Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Drosophila Lern-und Gedächtnis-Assay namens Balz Konditionierung. Dieser klassische Assay basiert auf einer Verringerung des männlichen Balzverhaltens nach sexueller Ablehnung durch eine nicht-rezeptive vorbereitete Frau. Diese natürliche Form der Verhaltens-Plastizität kann verwendet werden, um Lernen, Kurzzeitgedächtnis und Langzeitgedächtnis zu testen.

Zusammenfassung

Viele Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, wurden durch die Verwendung einfacher Verhaltenstests in Modellorganismen wie der Fruchtfliege , Drosophila melanogaster , aufgeklärt . Drosophila ist nützlich für das Verständnis der grundlegenden Neurobiologie, die kognitiven Defiziten zugrunde liegt, die sich aus Mutationen in Genen ergeben, die mit menschlichen kognitiven Störungen wie der intellektuellen Behinderung (ID) und dem Autismus assoziiert sind. Diese Arbeit beschreibt eine Methodik für das Testen von Lernen und Gedächtnis mit einem klassischen Paradigma in Drosophila bekannt als Balz Konditionierung. Männliche Fliegen Hof Frauen mit einem deutlichen Muster von leicht erkennbaren Verhaltensweisen. Vorzeitige Frauen sind nicht empfänglich für die Paarung und werden die männlichen Kopulationsversuche ablehnen. Als Reaktion auf diese Ablehnung reduzieren männliche Fliegen ihre Balzverhalten. Diese gelehrte Verringerung des Balzverhaltens wird im Laufe der Zeit gemessen und dient als Indikator für Lernen und Gedächtnis. Das GrundniveauRical output dieses Assays ist der Balzindex (CI), der als der Prozentsatz der Zeit definiert ist, die ein Mann während einer 10-minütigen Intervall-Kurve verbringt. Der Lernindex (LI) ist die relative Reduktion von CI in Fliegen, die einer vorzeitigen Frau im Vergleich zu naiven Fliegen ohne vorherige soziale Begegnungen ausgesetzt waren. Für den statistischen Vergleich von LIs zwischen Genotypen wird ein Randomisierungstest mit Bootstrapping verwendet. Um zu veranschaulichen, wie der Assay verwendet werden kann, um die Rolle eines Gens in Bezug auf Lernen und Gedächtnis zu adressieren, wurde hier der panneuronale Knockdown von Dihydroxyacetonphosphat-Acyltransferase ( Dhap-at ) charakterisiert. Das menschliche Orthologe von Dhap-at , Glyceronphosphat O-Acyltransferase ( GNPT ), ist an rhizomelic chondrodysplasia punctata Typ 2 beteiligt, ein autosomal-rezessives Syndrom, das durch eine schwere ID gekennzeichnet ist. Mit dem Courtship Conditioning Assay wurde festgestellt, dass Dhap-at für Langzeitgedächtnis benötigt wird, aber nicht fürKurzzeitgedächtnis. Dieses Ergebnis dient als Grundlage für die weitere Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.

Einleitung

Die molekularen Mechanismen, die Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, sind in vielen Arten konserviert. Die Pionierarbeit Screening Drosophila Melanogaster Mutanten Linien für Defekte in olfaktorischen Lernen und Gedächtnis hat wichtige molekulare Einblicke in die Prozesse zugrunde liegenden Lernen und Gedächtnis ¹ . Diese Studien identifizierten einige der ersten Gene, die an Lernen und Gedächtnis beteiligt waren, wie Rutabaga ² , Amnesiac ³ und Dunce ⁴ , was eine kritische Rolle für die zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) -Signalisierung ⁵ enthielt.

Frühe genetische Bildschirme für Gedächtnismutanten wurden hauptsächlich mit olfaktorischer Konditionierung durchgeführt. Allerdings sind mehrere Methoden zur Messung anderer Formen des Lernens und des Gedächtnisses im Laufe der Zeit entstanden. Eines der am weitesten verbreiteten Lern- und Speicherparadigmen und der hier beschriebene Assay ist bekannt als cDie erstmals von Siegel und Halle ⁶ beschrieben wurde und später von mehreren anderen Forschungsgruppen ^{7 , 8 , 9} verfeinert wurde. Die Courtship-Konditionierung hängt von der Anwesenheit eines spezifischen Pheromons, cis- Vcciosylacetat (cVA), auf dem weiblichen Bauch, der von der männlichen während der Kopulation hinterlegt wird. Das Erfassen von cVA auf den weiblichen Bauch verringert natürlich das Balzverhalten, und wenn es mit dem Akt der Ablehnung durch das Weibchen gekoppelt ist, wird die Wirkung von cVA auf die Verringerung der männlichen Balz dramatisch verbessert. Die Antwort von männlichen Fliegen in diesem Assay kann leicht durch Beobachtung ihres ausgeprägten Balzverhaltens, das durch die Orientierung auf und nach dem weiblichen, Klopfen, Ausdehnen und Vibrieren des Flügels, Lecken und Versuchen der Kopulation ¹⁰ ( Fig. 1A ) gekennzeichnet ist, quantifiziert werden. Männliche Fliegen lernen zu unterscheiden H zwischen rezeptiver jungfräulicher und nicht-rezeptiver gepaarter Weibchen ¹¹ , und nach sexueller Ablehnung zeigen sie das reduzierte Balzverhalten gegenüber nicht-rezeptiven Frauen für bis zu 9 Tage ⁸ . Dieses natürliche Verhalten kann verwendet werden, um die Mechanismen, die dem Lernen, dem Kurzzeitgedächtnis (STM) und dem Langzeitgedächtnis (LTM) ^{8 , 9 , 12} zugrunde liegen, zu erhellen. Lernen ist definiert als die sofortige Verringerung des Balzverhaltens, die während des Trainingszeitraums auftritt und wird oft als sofortiger Rückrufspeicher bezeichnet, gemessen 0 - 30 min nach Exposition gegenüber einer gepaarten Frau ^{6 , 8} . STM wird zwischen 30 min und 1 h nach dem Training gemessen, während LTM am häufigsten 24 h nach dem Training ⁸ gemessen wird ( Abbildung 1B ). STM kann mit einer 1-h Trainingsphase induziert werden, aber es dauert nur 2-3 StundenS = "xref"> 6 ^{, 8} . In den meisten Lernparadigmen kann LTM nur durch beabstandete Kämpfe des wiederholten Trainings induziert werden. Mcbride et al . (1999) ⁸ zeigte, dass drei beabstandete 1-stündige Trainingseinheiten ausreichen, um eine Balance für bis zu 9 Tage zu induzieren, im Gegensatz zu den 2-3 Stunden, die durch eine einzelne 1-h-Trainingseinheit induziert wurden. McBride et al . ⁸ zeigte auch, dass eine einzelne 5-h-Trainingseinheit eine ähnliche LTM-Antwort für bis zu 9 Tage produzierte. Fliegen behaupten nicht ständig während dieser 5-Stunden-Periode, in der Tat produzieren ihre eigenen beabstandeten Training zu induzieren LTM in einer einzigen Trainingseinheit. Dies ist aus praktischer Perspektive sehr wichtig, was die Leichtigkeit, mit der dieser Assay zur Untersuchung von LTM verwendet werden kann, erheblich erhöht. Aktuelle Protokolle verwenden überwiegend eine einzige Trainingseinheit von 7-h für LTM ^{11 , 12} . Mehrere Studien haben verschiedene untersuchtMutanten Bedingungen, die spezifische Mängel in verschiedenen Aspekten der Balz Lernen haben. Zum Beispiel, Pilz Körperablation betrifft STM und LTM, aber nicht lernen ⁸ . Mutationen im amnesischen Gen, die zuerst als spezifischer Regulator des Gedächtnisses unter Verwendung der olfaktorischen Konditionierung ³ definiert wurden, beeinflussen den STM, aber nicht das Lernen ⁶ . Störung des Translationsreglers orb2 (oo18 RNA-bindende (orb) CPEB2-Unterfamilie) und Ecdyson-Signalisierung exklusiv Effekt LTM ^{9 , 13} . So ist die Balzkonditionierung ein nützliches Paradigma, um die Mechanismen, die den verschiedenen Stufen des Lernens und Gedächtnisses zugrunde liegen, zu sezieren.

Diese Arbeit zeigt einen optimierten experimentellen Aufbau, der die relativ hohe Durchsatzprüfung der Balzkonditionierung ermöglicht. Darüber hinaus beschreibt es ein statistisches Analyse-Skript und diskutiert kritische Faktoren des Assays. Es ist shHier ist das Drosophila- Gen Dihydroxyaceton-Phosphat-Acyltransferase ( Dhap-at ) Ist in Neuronen für LTM erforderlich, aber nicht für STM. Das menschliche Orthologe dieses Gens, Glyceronphosphat O-Acyltransferase ( GNPAT ), ist in rhizomelic chondrodysplasia punctata Typ 2 ¹⁴ mutiert, eine autosomal-rezessive Störung, die durch schwere intellektuelle Behinderung, Krampfanfälle und mehrere andere klinische Merkmale gekennzeichnet ist. In diesem Kontext kann die Konditionierung der Justiz zur funktionellen Validierung der Rolle von menschlichen Krankheitsgenen in Lernen und Gedächtnis genutzt werden, was eine Grundlage für mechanistische Studien bildet.

Protokoll

HINWEIS: In dem unten beschriebenen Protokoll wird ein Replikat von Sammlung, Training und Test beschrieben. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu testen, sollten diese Schritte parallel, an mehreren Tagen und mit getrennten Gruppen von Fliegen wiederholt werden ( Tabelle 1) . Das Protokoll basiert auf einem 10-tägigen Lebenszyklus von Ei zu Erwachsenen, was bei der Aufzucht unter konstanten Bedingungen von 25 ° C, 70% Feuchtigkeit und einem 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus normal ist. Alle Aspekte dieses Protokolls gehen davon aus, dass die Bedingungen während des gesamten Assays konstant gehalten werden. Die Zeiten werden als Stunden angezeigt, bevor die Lichter einschalten (BLO) oder nach dem Einschalten der Lampen (ALO) im Inkubator, da dies je nach Wunschzeit des Forschers bequem eingestellt werden kann. Verwenden Sie CO ₂ -Gas nur für die erste Sammlung von naiven männlichen Fliegen und für die Sammlung von vorgedrungenen Weibchen. Dieses Protokoll für die Konditionierung besteht aus folgenden Schritten:

1. EStufung von vorgewählten weiblichen sammlungskulturen
2. Etablierung von Kulturen für die Sammlung von männlichen Testpersonen
3. Vorbereitung der Wohnblöcke
4. Etablierung von Paarungsfläschchen für die Herstellung von standardisierten Vormännerinnen
5. Sammlung von männlichen Testpersonen
6. Ausbildung
7. Testen
8. Videodatenanalyse und Statistik

1. Gründung der weiblichen Sammlungskulturen

1. Bereiten powerfood ^{16 vor} . Kochen Sie 0,8% (w / v) Agar, 8% (w / v) Hefe, 2% (w / v) Hefeextrakt, 2% (w / v) Pepton, 3% (w / v) Saccharose, 6% ( W / v) Glucose, 0,05% (w / v) MgSO ₄ und 0,05% (w / v) CaCl ₂ in Wasser für 15 min. Lassen Sie die Lösung auf 70 ° C abkühlen, bevor Sie 0,05% (w / v) Methylparaben (ACHTUNG: toxisch) und 0,5% (v / v) Propionsäure (ACHTUNG: toxisch) hinzufügen. Mischen Sie gut unter Rühren unter Kühlen weiter auf 50 ° C, um eine homogene Lösung zu erhalten.
2. Vor dem Essen soBei Raumtemperatur verkrümmt, füge 50 ml Powerfood zu jeder 175 ml Plastikfläschchen hinzu. Lassen Sie das Essen weiter abkühlen. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem Stecker.
   HINWEIS: Powerfood ist eine spezialisierte Lebensmittelmischung, die speziell für die Herstellung einer großen Anzahl von Fliegen formuliert wurde, vermutlich durch die Ei-Verlegung. Powerfood wird nicht verwendet, um männliche Fliegen zu produzieren, die für die Verhaltensanalyse verwendet werden (Schritt 2), weil die atypische Ernährung und die potenzielle Verdrängung die Entwicklung beeinflussen könnten.
3. Am Tag -11 ( Tabelle 1 ) beginnen 5-20 Wildtyp-Kulturen mit etwa 60-100 Fliegen (eine Mischung von Männchen und Weibchen) in Powerfood-Fläschchen; Diese werden in Schritt 4 verwendet, um standardisierte vorgedrängte Frauen zu produzieren. Füge ein Filterpapier zu jeder Durchstechflasche hinzu, um den Bereich zu vergrößern, auf dem die Larven verpuppen können; Dies wird die Anzahl der Fliegen erhöhen, die sich ergeben können.
4. In regelmäßigen Abständen die Schritte 1.1-1.3 während des gesamten Experiments wiederholen, um genügend fröhliche Fliegen als Eingang für die"Einrichtung von Paarungsfläschchen für die Herstellung von standardisierten vorgebrachten Frauen" (Schritt 4).

2. Gründung von Kulturen für die Sammlung männlicher Testfächer

1. Bereiten Sie normales Essen ¹⁶ , hergestellt mit 0,5% (w / v) Agar, 2,75% (w / v) Hefe, 5,2% (w / v) Maismehl, 11% (w / v) Zucker, 0,05% (w / v ) Methylparaben und 0,5% (v / v) Propionsäure in Wasser, wie in den Schritten 1.1 und 1.2 beschrieben. Schließen Sie die 175-ml-Plastik-Durchstechflaschen mit einem Durchstechflasche.
2. Am Tag -10 ( Tabelle 1 ) legen Sie etwa 10-20 Männer mit etwa 30-75 Jungfrauen ( Materialien / Ausrüstungstabelle ) in jede 175 ml Durchstechflasche mit normaler Nahrung. Fügen Sie ein Filterpapier hinzu, um die Oberfläche für die Verpuppung zu erhöhen und die Produktivität zu maximieren.
3. Stellen Sie drei bis sechs 175-ml-Durchstechflaschen pro Genotyp her, um die erforderliche Anzahl von Testpersonen zu erhalten.
   HINWEIS: Je nach Produktivität des gewünschten Gens können mehr Fläschchen benötigt werdenOtype

3. Vorbereitung der Gehäuseblöcke (Abbildung 2A )

1. Mischen Sie ca. 50 mL Powerfood pro Gehäuseblock in einer Mikrowelle, oder bereiten Sie es frisch vor.
2. Fügen Sie 500 μl Powerfood zu jeder Vertiefung eines 96-Well-Flat-Bottom-Blocks mit einer Multidispenser-Pipette hinzu.
3. Lassen Sie das Essen bei Raumtemperatur erstarren.
4. Decken Sie die Blöcke mit PCR-Klebefolie und verwenden Sie eine Nadel, um mindestens 4 Löcher pro Brunnen zu machen, um frische Luft zu den Fliegen zu liefern.
5. Um in der Lage zu sein, jeden Brunnen zu öffnen, verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Klebefolie längs zwischen jeder Reihe zu schneiden. Lassen Sie den Film auf einem Ende des Blocks intakt.
6. Die Blöcke können bis zu 2 Tage bei 4 ° C gelagert werden.
   HINWEIS: Lassen Sie die Blöcke vor dem Gebrauch wieder auf Raumtemperatur ausgleichen.

4. Etablierung von Paarungsfläschchen für die Herstellung von standardisierten vorzeitigen Weibchen

1. Am Tag -1, entfernen undVerwerfe alle erwachsenen Wildtypfliegen aus vorgewählten weiblichen Sammlungskulturen bei 2-5 h BLO.
2. Sammeln Sie Fliegen mit dem Aspirator (Abbildung 2B ) aus diesen Fläschchen in 2- bis 3-h-Intervallen ( z. B. bei 30 min, 2,5 h und 5 h ALO) und legen Sie sie in eine neue Powerfood-Durchstechflasche, ergänzt mit einer kleinen Menge an Hefe Einfügen und filtrieren.
3. Um eine Gedränge zu vermeiden und eine optimale Gegenatmosphäre zu fördern, übertrage ich nicht mehr als 150-200 Fliegen in jede neue Durchstechflasche. Sicherstellung der Paarung aller Frauen durch die Bereitstellung von mindestens 25% Männer. Stellen Sie sicher, dass genügend Weibchen in den Paarungsfläschchen vorhanden sind, um die Größe des Experiments aufzunehmen.
   HINWEIS: Da dies ein entscheidender Schritt im Protokoll ist, stellen Sie sicher, dass nur frisch verschlossene Fliegen und keine alten Fliegen, Larven oder Puppen auf die neue Paarungsröhre übertragen werden.
4. Inkubieren Sie diese "Paarungsfläschchen" für vier Tage, um genügend Zeit für alle Frauen zu haben, sich zusammenzupassen.

5. ColLektion der männlichen Testfächer

1. Am Tag 1 ( Tabelle 1 ) bei 2-3 h BLO, verwenden Sie CO ₂ , um alle erwachsenen Fliegen aus den männlichen Sammelgefäßen zu entfernen (Schritt 2), Aber lassen Sie mehr Fliegen in den nächsten Stunden umgehen.
2. Über die nächsten 5-6 h entferne alle 20-30 min mit CO ₂ neu entkernte Fliegen und stelle jedes Männchen in einen einzelnen Brunnen des Gehäuseblocks (Schritt 3) mit dem Aspirator ( Bild 2B ).
3. Die Vertiefung mit dem adhäsiven PCR-Film wieder abdichten.
   HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt im Protokoll. Die Männer sollten häufig gesammelt werden. Gesammelte Männchen sollten in der Gehäuseblock in der Nähe der Zeit der Eklosion isoliert werden, wenn sie eine blasse Pigmentierung und die Anwesenheit des Mekoniums im lichtdurchlässigen Bauch zeigen.
   ANMERKUNG: Der sanfte Gebrauch des Aspirators ermöglicht die Übertragung von Fliegen; Allerdings wird eine unangemessene Verwendung die Fliegen betonen, was zu einer Abweichung des Assays führt (siehe Diskussion).
4. Ziel zu coLose bis zu 48 Männchen pro Genotyp. Dies stellt einen geringen Überschuss für die maximale Anzahl von Männern zur Verfügung, die für die Analyse sowohl naiver als auch geschulter Bedingungen benötigt werden, was einen gewissen Verlust während späterer Übertragungsschritte ermöglicht.

6. Ausbildung

1. Entfernen Sie die Fliegen aus der passenden Durchstechflasche (Schritt 4.2) mit CO ₂ und trennen Sie die vorgedrungenen Weibchen von den Männchen.
2. Mit dem Aspirator fügen Sie eine einzelne anästhesierte, vorbereitete Frau zu jeder Vertiefung in einer Reihe eines neuen Wohnblocks hinzu.
3. Mit dem Aspirator und ohne Anästhesie einen einzelnen, naiven Mann aus dem in Schritt 5.2 aufgebauten Gehäuseblock in die Wanne bringen, die eine vorgebildete Frau enthält. Nachdem der Mann in den Brunnen gelegt wurde, sofort mit der Klebefolie wieder abdichten; Erlaube dem männlichen nicht zu entkommen.
   HINWEIS: Übertragen Sie die männlichen Fliegen vom Aspirator zum Wohnblock, indem Sie das natürliche "negative Geotaxis" -Verfahren ausnutzen (siehe Diskussion).
4. Wiederholen Sie die Schritte6.2-6.3 bis genügend männlich-weibliche Paare hergestellt sind. Idealerweise stellen Sie 24 Paare, zwei volle Reihen eines Wohnblocks, pro Genotyp. Lassen Sie die restlichen naiven Männer in den ursprünglichen Wohnblock, der in Schritt 5.2 eingerichtet wurde.
5. Lassen Sie die männlich-weiblichen Paare während des Trainings ungestört ( Tabelle 2 , Abbildung 1B ).
   HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Männchen Gericht und wird von der vorgestellten Frau abgelehnt. Für das Lernen und STM ist die Ausbildungszeit 1 h und für LTM die Ausbildungszeit 7-9 h.
6. Beenden Sie das Training ( Tabelle 2 , Abbildung 1B ), indem Sie einen Aspirator verwenden, um das Männchen vorsichtig von der vorgestellten Frau zu trennen; Verwenden Sie keine Anästhesie. Setzen Sie den abgetrennten Mann in einen neuen Wohnblock.
7. Benutze den Aspirator, um alle naiven Männchen sanft und ohne Anästhesie aus dem in Schritt 5.2 aufgebauten Gehäuseblock in einen neuen Wohnblock zu bringen.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional für STM und LeaRning, aber es ist sehr wichtig für LTM, weil die Fliegen für weitere 24 Stunden untergebracht sind, um LTM zu testen.
8. Für STM und LTM können die Männchen vor dem Testen 1 Stunde bzw. 24 Stunden ( Tabelle 2 , Abbildung 1B ) ruhen (Schritt 7).
9. Für das Lernen, sofort testen die geschulten und naiven Männer (Schritt 7).

7. Prüfung

1. Sammeln Sie Fliegen aus Paarungsfläschchen (Schritt 4.2) mit CO ₂ und trennen Sie die vorgedrungenen Weibchen von den Männchen.
2. Lassen Sie die Weibchen von der Anästhesie für mindestens 1 Stunde in einer Durchstechflasche mit normaler Nahrung erholen.
3. Montieren Sie die Videorecorder im Voraus (Abbildung 2C ), um alle Geräte vor dem Test zu starten.
4. Starten Sie die Tests nach den verschiedenen Zeitleisten für Lernen, STM und LTM ( Tabelle 2 , Abbildung 1B ). Führen Sie die Tests sofort nach dem Training durchZum Lernen, 1 h nach dem Training für STM und 24 h nach dem Training für LTM.
5. Benutzen Sie den Aspirator, nehmen Sie vorsichtig ein einzelnes Männchen aus dem ruhenden Gehäuseblock oder aus dem Trainingsgehäuseblock, wenn das Lernen getestet wird (Schritt 6.7, trainiert, Schritt 6.8, naiv) bis zur Hälfte einer Balkenarena, wobei der Teiler geschlossen ist (Abbildung 2D Siehe Datei S1 für einen Bauplan).
   HINWEIS: Die Verwendung des natürlichen "negativen Geotaxis" -Verfahrens sollte ausreichen, um die männlichen Fliegen vom Aspirator in die Balz-Arena (Diskussion) zu übertragen.
6. Schnell, aber sanft das Einstiegsloch in die nächste Arena bewegen und Schritt 7.5 wiederholen, bis alle 18 Arenen einen Mann enthalten.
7. Mit dem Aspirator und ohne CO ₂ fügen Sie eine vorbereitete Frau (gesammelt in Schritt 7.2) in die andere Hälfte aller 18 Arenen.
8. Setzen Sie sorgfältig die Balkenkammer unter die Kamera, mit der Öffnung der Brunnen nach unten (Abbildung 2C ).
9. Entfernen Sie den Teiler der Arenen, um eine direkte Interaktion zwischen den Männchen und den vorgebrachten Frauen zu ermöglichen.
10. Sofort die Aufnahme des Verhaltens für mindestens 10 min beginnen.
    HINWEIS: Bei Verwendung eines Zwei-Kamera-Setups kann die parallele Aufzeichnung von zwei Balkenplätzen in überlappenden Zeitrahmen durchgeführt werden, um die Effizienz zu maximieren.
11. Legen Sie die Balz-Arenen mit einem handgehaltenen Staubsauger und lassen Sie die Balzkammer vor der Wiederverwendung belüften.
12. Wiederholen Sie Schritt 7.4-7.11, bis die Prüfung aller Genotypen und Bedingungen ( dh naiv und trainiert) abgeschlossen ist.

8. Video Datenanalyse und Statistik

1. Berechnen Sie den Balzindex (CI), definiert als der Prozentsatz der Zeit, die die männlichen Gerichte während der ersten 10 min der Testperiode für jede einzelne männliche Fliege.
   HINWEIS: Dies kann manuell durch die Beobachtung des stereotypen Balzverhaltens (Abbildung 1A ) oder durch u erfolgenSingen Computer-Software für die automatisierte Quantifizierung von Balzverhalten (Diskussion).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 40-60 Männer pro Zustand im Laufe von drei Tagen zu analysieren, um eine ausreichende statistische Kraft zu erreichen und die Konsistenz der CI-Daten zu beurteilen.
2. Berechnen Sie den Lernindex (LI), definiert als die prozentuale Verringerung des mittleren CI von ausgebildeten Männern im Vergleich zu naiven Männern (LI = (CI _naive - CI _trainiert ) / CI _naiv ). Bewerten Sie die LI für jeden Tag der Prüfung und vergleichen Sie sie mit dem kumulativen LI berechnet aus allen Test Tagen kombiniert.
3. Machen Sie eine separate zweispaltige Tab-Datendatei mit "Genotyp" und "CI" als Header.
   HINWEIS: Bei diesen Überschriften handelt es sich um Groß- / Kleinschreibung. Der Name des Genotyps für jedes CI muss aus einer Beschreibung des Genotyps bestehen, gefolgt von einem Unterstrich und der Trainingsbedingung ( zB Genotyp_N und Genotyp_LTM, etc., wobei N = naiv und LTM = LangzeitErinnerung; Siehe Ergänzende Datei S2 für ein Beispiel). Diese Annotation ist wichtig, da die Funktion analearn trainierte und naive Fliegen anhand der nach dem ersten Unterstrich in der Spalte "Genotyp" vorhandenen Zeichen identifiziert.
4. Verwenden Sie das Analearn R-Skript (Supplemental File S3), um einen randomisierten Test durchzuführen, um die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den LI-Werten aus verschiedenen Genotypen zu beurteilen.
   1. Geben Sie das Skript (Ergänzende Datei S3) in R ^{18 ein} , das eine Funktion namens "analearn" definiert.
      HINWEIS: Die Funktionsdefinition lautet: analearn <- function (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Starten Sie die Funktion durch Eingabe von "analearn ()" in der R-Befehlszeile und Auswahl der zu analysierenden Datendatei (erstellt in Schritt 8.3) über das Popup-Fenster.
   3. Wähle die Referenzmutation, welcheIst der Kontroll-Genotyp, indem man die entsprechende Nummer eingibt und Enter drückt.
      HINWEIS: Nach Auswahl des Referenz-Genotyps dauert das Skript einige Sekunden, um 10.000 Bootstrap-Replikate durchzuführen.
   4. Beobachten Sie die Ausgabetabelle (Tabelle 3), die den Genotyp enthält, Lernbedingung ( dh Lernen, STM oder LTM), Mittelwert CI naiv, Mittelwert CI trainiert, LI, die Differenz zwischen dem LI der Kontrolle im Vergleich zur experimentellen Bedingung (LI dif), die untere Grenze (LL) und die obere Grenze (UL) des 95% Konfidenzintervalls des LI dif und der p- Wert, der die Wahrscheinlichkeit angibt, dass es keinen signifikanten Unterschied gibt
      HINWEIS: analearn speichert eine Ausgabetextdatei in dem Verzeichnis, in dem sich die Datendatei befindet. Die Ausgabetabelle erscheint aber auch in der R-Studio-Konsole. Der Standardname wird basierend auf dem Namen der bereitgestellten Datendatei erstellt.
   5. Es gibt mehrere Argumente in der analearn-Funktion, die verwendet werden können, um die de zu ändernFehlereinstellungen der Funktion zur Einstellung der Parameter des Bootstrappings.
      HINWEIS: "nboot" definiert die Anzahl der Bootstrap-Replikate und ist standardmäßig auf 10.000 gesetzt. Dieser Wert kann in jede ganzzahlige Zahl größer als Null geändert werden. Tabelle 5 enthält mehrere Argumente, mit denen die Standardeinstellungen der Funktion geändert werden können. Es wird jedoch nicht empfohlen, Daten zu verwenden, die mit einer geringen Anzahl von Bootstrap-Replikaten erzeugt werden.

Ergebnisse

Der Courtship Conditioning Assay kann verwendet werden, um Lernen und Gedächtnis in Drosophila zu messen. Um dies zu demonstrieren, analysieren die hier vorgestellten Ergebnisse STM und LTM in Kontrollfliegen im Vergleich zu Fliegen mit dem neuronenspezifischen Knockdown von Dhap-at. Kontroll-Männchen exprimieren eine RNA-Interferenz-Haarnadel-Sequenz, die auf ein Caenorhabditis-Elegans-spezifisches Gen, putatives Zinkfinger -Protein C02F5.12 ¹⁹ abzielt . Dieser Kontrollstamm sorgt für eine gleiche Anzahl von Upstream-Aktivierungssequenz- (UAS-) Elementen zwischen dem Knockdown und der Kontrolle im gleichen genetischen Hintergrund, und die Kontroll-RNAi-Haarnadel für alle unspezifischen Effekte des RNAi-Systems. Kontroll-Männchen (Genotyp: UAS-dcr2 / +; P {KK108109} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) zeigen eine signifikante Reduktion des CI in trainierten und naiven für beide STM (Abbildung 3A , p = 1,2 x 10 ^{- 4} , Mann-WhitneY U-Test) und LTM ( Abbildung 3B , p = 1,2 x 10 ^-4 , Mann-Whitney U-Test). Dieses Ergebnis spiegelt die normale Fähigkeit zum Lernen und Gedächtnis in diesen Fliegen. Dhap-at- Knockdown-Fliegen (Genotyp: UAS-dcr2 / +; P {KK101437} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) zeigen auch eine signifikante Reduktion von CI in trainierten versus naiven Fliegen für STM (Abbildung 3A , p = 1,2 x 10 & ^supmin ; & ^sup4 ;, Mann-Whitney-U-Test). Allerdings zeigen sie nach dem LTM-Training keine signifikante Reduktion des CI (Abbildung 3B , p = 0,33, Mann-Whitney U-Test). Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um den mittleren CI von naiven und trainierten Fliegen aufgrund der nichtparametrischen Verteilung der CI-Daten für einige Bedingungen zu vergleichen (Abbildung 3A und 3B ). Die Unterschiede, die durch die Analyse von CIs beobachtet werden, spiegeln sich bei der LI für jeden Genotyp wider, der die prozentuale Reduktion misstIn CI in naiven versus ausgebildeten Fliegen ( Abbildung 3C ). Es gibt keinen signifikanten Unterschied in LI zwischen Kontrollen und Dhap-at-Knockdown-Fliegen für STM ( p = 0,115, 10,000 Bootstrap-Replikate, Abbildung 3C , Tabelle 3 ), während die LI für LTM bei Dhap-at- Knockdown-Fliegen signifikant niedriger ist ( p = 0,0034, 10 000 Bootstrap-Replikate, Fig. 3C , Tabelle 3 ). Für den Vergleich von LI zwischen Genotypen wurde ein Randomisierungstest ²⁰ , der von einem zuerst von Kamyshev et al. ^{7 verwendet} wurde. Da der LI ein einzelner Wert ist, der aus Populationsdaten abgeleitet ist ( dh mittlere CI-naive und mittlere CI-trainierte), gelten standardisierte statistische Methoden, die auf experimentell abgeleiteten Verteilungen beruhen, nicht. Der Randomisierungstest ist verteilungsfrei und verwendet Bootstrapping ( dh zufälliges SampliNg mit Ersatz), um hypothetische Datensätze zu generieren, die aus den tatsächlichen Daten abgeleitet werden. Das Analearn-Skript (Datei S3) erzeugt für jeden Genotyp einen Satz hypothetischer LIs und berechnet den Unterschied zwischen der Kontrolle und dem Testgenotyp (LIdiff). Dieser Vorgang wird 10.000 Mal wiederholt, und die resultierenden Werte werden verwendet, um das 95% Konfidenzintervall von LIdiff zu bestimmen ( Tabelle 3 ). Diese Daten werden verwendet, um einen p- Wert zu erzeugen, der die Wahrscheinlichkeit angibt, dass die LI der beiden Genotypen unterschiedlich ist. Die hier gezeigten Ergebnisse zeigen, dass Dhap-at in Neuronen für LTM, aber nicht für STM erforderlich ist.

Um die tägliche Variabilität zu kontrollieren, werden CIs und LIs zwischen replizierten Tagen verglichen ( Tabelle 4 ). Obwohl einige Schwankungen in LI von Tag zu Tag beobachtet werden, sind die Ergebnisse im Allgemeinen reproduzierbar. Es ist wichtig zu beachten, dass CI-Daten in Abhängigkeit von der Kontrolle str variieren könnenAin verwendet und die Umweltbedingungen der Prüfung. Die hier gezeigten CI-Daten sind typisch für diesen Kontroll-Genotyp, aber andere Genotypen können eine höhere oder niedrigere mittlere CI und Verteilung aufweisen.

Abbildung 1: Ermittlung des Courtship Index und experimentellen Überblicks. ( A ) Bilder, die stereotypen männlichen Balzverhalten gegenüber einer weiblichen Fliege zeigen. Es werden verschiedene Stufen des Balzverhaltens gezeigt: Orientierung (I), nach (II), Flügelvibration (Verlängerung) und Klopfen (III), Lecken (IV) und versuchte Kopulation (V). ( B ) Schematische Übersicht der Trainings- und Testzeiten relativ zum Inkubator-Lichtzyklus, markiert in Stunden. Trainingszeiten sind mit Stäben angegeben, Ruhezeiten für STM und LTM sind gestrichelt angedeutet und der Prüfstartpunkt wird als Pfeil angezeigt. Beachten Sie, dass dieTestzeit für LTM ist der Tag nach dem Training. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Ausrüstung für den Drosophila Courtship Conditioning Assay verwendet. ( A ) Der Gehäuseblock ist ein flacher Bodenboden mit 500 μl Powerfood pro Well. Es wird mit einer qPCR-Klebefolie mit mindestens 4 Löchern pro Well versiegelt, die mit einer Spritzenadel mit einem Durchmesser von 0,8 mm hergestellt wurden. Einzelne Reihen werden in Längsrichtung in Streifen mit einer Rasierklinge geschnitten, um das Öffnen und Schließen zu ermöglichen. ( B ) Der Aspirator ist für den sanften Transfer von männlichen und weiblichen Fliegen ohne die Verwendung von Anästhesie erforderlich. Die Einlage zeigt die Spitze des Aspirators, mit einem Stück Baumwolle zu keEp die Fliegen in der Spitze. ( C ) Aufbau eines Zwei-Kamera-Systems zur gleichzeitigen Aufzeichnung von zwei Balkenkammern. ( D ) Eine Balkenkammer mit 18 Arenen. Schiebeeintrittslöcher werden verwendet, um die Fliegen in die Arenen zu legen. Die weißen Teiler können gleichzeitig geöffnet werden, um die Wechselwirkung zwischen den Männchen und den Weibchen zu initiieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Analyse von STM und LTM in Control und Dhap-at Knockdown Fliegen. ( AB ) Boxplots, die die Verteilung der CI-Werte für naive (N) und trainierte (T) Fliegen der Kontrolle (grau) und Dhap-at Knockdown (weiße) Genotypen, die auf STM (A) und LTM (B) getestet wurden, zeigen. ( C ) KorrespondenzNding LI-Werte für die Steuerung und Dhap-at- Knockdown-Fliegen auf STM und LTM getestet. Unterschiede in LI zwischen Kontroll- und Knockdown-Genotypen wurden mit einem Randomisierungstest (10.000 Bootstrap-Replikate) verglichen. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes an, der aus den an verschiedenen Testtagen berechneten LI-Werten abgeleitet wurde. Die Genotypen sind: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; Und elav-Gal4 / + ( Kontrolle ) Und w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; Und Elav-Gal4 / + ( Dhap-at- RNAi). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

	General	Sammeln	Zug	Test
Tag -11	Starten Sie vorgestellte weibliche Sammlungskulturen (Schritt 1.3)
Tag -10	Starten Sie Kulturen für die Sammlung von männlichen Testpersonen (Schritt 2.2)
Tag 1		Rep. 1
Tag 2		Rep. 2
Tag 3		Rep. 3
Tag 4		Rep. 4	Rep. 1
Tag 5			Rep. 2	Rep. 1
Tag 6			Rep. 3	Rep. 2
Tag 7			Rep. 4	Rep. 3
Tag 8				Rep. 4
Tag 9	Videodatenanalyse und Statistik (Schritt 8)
Rep = wiederholen

Tabelle 1 : Beispiel-Zeitleiste zum Testen von LTM über drei Replikate an einzelnen Tagen.

	Lernen	STM	LTM
Trainings zeit	1 h.	1 h.	8 h.
Ruhezeit	0 h.	1 h.	~ 24 h.
beginne zu trainieren	0H. ALO	0 h. ALO	4 h BLO
Aufhören zu trainieren	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h ALO
Test starten	1 h. ALO	2 h ALO	0 h. ALO (am nächsten Tag)
ALO = nach Lichter einschalten, BLO = vor Lichter einschalten, STM = Kurzzeitspeicher, LTM = Langzeitspeicher

Tabelle 2 : Trainingsdauer, Trainingszeiten und Testzeiten für Lernen, STM und LTM.

Genotyp	Lernen Bedingung	CI naiv	CI Geschult	LI	LI Unterschied	Untere Grenze (95% Konfidenzintervall)	Höchstgrenze (95% Konfidenzintervall)	P-Wert
Steuern	STM	0.467	0,116	0,752	N / A	N / A	N / A	N / A
Dhap-at-RNAi	STM	0.699	0,257	0,633	0.119	-0.030	0,265	0,116
Steuern	LTM	0,590	0,384	0,348	N / A	N / A	N / A	N / A
Dhap-at-RNAi	LTM	0,697	0,650	0,068	0,280	0.103	0.446	0,003

Tabelle 3: Statistische Daten aus dem Analearn-Skript.
Statistische Daten aus dem Analearn-Skript. Die Ausgabedatei des bootstrapping R-Skripts mit dem Genotyp, Lernbedingung ( dh Lernen, STM oder LTM) bedeutet CI naiv, Mittelwert CI trainiert, LI, Differenz zwischen LI der Kontrolle im Vergleich zur experimentellen Bedingung (LI dif) , Die untere Grenze (LL) und die obere Grenze (UL) des 95% Konfidenzintervalls von LI dif und der p- Wert, der die Wahrscheinlichkeit angibt, dass es keinen signifikanten Unterschied gibt

		Steuern			Dhap-at-RNAi
		Durchschnittlich CI naiv	Durchschnittlicher CI trainiert	LI	Durchschnittlich CI naiv	Durchschnittlicher CI trainiert	LI
STM	Tag 1	0,300	0,125	0,584	0.679	0,239	0.648
	Tag 2	0.634	0,107	0,831	0,720	0,266	0,617
	Alle Tage	0.467	0,116	0,752	0.699	0,257	0,633
LTM	Tag 1	0,590	0.441	0,252	0.630	0,646	-0.027
	Tag 2	0,640	0,363	0.432	0.709	0,710	-0.002
	Tag 3	0,547	0,349	0,363	0,738	0,598	0.190
	Alle Tage	0,590	0,384	0,348	0,697	0,650	0,068

Tabelle 4 : CI- und LI-Werte, die an separaten Testtage erhalten wurden.

"Naivelevel" bestimmt den Text, der für jeden Genotyp naive Werte identifiziert. Die Voreinstellung ist "N", aber dies kann in jeden anderen alphanumerischen Text geändert werden.

"Refmutation" ist standardmäßig auf "NA" (nicht zutreffend) eingestellt, kann aber auf den Namen des Controls oder des Genotyps geändert werden, um statistische Vergleiche durchzuführen. Dies führt dazu, dass die sCript, um automatisch den Kontroll-Genotyp auszuwählen.

"Datname" bezieht sich auf den Namen der Datendatei und kann in diesem Argument anstelle der Standard-Dateiauswahl angegeben werden.

"Header" kann verwendet werden, um anzugeben, ob die Datendatei Spaltenüberschriften enthält oder nicht. Die Voreinstellung ist "TRUE", aber eine Datei ohne Header kann verwendet werden, wenn dieses Argument auf "FALSE" geändert wird.

"Seed" initialisiert den Zufallszahlengenerator, der standardmäßig auf "NA" gesetzt ist und bei jedem Einsatz des Skripts eine zufällige Zahl sicherstellt. Durch das Design wird eine Bootstrap-Analyse bei jedem Einsatz mit der gleichen Datendatei etwas unterschiedliche Ergebnisse liefern. Wenn der Samen durch irgendeine ganzzahlige Zahl größer als Null spezifiziert wird, wird der gleiche Satz von zufälligen Bootstrap-Samples erhalten.

"ausschreiben Put "kann auf" TRUE "oder" FALSE "gesetzt werden, um festzustellen, ob eine Ausgabedatei erzeugt werden soll. Die Voreinstellung ist "TRUE".

Tabelle 5: Argumente, die in der Analearn-Funktion verwendet werden, die die Standardeinstellungen der Funktion ändern kann, um die Parameter des Bootstrappings anzupassen

Ergänzende Akte S1: Bauplan einer Balzkammer. Die Datei kann mit jeder Anwendung geöffnet werden, die .stp-Erweiterungen (CAD-Dateien) erlaubt . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei S2 : Beispiel einer Eingabedatei für das Analearn-Skript .S2.zip "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei S3 : Die Analearn.R Acript. Die Datei kann mit R-studio ¹⁸ geöffnet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Der Courtship Conditioning Assay ist ein klassisches Paradigma für die Analyse von Lernen und Gedächtnis in Drosophila . Das hier vorgestellte Protokoll folgt der oben beschriebenen allgemeinen Methodik ^{6 , 7 , 8 , 9} , enthält aber auch einzigartige Aspekte wie praktische Leitlinien, Fachgeräte und ein Datenanalyse-Skript ^{9 , 12} für Randomisierungstests. Mit diesem Protokoll ist es möglich, eine große Anzahl von Fliegen parallel mit 96-Well-Flat-Bottom-Blöcken zu analysieren ( Abbildung 2A ), um Männer zu sammeln und zu trainieren. Die Blöcke sind mit PCR-Klebefolie versiegelt, was die Fliegen bei Bedarf leicht zugänglich macht. Darüber hinaus erlauben die hier beschriebenen eindeutigen Balkenkammern die gleichzeitige Paarung von 18 männlich-weiblichen Paaren in einem fast zweidimensionalen Raum, den iS optimal für die Videoanalyse. Die kundenspezifischen Balkenkammern sind einfach zu bedienen und ein Bauplan ist vorgesehen ( Datei S1 , Abbildung 2D ). Dieses Protokoll, von der Erstellung der Kulturen, die zum Sammeln von Testpersonen zur Erfassung von Videodaten verwendet werden, dauert etwa 20 Tage ( Tabelle 1 ). Für die Analyse von Videodaten ist eine zusätzliche Zeit erforderlich. Nach unserer Erfahrung ist der STM-Test äußerst robust. Der LTM-Assay ist auch ziemlich robust, aber es ist empfindlicher gegenüber verwechslungsreichen Umgebungsvariablen und kann daher schwerer zu meistern sein.

Tierisches Verhalten kann sehr variabel sein. Daher müssen kritische Schritte im Protokoll mit Sorgfalt durchgeführt werden, um diese Varianz zu reduzieren. Zuerst wird die sanfte Verwendung des Saugers ( Bild 2B ) die Belastung verringern, die durch eine grobe Handhabung oder durch zu starkes Ausblasen verursacht werden kann. Eine vorgeschlagene Methode zur Übertragung von EinzelpersonenFliegt aus dem aspirator ist mit negativen geotaxis. Als Fliegen dazu neigen, aufzustehen, kann man einfach die Spitze des Aspirators nach oben zeigen; Kurz bevor die Fliege die Spitze erreicht, reicht ein sanfter Schlag aus, um die Fliege auszulassen. Darüber hinaus, um die Männer in die Balzkammern vor dem Testen zu lassen, ist ein Schlag oft nicht notwendig.

Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Sammlung und Generierung von männlichen Testpersonen. Alle Männer müssen gesammelt werden, wenn sie sehr jung und sozial naiv sind. Dies kann durch häufige Erhebung während der Spitzenzeiten der Eklosion erreicht werden (Schritt 5.2). Wenn Männer nicht in diesem engen Zeitrahmen gesammelt werden, können sie frühe soziale Interaktionen haben, die zu einem schlechten Lernen oder einer hohen Variabilität in CI führen können. Ein weiterer Faktor der männlichen Testpersonen, die beurteilt werden sollten, ist der genetische Hintergrund. Verschiedene genetische Hintergründe zeigen unterschiedliche Ebenen der naiven Balz und können sich auch in der allgemeinen Aktivität oder Bewegungsfähigkeit unterscheiden. Wenn compaRing mehrere Genotypen, Pflege sollte in Bezug auf genetischen Hintergrund genommen werden, um diese verstörenden Faktoren, die LI-Scores beeinflussen können, zu vermeiden. Darüber hinaus sollte die Verteilung der CI-Daten sorgfältig beurteilt werden. CI-Daten können sowohl parametrisch als auch nicht parametrisch sein, abhängig vom Genotyp oder anderen Umgebungsfaktoren. In einigen Fällen, wenn die Verteilung von CI drastisch weg von einer normalen Verteilung entfernt ist, kann es besser sein, den Median-CI zu verwenden, anstatt den Mittelwert für die Berechnung von LIs. Nach unserer Erfahrung macht die Verwendung von medianem oder mittlerem CI jedoch keinen Unterschied in der statistischen Interpretation der Daten, und die Verwendung des mittleren CI ist die übliche Praxis in der Literatur.

Für eine erfolgreiche Balzkonditionierung ist die aktive Ablehnung von männlichen Balzversuchen durch vorgebrachte Frauen während der Trainingszeit entscheidend. Es ist wichtig zu gewährleisten, dass die vorangegangenen Frauen in diesem Assay verwendet wurden effizient verpaart und sindDamit keine Kopulation. Diese Vormischung wird in den zusammenpassenden Fläschchen hergestellt, die in Schritt 4 hergestellt wurden, wo männliche und weibliche Fliegen für 4 Tage zusammengehalten werden ( Tabelle 1 ). Anschließend kann die Paarung durch regelmäßige Prüfung von Testvideos und durch Beobachtung von männlich-weiblichen Paaren während des Trainings überwacht werden. Wenn eine Paarung stattfindet, gibt es mehrere Maßnahmen, die bei der Vorbereitung von vorgedrungenen Weibchen eingenommen werden können. Zuerst sollten vorzeitige Frauen unter optimalen Zuchtbedingungen aufgezogen werden. Phiolen können mit Hefepaste und einem gefalteten Filterpapier ergänzt werden, um die potentiellen Gegenflächen zu vergrößern. Die Inkubation von Fliegen unter den hier beschriebenen Bedingungen hat in der Vergangenheit robuste vorgebildete Weibchen hervorgebracht, aber dies kann in verschiedenen Labors und unter Verwendung unterschiedlicher genetischer Belastungen variieren. Daher kann es notwendig sein, die Erzeugung von vorgedrungenen Weibchen durch Variieren der Inkubationszeit und -bedingungen zu optimieren.

Quantifizierung des Balzverhaltens istEin weiterer kritischer Schritt in diesem Protokoll. Dies kann manuell oder automatisch mit spezialisierten Softwareprogrammen erfolgen ⁹ . Automatisierte Quantifizierung ist schnell und grundsätzlich unvoreingenommen. Mehrere Programme wurden veröffentlicht ^{21 , 22 , 23} ; Allerdings sind sie nicht einfach zu bedienen, oft erfordert spezielle Video-Formate und erweiterte rechnerische Fähigkeiten. Manuelle Quantifizierung ist einfach und präzise, ​​aber es ist sehr arbeitsintensiv und unterliegt individueller Variabilität und Bias. Es ist wichtig zu betonen, dass dieses Protokoll nicht die Anforderungen an die Videoformatierung adressiert, die möglicherweise für die automatisierte Quantifizierung von CIs erforderlich sind. Für manuelle Quantifizierung, verwenden Sie alle einfachen Video-Aufnahme-Gerät, das das Potenzial hat, ein Video von ausreichender Qualität zu produzieren, um genau zu beobachten, Balz Verhalten. Für die automatisierte Quantifizierung wird es wahrscheinlich anders seinAnforderungen abhängig von der verwendeten Software, und die Benutzer sollten dies gründlich untersuchen, wenn eine automatisierte Quantifizierung gewünscht wird.

In Kombination mit den umfangreichen Werkzeugen, die für die genetische Manipulation von Fliegen zur Verfügung stehen, bietet der Courtship Conditioning Assay eine robuste Auslesung, die verwendet werden kann, um molekulare Mechanismen und neuronale Netzwerke, die an Lernen und Gedächtnis beteiligt sind, zu sezieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-