من الذباب، ويفترض من خلال إحداث البيض وضع. لا يستخدم بويرفود لإنتاج الذباب الذكور التي سيتم استخدامها لتحليل السلوك (الخطوة 2) لأن النظام الغذائي غير نمطية والازدحام المحتمل قد تؤثر على التنمية.
3. في يوم -11 ( الجدول 1 )، بدء 5-20 الثقافات ويلديب مع ما يقرب من 60-100 الذباب (مزيج من الذكور والإناث) في قارورة باور فود. وسوف تستخدم هذه في الخطوة 4 لإنتاج الإناث فرضت موحدة ¹⁷ . إضافة ورقة تصفية لكل قارورة لزيادة المساحة التي يمكن أن يرقات اليرقات؛ وهذا سيزيد من عدد الذباب التي يمكن إكلوس.
4. كرر الخطوات دوريا 1.1-1.3 في جميع أنحاء التجربة للحصول على ما يكفي من الذباب إكلوسينغ جديدة كإدخال لل"إنشاء قوارير التزاوج لإنتاج الإناث موحدة فرضت" (الخطوة 4).

2. إنشاء ثقافات لجمع الموضوعات اختبار الذكور

1. إعداد الغذاء العادي ¹⁶ ، مع 0.5٪ (ث / ت) أجار، 2.75٪ (ث / الخامس) الخميرة، 5.2٪ (ث / ت) دقيق الذرة، و 11٪ (ث / ت) السكر، 0.05٪ (ث / ت ) ميثيل بارابين، و 0.5٪ (v / v) حمض البروبيونيك في الماء، كما هو موضح في الخطوات 1.1 و 1.2. إغلاق قارورة بلاستيكية 175 مل مع قابس قنينة يطير.
2. في اليوم -10 ( الجدول 1 )، مكان حوالي 10-20 ذكور مع ما يقرب من 30-75 الإناث البكر ( المواد / الجدول المعدات ) في كل قارورة 175 مل تحتوي على الغذاء العادي. إضافة ورقة تصفية لزيادة مساحة السطح ل بيرانس وتعظيم الإنتاجية.
3. إنشاء ثلاث إلى ستة قارورة 175 مل لكل النمط الوراثي للحصول على العدد المطلوب من الذكور موضوع الاختبار.
   ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من قارورة، اعتمادا على إنتاجية من المطلوبotype.

3. إعداد كتل الإسكان ( الشكل 2A )

1. تذوب حوالي 50 مل من الطاقة الكهربائية لكل كتلة سكنية في الميكروويف، أو إعداده الطازجة.
2. إضافة 500 ميكرولتر من بويرفود إلى كل بئر من 96-جيدا، كتلة مسطحة القاع باستخدام ماصة مولديسبنسر.
3. السماح للطعام لتصلب في درجة حرارة الغرفة.
4. تغطية كتل مع فيلم لاصق ير واستخدام إبرة لجعل أقل 4 ثقوب لكل بئر لتوفير الهواء النقي للذباب.
5. من أجل أن تكون قادرة على فتح كل بئر، استخدام شفرة حلاقة لقطع الفيلم لاصق طوليا بين كل صف. ترك الفيلم سليمة على طرف واحد من كتلة.
6. كتل يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أيام.
   ملاحظة: تسمح الكتل لإعادة التوازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

.4 إنشاء قوارير التزاوج لإنتاج الإناث المعيارية

1. في يوم -1، إزالة وتجاهل جميع الذباب ويلديب الكبار من الثقافات جمع الإناث فرضت في 2-5 ساعة بلو.
2. جمع الذباب باستخدام الشافطة ( الشكل 2B ) من هذه القوارير في فترات 2-3 إلى ساعة (على سبيل المثال، في 30 دقيقة، 2.5 ساعة، و 5 ساعة ألو) ووضعها في قنينة باور فيود جديدة تستكمل مع كمية صغيرة من الخميرة لصق ورق الترشيح.
3. لتجنب الازدحام وتعزيز جو التزاوج الأمثل، لا نقل أكثر من 150-200 الذباب لكل قارورة جديدة. ضمان تزاوج جميع الإناث من خلال توفير ما لا يقل عن 25٪ من الذكور. ضمان وجود الإناث كافية موجودة في قارورة التزاوج لاستيعاب حجم التجربة.
   ملاحظة: لأن هذا هو خطوة حاسمة في البروتوكول، تأكد من أن فقط الذباب إكلوسد الطازجة وليس الذباب القديمة، اليرقات، أو الشرانق يتم نقلها إلى قارورة التزاوج الجديدة.
4. احتضان هذه "قارورة التزاوج" لمدة أربعة أيام للسماح الوقت الكافي لجميع الإناث أن تتزاوج.

5 -محاضرة من المواضيع اختبار الذكور

1. في يوم 1 ( الجدول 1 ) في 2-3 ساعة بلو، استخدام كو ₂ لإزالة جميع الذباب الكبار من قارورة جمع الذكور (الخطوة 2)، ولكن السماح المزيد من الذباب إكلوس خلال الساعات القليلة المقبلة.
2. على مدى 5-6 ح المقبل، إزالة الذباب إكلوسد حديثا كل 20-30 دقيقة باستخدام كو ₂ ووضع كل ذكر في بئر الفردية من كتلة الإسكان (الخطوة 3) باستخدام الشافطة ( الشكل 2B ).
3. إعادة ختم البئر مع فيلم ير لاصقة.
   ملاحظة: هذه خطوة حاسمة في البروتوكول. وينبغي جمع الذكور في كثير من الأحيان. وينبغي عزل الذكور التي تم جمعها في كتلة الإسكان على مقربة من وقت إكلوسيون، عندما تظهر تصبغ شاحب وجود العقي في البطن شفافة.
   ملاحظة: استخدام لطيف من الشافطة يسمح نقل الذباب. ومع ذلك، فإن الاستخدام غير المناسب تؤكد على الذباب، مما تسبب في التباين في مقايسة (انظر المناقشة).
4. تهدف إلى المشاركةتصل إلى 48 الذكور لكل النمط الجيني. وهذا يوفر فائضا صغيرا إلى العدد الأقصى من الذكور اللازمة لتحليل الظروف الساذجة والمدربة، مما يسمح لبعض الخسارة أثناء خطوات النقل اللاحقة.

6 - التدريب

1. إزالة الذباب من قارورة التزاوج (الخطوة 4.2) باستخدام كو ₂ وفصل الإناث من فرضه من الذكور.
2. باستخدام الشافطة، إضافة واحدة تخدير، فرضت الإناث إلى كل بئر في صف واحد من كتلة سكنية جديدة.
3. باستخدام الشافطة ودون التخدير، نقل الذكور السذاجة الفردية من كتلة الإسكان المنصوص عليها في الخطوة 5.2 إلى جيدا تحتوي على الإناث المفترسة. بعد وضع الذكور في البئر، وإعادة ختم فورا مع فيلم لاصق. لا تسمح للذكور الهرب.
   ملاحظة: نقل ذباب الذكور من الشافطة إلى كتلة الإسكان من خلال الاستفادة من سلوكها "السلبية جيوتاكيس" الطبيعية (انظر المناقشة).
4. كرر الخطوات6-2-6-3 إلى أن يتم إنشاء أزواج من الذكور والإناث. من الناحية المثالية، وإنشاء 24 زوجا، صفين كاملة من كتلة الإسكان، في النمط الجيني. ترك الذكور السذاجة المتبقية في كتلة السكن الأصلي المنصوص عليها في الخطوة 5.2.
5. ترك أزواج الذكور والإناث دون عائق خلال فترة التدريب ( الجدول 2 ، الشكل 1B ).
   ملاحظة: خلال هذا الوقت، فإن الذكور المحكمة ورفض من قبل الإناث فرضه. للتعلم و ستم، فترة التدريب هو 1 ساعة ولتم، فترة التدريب هو 7-9 ح.
6. إنهاء التدريب ( الجدول 2 ، الشكل 1B ) باستخدام الشافطة لفصل بلطف الذكور من الإناث فرضه؛ لا تستخدم التخدير. وضع الذكور فصل في كتلة سكنية جديدة.
7. استخدام الشافطة لنقل جميع الذكور السذاجة بلطف ودون التخدير من كتلة الإسكان المنصوص عليها في الخطوة 5.2 إلى كتلة سكنية جديدة.
   ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ل ستم و ليارنينغ، ولكن من المهم جدا ل لتم لأن يتم الاحتفاظ الذباب لمدة 24 ساعة إضافية لاختبار لتم.
8. ل ستم و لتم، والسماح للذكور للراحة لمدة 1 ساعة و ~ 24 ساعة، على التوالي ( الجدول 2 ، الشكل 1B ) قبل الاختبار (الخطوة 7).
9. للتعلم، واختبار على الفور الذكور المدربين والسذاجة (الخطوة 7).

7. اختبار

1. جمع الذباب من قوارير التزاوج (الخطوة 4.2) باستخدام كو ₂ وفصل الإناث منفردة من الذكور.
2. السماح للإناث الانتعاش من التخدير لمدة 1 ساعة على الأقل في قارورة تحتوي على الغذاء العادي.
3. جبل مسجلات الفيديو مقدما ( الشكل 2C )، من أجل الحصول على جميع المعدات جاهزة قبل بدء الاختبار.
4. بدء الاختبار وفقا لمختلف الجداول الزمنية للتعلم، ستم، وتم ( الجدول 2 ، الشكل 1B ). أداء الاختبار مباشرة بعد التدريبللتعلم، ساعة واحدة بعد التدريب ل ستم، و 24 ساعة بعد التدريب ل لتم.
5. باستخدام الشافطة، نقل بلطف الذكور الفردية من كتلة السكن يستريح أو من كتلة السكن التدريب إذا كان يتم اختبار التعلم (الخطوة 6.7، تدريب؛ الخطوة 6.8، السذاجة) إلى نصف الساحة التودد مع مقسم مغلقة ( الشكل 2D ؛ انظر ملف S1 لخطة مبنى).
   ملاحظة: يجب أن يكون استخدام السلوك "جيوتاكيس" السلبية الطبيعية كافية لنقل ذباب الذكور من الشافطة إلى الساحة التودد (مناقشة).
6. بسرعة ولكن بلطف نقل ثقب الدخول إلى الساحة القادمة وكرر الخطوة 7.5 حتى جميع الساحات 18 تحتوي على ذكر واحد.
7. باستخدام الشافطة ودون كو ₂ ، إضافة واحدة من الإناث المفترضة (التي تم جمعها في الخطوة 7.2) إلى النصف الآخر من جميع الساحات 18.
8. وضع بعناية غرفة التزحلق تحت الكاميرا، مع افتتاح الآبار التي تواجه أسفل ( الشكل 2C ).
9. إزالة الحاجز من الساحات للسماح التفاعل المباشر بين الذكور والإناث فرضت.
10. البدء فورا بتسجيل السلوك لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: عند استخدام إعداد الكاميرا اثنين، يمكن أن يتم تسجيل موازية لوحات اثنين من التزحلق في أطر زمنية متداخلة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة.
11. إفراغ مجالات التودد باستخدام مكنسة كهربائية محمولة باليد والسماح للغرفة التهوية بالتهوية قبل إعادة استخدامها.
12. كرر الخطوة 7.4-7.11 حتى يتم الانتهاء من اختبار جميع الأنماط الجينية والظروف ( أي السذاجة والمدربين).

8. تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات

1. حساب مؤشر التوازي (سي)، وتعرف بأنها النسبة المئوية من الوقت أن المحاكم الذكور خلال أول 10 دقيقة من فترة الاختبار، لكل ذبابة الذكور الفردية.
   ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك يدويا من خلال مراقبة السلوك القولبة النمطية ( الشكل 1A ) أو شالغناء برامج الكمبيوتر للكمي الآلي من السلوك التودد (مناقشة).
   ملاحظة: من المستحسن تحليل 40-60 ذكور لكل حالة على مدى ثلاثة أيام من أجل تحقيق قوة إحصائية كافية وللحكم على اتساق البيانات سي.
2. حساب مؤشر التعلم (لي)، الذي يعرف بأنه انخفاض النسبة المئوية في متوسط ​​سي من الذكور المدربين مقارنة مع الذكور السذاجة (لي = (سي _نايف - سي _{المدربين} ) / سي _ساذجة ). تقييم لي لكل يوم من أيام الاختبار ومقارنتها مع لي المتراكمة المحسوبة من جميع أيام الاختبار مجتمعة.
3. جعل ملف بيانات علامة التبويب منفصل من عمودين مع "جينوتيب" و "سي" كما الرؤوس.
   ملاحظة: هذه العناوين حساسة لحالة الأحرف. يجب أن يتكون اسم النمط الوراثي لكل سي من وصف للنمط الوراثي تليها تسطير سفلي وشرط التدريب (على سبيل المثال، genotype_N و genotype_LTM، وما إلى ذلك، حيث N = نيف و لتم = لونغ تيرمذاكرة؛ انظر الملف التكميلي S2 للحصول على مثال). هذا الشرح ضروري، حيث أن وظيفة أنيرن تحديد الذباب المدربة والساذجة على أساس الأحرف الموجودة بعد أول تسطير في العمود "النمط الجيني".
4. استخدام البرنامج النصي أناليرن R (ملف إضافي S3) لإجراء اختبار العشوائية للحكم على الدلالة الإحصائية للفروق بين قيم لي من الأنماط الجينية المختلفة.
   1. المصدر السيناريو (الملحق S3) إلى R ¹⁸ ، الذي يعرف وظيفة تسمى "أنيرن".
      ملاحظة: تعريف الدالة هو: أنالنيرن <- ​​فونكتيون (نبوت = 10،000، نيفليفيل = 'N'، ريفموتاتيون = نا، داتنام = نا، هيدر = ترو، سيد = نا، وريتوتبوت = ترو).
   2. بدء تشغيل الدالة عن طريق إدخال "أنيليرن ()" في سطر الأوامر R واختيار ملف البيانات التي سيتم تحليلها (المنتجة في الخطوة 8.3) عبر النافذة المنبثقة.
   3. اختر الطفرة المرجعية، والتيهو النمط الوراثي السيطرة، عن طريق إدخال رقم المقابلة والضغط على إدخال.
      ملاحظة: بعد تحديد النمط الوراثي المرجعي، البرنامج النصي يستغرق عدة ثوان لأداء 10،000 النسخ المتماثل التمهيد.
   4. لاحظ الجدول المخرجات (الجدول 3)، الذي يحتوي على النمط الوراثي، حالة التعلم ( أي التعلم، ستم، أو لتم)، يعني سي ساذجة، يعني سي المدربين، لي، والفرق بين لي من السيطرة مقارنة مع حالة تجريبية (لي ديف)، والحد الأدنى (ل) والحد الأعلى (أول) لفاصل الثقة 95٪ للفرق لي، و p- القيمة تشير إلى احتمال عدم وجود فرق كبير.
      ملاحظة: سوف أناليرن تخزين ملف نصي الإخراج في الدليل حيث يوجد ملف البيانات. ومع ذلك، يظهر جدول الإخراج أيضا في وحدة التحكم R-ستوديو. يتم إنشاء الاسم الافتراضي استنادا إلى اسم ملف البيانات المقدم.
   5. هناك العديد من الحجج في الدالة أنالينير التي يمكن استخدامها لتغيير ديإعدادات خطأ وظيفة لضبط المعلمات من بوتسترابينغ.
      ملاحظة: "نبوت" يحدد عدد النسخ المتماثلة بوتستراب ويتم تعيين إلى 10،000 بشكل افتراضي. يمكن تغيير هذه القيمة إلى أي عدد صحيح أكبر من الصفر. یقوم الجدول 5 بإدراج عدة حجج یمکن استخدامھا لتغییر الإعدادات الافتراضیة للوظیفة. ومع ذلك، لا ينصح باستخدام البيانات التي يتم إنتاجها مع عدد قليل من النسخ المتماثل التمهيد.

النتائج

ويمكن استخدام مقايسة تكييف التهذيب لقياس التعلم والذاكرة في ذبابة الفاكهة . من أجل إثبات ذلك، فإن النتائج المعروضة هنا تحليل ستم و لتم في الذباب السيطرة مقارنة مع الذباب مع ضربة قاضية عصبية محددة من داب في. السيطرة على الذكور التعبير عن تسلسل الحمض النووي الريبي تدخل تسلسل استهداف جينورهابديتيس elegans- جين معين، المفترض البروتين إصبع الزنك C02F5.12 ¹⁹ . هذا سلالة السيطرة يضمن عدد متساو من العناصر تسلسل تفعيل المنبع بين ضربة قاضية والسيطرة في نفس الخلفية الجينية، وحسابات دبوس رني السيطرة على أي آثار غير محددة من نظام رني. السيطرة على الذكور (النمط الجيني: واس-dcr2 / +؛ P {KK108109} في-260B / +؛ إلاف-Gal4 / + ) تظهر انخفاضا كبيرا في سي في المدربين مقابل السذاجة لكلا ستم ( الشكل 3A ، P = 1.2 × 10 ^{- 4} ، مان وايتنy U- اختبار) و لتم ( الشكل 3B ، P = 1.2 × 10 ^-4 ، مان ويتني U- اختبار). وتعكس هذه النتيجة القدرة الطبيعية للتعلم والذاكرة في هذه الذباب. داب في ذبابة ضربة قاضية (النمط الجيني: واس-dcr2 / +؛ P {KK101437} في-260B / +؛ إلاف-Gal4 / + ) تظهر أيضا انخفاضا كبيرا في سي في الذباب المدربة مقابل السذاجة ل ستم ( الشكل 3A ، p = 1.2 × 10 ^-4 ، مان ويتني U- اختبار). ومع ذلك، فإنها لا تظهر انخفاضا كبيرا في سي بعد التدريب لتم ( الشكل 3B ، p = 0.33، مان ويتني U- اختبار). تم استخدام مان-ويتني U- اختبار لمقارنة متوسط ​​سي من الذباب السذاجة والمدربة بسبب توزيع غير المعلمي للبيانات سي لبعض الظروف ( الشكل 3A و 3 B). الاختلافات التي لوحظت من خلال تحليل سي تتجلى في لي لكل النمط الوراثي، الذي يقيس نسبة الاختزالعلى في سي في الذباب مقابل تدريب المدربين ( الشكل 3C ). لا يوجد فرق كبير في لي بين الضوابط و DAP- في ذباب ضربة قاضية ل ستم ( P = 0.115، 10،000 تكرار بوتستراب، الشكل 3C ، الجدول 3 )، في حين أن لي لل لتم هو أقل بكثير في داب في ذبابة ضربة قاضية ( p = 0.0034، 10،000 تكرار بوتستراب، الشكل 3C ، الجدول 3 ). للمقارنة بين لي بين الأنماط الجينية، اختبار العشوائية ²⁰ تكييفها من طريقة أوصى أولا من قبل كاميشيف وآخرون. ⁷ . وبما أن لي هي قيمة واحدة مستمدة من البيانات السكانية ( أي متوسط ​​سي-نيف ومتوسط ​​سي المدربين)، فإن الأساليب الإحصائية القياسية التي تعتمد على التوزيعات المستمدة تجريبيا لا تنطبق. اختبار العشوائية هو خالية من التوزيع ويستخدم بوتسترابينغ ( أي سامبلي عشوائينغ مع الاستبدال) لتوليد مجموعات بيانات افتراضية مستمدة من البيانات الفعلية. ينشئ البرنامج النصي أناليرن (ملف S3) مجموعة من ليز افتراضية لكل النمط الوراثي ويحسب الفرق بين السيطرة والاختبار الوراثي (ليديف). وتكرر هذه العملية 10000 مرة، وتستخدم القيم الناتجة لتحديد فاصل الثقة 95٪ من ليديف ( الجدول 3 ). وتستخدم هذه البيانات لتوليد p- قيمة تشير إلى احتمال أن لي من اثنين من المورثات مختلفة. النتائج المعروضة هنا تثبت أن داب في في مطلوب في الخلايا العصبية ل لتم ولكن ليس ل ستم.

من أجل السيطرة على التباين يوما بعد يوم، يتم مقارنة سيس و ليس بين أيام مكررة ( الجدول 4 ). على الرغم من أن بعض التقلبات في لي لوحظ من يوم لآخر، فإن النتائج قابلة للتكرار عموما. ومن المهم أن نلاحظ أن البيانات سي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على ستر التحكمعين المستخدمة والظروف البيئية للاختبار. البيانات سي المعروضة هنا هي نموذجية لهذا النمط الوراثي السيطرة، ولكن قد تظهر أنماط وراثية أخرى أعلى أو أقل سي المتوسط ​​والتوزيع.

الشكل 1: تحديد مؤشر الكشافة ونظرة عامة تجريبية. ( A ) الصور التي تظهر السلوك النمطي الذكور المغازلة نحو ذبابة الإناث. وتظهر مراحل مختلفة من السلوك المغازلة: التوجه (I)، وبعد (الثاني)، والاهتزاز الجناح (التمديد) والتنصت (الثالث)، لعق (إيف)، ومحاولة الجماع (V). ( ب ) نظرة تخطيطية للتدريب وأوقات الاختبار بالنسبة لدورة ضوء الحاضنة، ملحوظ في ساعات. ويشار إلى أوقات التدريب مع الحانات، وفترات الراحة ل ستم و لتم يشار مع خط متقطع، ويشار إلى نقطة بداية الاختبار كسهم. لاحظ أنوقت الاختبار ل لتم هو اليوم بعد التدريب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المعدات المستخدمة لفحص تكييف قشرة ذبابة الفاكهة. ( A ) كتلة الإسكان هو كتلة مسطحة، مع 500 ميكرولتر من بويرفود لكل بئر. وهي مختومة مع فيلم لاصق قر مع ما لا يقل عن 4 ثقوب في البئر التي تم إنشاؤها باستخدام إبرة حقنة مع قطر 0.8 مم. يتم قطع الصفوف الفردية طوليا إلى شرائح باستخدام شفرة حلاقة للسماح بفتح وإغلاق. ( ب ) مطلوب الشافطة لنقل لطيف من الذباب الذكور والإناث دون استخدام التخدير. يظهر أقحم غيض من الشافطة، أغلقت مع قطعة من القطن ل كهإب الذباب داخل طرف. ( C ) إعداد نظام كاميرا اثنين للتسجيل في وقت واحد من اثنين من غرف التعارف. ( D ) غرفة التاج مع 18 الساحات. وتستخدم فتحات الدخول انزلاق لوضع الذباب في الساحات. يمكن فتح الفواصل البيضاء في وقت واحد لبدء التفاعل بين الذكور والإناث. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحليل ستم و لتم في السيطرة وداب في ذبابة ضربة قاضية. ( أب ) توضح الجداول الزمنية توزيع قيم سي للذبذبات الساذجة (T) والذبابة المدربة (T) للأنواع الجينية الضابطة (الرمادي) و داب - عند ضربة قاضية (بيضاء) التي تم اختبارها من أجل ستم (A) و لتم (B). ( ج ) كوريسبوندينغ القيم لي للتحكم وداب في ذبابة ضربة قاضية اختبار ل ستم و لتم . تم مقارنة الاختلافات في لي بين السيطرة والأنماط الجينية ضربة قاضية باستخدام اختبار العشوائية (10،000 بوتستراب مكررات). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المعياري للمتوسط ​​المشتتق من قيم لي المحسوبة على أيام اختبار مختلفة. الأنماط الجينية هي: w +، واس-dcr2 / + ؛ P {KK108109} في-260B / + ؛ و إلاف-Gal4 / + (التحكم) و w +، واس-dcr2 / + ؛ P {KK101437} في-260B / +؛ و إلاف- Gal4 / + ( داب-أت -RNAi). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

	جنرال لواء	تجميع	قطار	اختبار
يوم -11	بدء افتراض جمع الثقافات الإناث (الخطوة 1.3)
يوم -10	بدء الثقافات لجمع المواضيع اختبار الذكور (الخطوة 2.2)
اليوم 1		ممثل واحد. 1
يوم 2		ممثل واحد. 2
يوم 3		ممثل واحد. 3
يوم 4		ممثل واحد. 4	ممثل واحد. 1
يوم 5			ممثل واحد. 2	ممثل واحد. 1
يوم 6			ممثل واحد. 3	ممثل واحد. 2
يوم 7			ممثل واحد. 4	ممثل واحد. 3
يوم 8				ممثل واحد. 4
يوم 9	تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات (الخطوة 8)
ريب = ريبيت

الجدول 1 : الجدول الزمني النموذجي لاختبار تم أكثر من ثلاثة مكررات في الأيام الفردية.

	تعلم	STM	LTM
وقت التدريب	1 ساعة.	1 ساعة.	8 ح.
وقت الراحة	0 ساعة.	1 ساعة.	~ 24 ساعة.
ابدأ التدريب	0ح. ALO	0 ساعة. ALO	4 ح. BLO
وقف التدريب	1 ساعة. ALO	1 ساعة. ALO	4 ح. ALO
بدء الاختبار	1 ساعة. ALO	2 ح. ALO	0 ساعة. ألو (اليوم التالي)
ألو = بعد تشغيل الأضواء، بلو = قبل تشغيل الأضواء، ستم = الذاكرة على المدى القصير، لتم = الذاكرة على المدى الطويل

الجدول 2 : مدة التدريب، أوقات التدريب، وأوقات الاختبار للتعلم، ستم، وتم.

الطراز العرقى	تعلم شرط	CI ساذج	CI متدرب	LI	LI فرق	الحد الأدنى (95٪ فاصل كونفيسيون)	الحد الأعلى (95٪ فاصل كونفيسيون)	ف قيمة
مراقبة	STM	0.467	0.116	0.752	NA	NA	NA	NA
Dhap-في-رني	STM	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.030	0.265	0.116
مراقبة	LTM	0.590	0.384	0.348	NA	NA	NA	NA
Dhap-في-رني	LTM	0.697	0.650	0.068	0.280	0.103	0.446	0.003

الجدول 3: البيانات الإحصائية التي تم إنتاجها من البرنامج النصي.
البيانات الإحصائية المنتجة من البرنامج النصي أناليرن. ملف الإخراج من R-سكريبت بوتسترابينغ التي تحتوي على النمط الجيني، وظروف التعلم ( أي التعلم، ستم، أو لتم)، يعني سي ساذجة، يعني سي المدربين، لي، الفرق بين لي من السيطرة مقارنة مع حالة تجريبية (لي ديف) ، الحد الأدنى (ل) والحد الأعلى (أول) من فاصل الثقة 95٪ من لي ديف، و p- قيمة تشير إلى احتمال عدم وجود فرق كبير.

		مراقبة			Dhap-في-رني
		متوسط ​​سي ساذجة	متوسط ​​التدريب المدرسي	LI	متوسط ​​سي ساذجة	متوسط ​​التدريب المدرسي	LI
STM	اليوم 1	0.300	0.125	0.584	0.679	0.239	0.648
	اليوم الثاني	0.634	0.107	0.831	0.720	0.276	0.617
	كل الأيام	0.467	0.116	0.752	0.699	0.257	0.633
LTM	اليوم 1	0.590	0.441	0.252	0.630	0.646	-0.027
	اليوم الثاني	0.640	0.363	0.432	0.709	0.710	-0.002
	يوم 3	0.547	0.349	0.363	0.738	0.598	0.190
	كل الأيام	0.590	0.384	0.348	0.697	0.650	0.068

الجدول 4 : قيم سي و لي المتحصل عليها في أيام اختبار منفصلة.

"نايفليفيل" يحدد النص الذي سيحدد القيم الساذجة لكل النمط الوراثي. الافتراضي هو "N"، ولكن يمكن تغيير هذا إلى أي نص أبجدي رقمي آخر.

يتم تعيين "ريفموتاتيون" على "نا" (لا ينطبق) بشكل افتراضي، ولكن يمكن تغييرها إلى اسم عنصر التحكم أو النمط الوراثي من أجل إجراء مقارنات إحصائية. سيؤدي هذا إلى sكريبت لتحديد تلقائيا النمط الوراثي السيطرة.

يشير "داتنام" إلى اسم ملف البيانات ويمكن تحديده في هذه الوسيطة بدلا من تحديد الملف الافتراضي.

"رأس" يمكن استخدامها للإشارة إلى ما إذا كان ملف البيانات يحتوي على رؤوس الأعمدة أم لا. الإعداد الافتراضي هو "ترو"، ولكن يمكن استخدام ملف بلا رؤوس عند تغيير هذه الوسيطة إلى "فالس".

"البذور" تهيئة مولد رقم عشوائي، يتم تعيين هذا افتراضيا إلى "نا" ويضمن رقم عشوائي في كل مرة يتم استخدام البرنامج النصي. وبحلول التصميم، سوف يعطي تحليل بوتستراب نتائج مختلفة قليلا في كل مرة يتم تشغيله، حتى عند استخدام ملف البيانات نفسه. عندما يتم تحديد البذور من قبل أي عدد صحيح أكبر من الصفر، يتم الحصول على نفس مجموعة من عينات بوتستراب عشوائي.

"writeout وضع "يمكن تعيين" ترو "أو" فالس "لتحديد ما إذا كان سيتم إنشاء ملف الإخراج. الافتراضي هو الصحيح."

جدول 5: الحجج المستخدمة في الدالة أناليرن التي يمكن تغيير الإعدادات الافتراضية للدالة لضبط معلمات بوتسترابينغ

الملف التكميلي S1: خطة بناء غرفة التودد. يمكن فتح الملف مع أي تطبيق يسمح ملحقات .stp (كاد الملفات) . الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي S2 : مثال لملف إدخال لبرنامج نصي أناليرن .S2.zip "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي S3 : و Analearn.R نص. يمكن فتح الملف مع R-ستوديو ¹⁸ . الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

مقايسة مقايسة تكييف هو نموذج كلاسيكي لتحليل التعلم والذاكرة في ذبابة الفاكهة . بروتوكول المقدمة هنا يتبع المنهجية العامة المذكورة سابقا ^{6 ، 7 ، 8 ، 9} ولكن يشمل جوانب فريدة من نوعها مثل المبادئ التوجيهية العملية، والمعدات المتخصصة، وتحليل البيانات النصي ^{9 ، 12} لاختبارات العشوائية. باستخدام هذا البروتوكول، فمن الممكن لتحليل أعداد كبيرة من الذباب في موازاة استخدام كتل 96-مسطحة مسطحة القاع ( الشكل 2A ) لجمع وتدريب الذكور. كتل مختومة مع ير فيلم لاصق، مما يجعل الذباب يمكن الوصول إليها بسهولة عند الحاجة. بالإضافة إلى ذلك، فإن غرف التهذيب فريدة من نوعها وصف هنا تسمح للاقتران في وقت واحد من 18 زوجا من الذكور والإناث في مساحة ما يقرب من ثنائي الأبعاد أناالأمثل لتحليل الفيديو. غرف التزيين مصممة خصيصا سهلة الاستخدام، وتقدم خطة بناء ( ملف S1 ، الشكل 2D ). هذا البروتوكول، من إنشاء الثقافات المستخدمة لجمع المواضيع اختبار لاقتناء بيانات الفيديو، يستغرق حوالي 20 يوما ( الجدول 1 ). مطلوب وقت إضافي لتحليل بيانات الفيديو. في تجربتنا، و ستم مقايسة قوية للغاية. اختبار لتم هو أيضا قوية جدا، ولكن أكثر حساسية لمتغيرات البيئة مربكة، وبالتالي يمكن أن يكون أكثر صعوبة لإتقان.

سلوك الحيوان يمكن أن يكون متغير جدا. لذلك، يجب تنفيذ الخطوات الحاسمة في البروتوكول مع الحرص على تقليل هذا التباين. أولا، استخدام لطيف من الشافطة ( الشكل 2B ) سوف يقلل من الإجهاد التي يمكن فرضها عن طريق التعامل مع الخام أو عن طريق تهب بقوة كبيرة. طريقة مقترحة لنقل الفردالذباب من الشافطة هو باستخدام جيوتاكسيس السلبية. كما الذباب تميل إلى المشي، يمكن للمرء ببساطة تشير غيض من الشافطة تصل؛ فقط قبل ذبابة تصل إلى طرف، ضربة لطيف كافية للسماح للطيران خارج. بالإضافة إلى ذلك، للسماح للذكور في غرف التودد قبل الاختبار، ضربة غالبا ما تكون غير ضرورية.

خطوة هامة أخرى هي جمع وتوليد المواضيع اختبار الذكور. يجب جمع جميع الذكور عندما تكون صغيرة جدا وساذجة اجتماعيا. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق جمع المتكرر خلال فترات الذروة من إكلوسيون (الخطوة 5.2). إذا لم يتم جمع الذكور في هذا الإطار الزمني ضيق، فإنها يمكن أن يكون التفاعلات الاجتماعية في وقت مبكر، مما قد يؤدي إلى ضعف التعلم أو التباين العالي في سي. وثمة عامل آخر من الموضوعات اختبار الذكور التي ينبغي تقييمها هو الخلفية الجينية. سوف تظهر خلفيات وراثية مختلفة مستويات مختلفة من التهاوج الساذجة وقد تختلف أيضا في النشاط العام أو القدرة الحركية. عندما كومبايجب أن تؤخذ الرعاية فيما يتعلق بالخلفية الوراثية من أجل تجنب هذه العوامل المربكة التي قد تؤثر على عشرات لي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تقييم توزيع بيانات سي بعناية. يمكن أن تكون البيانات سي على حد سواء حدودي وغير المعلمي، اعتمادا على النمط الوراثي أو العوامل البيئية الأخرى. وفي بعض الحالات، إذا كان توزيع سي متحيزا بشكل كبير بعيدا عن التوزيع الطبيعي، قد يكون من الأفضل استخدام الوسيط سي بدلا من المتوسط ​​لحساب المعطيات ليس. ومع ذلك، في تجربتنا، واستخدام وسي أو متوسط ​​سي لا تحدث فرقا في التفسير الإحصائي للبيانات، واستخدام متوسط ​​سي هو الممارسة الشائعة في الأدب.

ومن أجل نجاح التهيئة، فإن الرفض النشط لمحاولات الذكور من قبل النساء اللواتي يعانين من اضطرابات أمر بالغ الأهمية خلال فترة التدريب. من المهم التأكد من أن الإناث المفترسة المستخدمة في هذا الفحص قد تزاوجت بكفاءة وهيوبالتالي لا يسمح الجماع. يتم إنشاء هذا الافتراض في قارورة التزاوج أعدت في الخطوة 4، حيث يتم وضع الذباب الذكور والإناث معا لمدة 4 أيام ( الجدول 1 ). وفي وقت لاحق، يمكن رصد التزاوج عن طريق الفحص المنتظم لمقاطع الفيديو اختبار ومراقبة الأزواج الذكور والإناث أثناء التدريب. إذا حدث التزاوج، وهناك العديد من التدابير التي يمكن اتخاذها أثناء إعداد الإناث المخططة. أولا، ينبغي أن تربي الإناث فرضها في ظل ظروف التربية المثلى. يمكن أن تستكمل قوارير مع عجينة الخميرة ورقة مرشح مطوية لزيادة السطوح التزاوج المحتملة. وقد أدت حضانة الذباب في ظل الظروف الموصوفة هنا إلى إناث متقاربة قوية في الماضي، ولكن هذا قد يختلف في مختبرات مختلفة وباستخدام سلالات وراثية مختلفة. لذلك، قد يكون من الضروري لتحسين توليد الإناث من قبل متفاوتة من خلال تغيير وقت الحضانة والشروط.

القياس الكمي لسلوك التودد هوخطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول. ويمكن القيام بذلك يدويا أو تلقائيا باستخدام برامج متخصصة ⁹ . الكمي الآلي سريع، من حيث المبدأ، غير منحازة. وقد نشرت عدة برامج ^{21 و 22 و 23} ؛ ومع ذلك، فهي ليست واضحة للاستخدام، وغالبا ما تتطلب صيغ الفيديو المتخصصة والمهارات الحسابية المتقدمة. التكميم اليدوي هو سهل ودقيق، ولكنه كثيف العمالة كثيفة وتخضع للتغيرات الفردية والتحيز. ومن المهم التأكيد على أن هذا البروتوكول لا يعالج متطلبات تنسيق الفيديو التي قد تكون مطلوبة من أجل القياس الكمي الآلي لل سي. للحصول على دليل الكمي، استخدام أي جهاز تسجيل الفيديو بسيطة التي لديها القدرة على إنتاج شريط فيديو من نوعية كافية لمراقبة بدقة السلوك المغازلة. لالكمي الآلي، سيكون هناك على الأرجح مختلفةمتطلبات اعتمادا على البرمجيات المستخدمة، ويجب على المستخدمين التحقيق في هذا بدقة إذا كان المطلوب الكمي الآلي.

في تركيبة مع الأدوات واسعة النطاق المتاحة للتلاعب الجيني من الذباب، ومقايسة تكييف التهذيب يوفر قراءات قوية التي يمكن استخدامها لتشريح الآليات الجزيئية والشبكات العصبية المشاركة في التعلم والذاكرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-