البروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية أبداه Hydrogenase [NiFe] للدراسة لأكسدة2 ح

Summary

هنا، نحن تصف تقنية، والبروتين الفيلم كهربية الأشعة تحت الحمراء، مما يسمح للبروتينات الأكسدة المعطل تداولها إلى دراسة سبيكتروسكوبيكالي تحت السيطرة المباشرة الكهروكيميائية في قطب الكربون. يمكن تسجيل أطياف الأشعة تحت الحمراء من عينة واحدة من البروتين في طائفة من الإمكانات التطبيقية وضمن مجموعة متنوعة من شروط الحل.

Abstract

فهم كيمياء الأكسدة والاختزال البروتينات مطالب الطرق التي توفر دقة السيطرة على الأكسدة والاختزال مراكز داخل البروتين. التقنية من البروتين كهربية الفيلم، الذي هو معطلة بروتين على سطح قطب أن يستبدل مسرى المانحين الإلكترون الفسيولوجية أو المتقبلين، وفرت الوظيفية ثاقبة الأكسدة والاختزال ردود فعل طائفة من مختلف البروتينات. فهم كامل الكيميائية يتطلب مراقبة الكهروكيميائية تكون جنبا إلى جنب مع غيرها من التقنيات التي يمكن أن تضيف أفكاراً إضافية الهيكلية والميكانيكية. هنا علينا أن نظهر تقنية، والبروتين الفيلم كهربية الأشعة تحت الحمراء، الذي يجمع بين البروتين الفيلم كهربية مع أخذ العينات الطيفية تحت الحمراء للبروتينات الأكسدة والاختزال. يستخدم التقنية هندسة متعددة-انعكاس انعكاس الكلي الموهنة للتحقيق بروتين الأكسدة معطلة في قطب أسود الكربون مساحة سطح عالية. إدراج هذا القطب في خلية تدفق يسمح الحل الأس الهيدروجيني أو تركيزات ذائبة تغييرها أثناء القياسات. هذه قوية بشكل خاص في معالجة إنزيمات الأكسدة والاختزال، حيث يمكن استمرار الدوران السريع الحفاز وتسيطر على مسرى يسمح المراقبة الطيفية من الأنواع المتوسطة المعمرة في إليه حفاز. علينا أن نظهر هذه التقنية مع تجارب على hydrogenase كولاي 1 تحت دوران (ح₂ الأكسدة) والظروف غير دوران.

Introduction

تحديا رئيسيا في دراسة وظيفة البروتين ينطوي على تطوير أساليب في الموقع التي تسمح للمراقبة المباشرة للقيام بأدوارها الفسيولوجية، أما في فيفو أو استخدام البروتينات عزل عينات البروتين. وهذا يتطلب إدماج عنصر التحكم أو تحريك العمليات إلى إجراءات تجريبية واستخدام التقنيات المركبة التي تسمح لكل مفاعليه تقييم، وخطوات كيميائية فردية خلال وظيفة البروتين تقاس، في نفس الوقت. في حالة الأكسدة البروتينات غالباً ما يعادل هذا الجمع بين التقنيات الكهروكيميائية التي دقة التحكم في إمكانية تطبيق ولكن توفير أية معلومات المواد الكيميائية مباشرة، مع التقنيات الطيفية التي تراعي محددة كيميائيا التغييرات المرتبطة بوظيفة البروتين. ^{1 , 2 , 3} سبيكترويليكتروكهيميستري هو مصطلح عام لمجموعة من الأساليب يزوج الكهروكيميائية والطيفية التي تشمل مجموعة متنوعة من التقنيات الطيفية ومستويات التحكم الكهروكيميائية. كثير من البروتينات يمكن تبادل الإلكترونات مع المانحين الإلكترون مصطنعة، وقابل للذوبان ومتقبلون وهذا تم استغلاله في الدراسات التي تستخدم الجزيئات الصغيرة للتوسط من أجل نقل الإلكترون، بما في ذلك اقتران مع الأشعة فوق البنفسجية-المرئية،^{4،5 , 6 , 7} تلوانيه دائرية مغناطيسية⁸ و الأشعة تحت الحمراء^5،،من^{910،11،12،،}من¹³¹⁴ (الأشعة تحت الحمراء) سبيكتروسكوبيس. في عدد محدود من الحالات أثبتت إمكانية استغلال التبادل الإلكترون نتبلغ، تسيطر على نشرها بين البروتينات واقطاب. ^{15 , 16}

للتفاعلات الحفازة التي تقوم بها إنزيمات الأكسدة والاختزال، حل كهربية النهج الحالي عيب واضح. نقل إلكترون تسيطر على نشرها عبر الوسطاء الأكسدة والاختزال في حل من المحتمل أن يصبح الحد من معدل. المعلومات الحركية والميكانيكية عن الإنزيم قد تضيع، أو على الأقل أصبح من العسير على ديكونفولوتي من المصنوعات اليدوية نشر الناتجة عن الأسلوب التجريبي. التحكم الكهروكيميائية نتبلغ مباشرة، لذلك أداة هامة لدراسة البروتينات الأكسدة والأنزيمات. التقنية من البروتين الفيلم كهربية (أنوع) يستخدم البروتينات الأكسدة والاختزال الكهربائي معطلة، في مثل هذه طريقة أن الإلكترونات يتم تحويلها مباشرة إلى أو من العوامل المساعدة الأكسدة داخل البروتين كما هو الاستقطاب الكهربائي في سلسلة من الإمكانات. ^{17 , 18 , 19} أنوع ذات قيمة خاصة لدراسة تفاعلات أكسدة أو تخفيض تحفزها إنزيمات الأكسدة والاختزال، كما يمكن أن يتحقق نقل الإلكترون السطح البيني بنسبة عالية جداً. على سبيل المثال، كان معدل دوران اليكتروكاتاليتيك hydrogenase ([NiFe]) النيكل-الحديد من فينوسوم اللوتشروماتيوم تقاس أنوع ك كاليفورنيا 1,000-10,000 s¹ ح₂ أكسدة. ²⁰ مسرى المحتملة يعمل كمشغل لتشغيل الحفز 'على' أو 'إيقاف'، والتقارير الحالية التي اليكتروكاتاليتيك على نشاط إنزيم. أنوع ولذلك هو وسيلة قيمة لتحليل التفاعلية للإنزيمات المعقدة التي تعتمد وثيقا على الإمكانات، مثل ردود فعل موقع نشط الحديد دي [FeFe]-هيدروجيناسيس مع شركة وس₂،²¹ أو بفعل الإمكانيات المنظمة ردود فعل هيدروجيناسيس ونازعه أول أكسيد الكربون²² ،²³ وانزيمات الأكسدة المعقدة الأخرى. ²⁴

الحاجز الرئيسي للجمع بين التقنيات الطيفية المباشرة لمراقبة الكهروكيميائية تتيحها أنوع ينشأ من انخفاض التغطية السطحية من إنزيمات الأكسدة والاختزال، بناء على أمر من سم بمول 1-2^-2 ل hydrogenase [NiFe] من فينوسوم أ، ²⁰ بالنسبة إلى في الموقع دراسات العلوم السطحية من جزيء صغير أدسورباتيس على معظم أقطاب معدنية. وهذا يمثل تحديا لحساسية القياس الطيفي. وردت العديد من الأساليب سبيكترويليكتروكهيميكال لدراسة المعطل تداولها البروتينات الأكسدة والاختزال في طائفة من أقطاب مختلفة: مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية في أقطاب شفافة أكسيد المعدن؛ ^{25 , 26 , 27} fluorescence الطيفي في أقطاب الذهب؛ ^{28 , 29} السطح المحسن طيف امتصاص الأشعة تحت الحمراء (سيرة) في أقطاب الذهب؛ ^{30 , 31 , 32 , 33} والسطحي المحسن التقنيات الطيفية رامان، أساسا في أقطاب فضة. ^{34 , 35}

هنا يصف لنا طريقة لاقتران أنوع مع مطيافية الأشعة تحت الحمراء، في أسلوب المعروف بالبروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية (فر). ³⁶ "فر" أسلوب الدراسات إنزيمات الأكسدة والاختزال معطلة على مساحة سطح عالية الكربون قطب كهربائي عمل مقترنة هندسة الأشعة تحت الحمراء (ATR IR) الموهن انعكاس الكلي، استغلال سهولة امتزاز طائفة من البروتينات على سطوح الكربون. مطيافية الأشعة تحت الحمراء مفيد في الدراسات إنزيمات الأكسدة والاختزال والبروتينات بالعديد من الجزيئات الصغيرة، يغاندس والعوامل المساعدة التشخيصية أبسوربانسيس التي يمكن استخدامها لتقييم حالة تفاعلية، ملزمة، وتثبيط والأكسدة والاختزال. وتشمل الأمثلة ملزم لا لمراكز كبريت الحديد،³⁷ دراسة فلافوبروتينس،^38،39،40 جزيء صغير ملزمة لمراكز الهيم إلخ. ⁴¹ هندسة ATR، الأشعة تحت الحمراء يسمح بناء الخلايا الكهروكيميائية الأمثل ثلاث قطب كهربائي (الطيف)⁴² وذلك يوفر تحكم الكهروكيميائية ممتازة. المقاومة الحل والانجراف المحتملة إلى أدنى حد عن طريق وضع قطب إشارة قريبة من مسرى العامل. وتستخدم أقطاب مكافحة ارتفاع المساحة السطحية التي تتوافق مع التيارات اليكتروكاتاليتيك العالية التي تنتجها الإنزيم سرعة دوران في مسرى العامل. يسمح تدفق للحل من خلال خلية سبيكترويليكتروكهيميكال السطحية السيطرة على تركيز ركازات ومثبطات الأس الهيدروجيني. ^{36 , 43 , 44} "بفيري" الأسلوب التالي يسمح أطياف الأشعة تحت الحمراء أن تكون مسجل في الموقع أثناء اليكتروكاتاليسيس الإنزيم المطرد. ^{36 , 44} فر أيضا قادرة على توفير المعلومات عن المواد الكيميائية في الغياب الحافز الحالية،⁴³ وعلى النقيض من أنوع حيث يمكن أن يكون من الصعب على استخراج المعلومات من العمليات غير الحفاز في إنزيمات الأكسدة والاختزال. ^{45 , 46}

لقد أظهرنا أسلوب دراسة أكسدة₂ اليكتروكاتاليتيك ح فر قبل هيدروجيناسيس [NiFe]، التي تحتوي على يغاندس CO و CN الذاتية منسقة للحديد في موقع نشط نظام المعدنين. ^{36 , 43 ,} ولذلك يتم هيدروجيناسيس ⁴⁴ [NiFe] وبشكل خاص يناسب للدراسة التي فر. الأسلوب فر يوفر معلومات حول الأنواع التي تكون موجودة أثناء دوران مرتفع-الدولة، ويوفر البصيرة الميكانيكية الحاسمة بالإضافة إلى ثروة الأدب ولذلك في مطيافية الأشعة تحت الحمراء من هيدروجيناسيس دون تحكم تجريبية على مدى دوران. ^{47 , 48} داير وزملاء العمل وقد استخدمت أساليب الأشعة تحت الحمراء حل الوقت لدراسة NiFe هيدروجيناسيس،^،،من⁴⁹⁵⁰⁵¹ باستخدام مشغل خفيفة أما تطبيق خطوة محتملة سلبية صغيرة (عن طريق استخدام الوسطاء الحل ومصدر إلكترون 'قفص') أو الماء هيدريد منضم. على الرغم من أن طريقة فر لا يمكن، في الوقت الحاضر، تقدم وقت القرار لتطابق هذه القياسات،⁴⁰ من السماح لدراسة العمليات الحفاز كل مطالباته والأكسدة، الوصول إلى طائفة من إمكانات محددة تحديداً جيدا وخالية من النقل الجماعي القيود.

الأسلوب فر يختلف عن دراسات سيرة البروتينات الأكسدة، والتي أيضا هندسة ATR الأشعة تحت الحمراء استخدام وتوظيف قطب معدني خشن النانو لتعزيز امتصاص الأشعة تحت الحمراء لجزيئات تمتز على سطح القطب. ³⁰ سيرة وتقنية قيمة للغاية لدراسة البروتينات الغشاء، لا سيما تمتز على أو داخل الغشاء mimetic أبنية،³² ولكن الحاجة قطب معادن يمكن أن يحد من نطاق الركيزة ومثبط سبب مفاعليه دعم القطب نحو الجزيئات الصغيرة مثل أول أكسيد الكربون، CN^–، وأول أكسيد الكربون₂ إلخ يمكن الحد من بروتون والامتزاز أحادي الطبقة الذاتي تجميعها إشكالية على الأسطح المعدنية في إمكانيات سلبية جداً،^1،52 على الرغم من أن إنزيم اليكتروكاتاليسيس في غير المحمية معدنية أقطاب أبلغ. ^{53 , 54} عيب فر بالنسبة إلى سيرة هو صعوبة نسبية إدماج بروتينات الغشاء في أبنية الغشاء الأصلي أو ميميتيك. ومع ذلك، يجعل يفرط الكيميائي النسبي من أقطاب الكربون جزيء الصغيرة المتنافسة تنشيط ردود فعل فر تقنية ممتازة لدراسة إنزيم اليكتروكاتاليسيس، لا سيما في المجال المنخفضة القدرة ذات الصلة للأكسدة البيولوجية العمليات مثل بروتون الحد من هيدروجيناسيس. ^{1 , 43}

والهدف من هذه المادة هو الأخذ بالأسلوب فر كأسلوب لدراسة البروتينات الأكسدة والاختزال الكهربائي معطلة، واستخدام hydrogenase NiFe 1 (Hyd1) من الإشريكيّة القولونية كمثال. وتناقش الاعتبارات المتعلقة بإعداد عينة، الحاجة إلى تدفق الركازة جيدة، ومعالجة البيانات. فر وهو أسلوب المطبقة على نطاق واسع، مناسبة تماما لدراسة أي البروتين الأكسدة والاختزال (مع خصائص الأشعة تحت الحمراء أبسوربانسيس) التي يمكن أن تكون تمتز فوق الأقطاب الكربونية، أما مباشرة أو باستخدام تعديل السطح، بأنه يمكن تبادل الإلكترونات مع قطب كهربائي.

Protocol

1-إعادة إنشاء المقصورة الداخلية عينة من مطياف فتير الداخل الدرج الأمامي اللاهوائية، الجافة والمتطلبات العامة التجريبية

1. استخدام مطياف فتير تجارية مجهزة الزئبق الخارجية الكادميوم تيلوريد (MCT) كاشف والتبعي ATR. تطهير جسم المطياف مع الهواء الجاف أو رباعي، أو بدلاً من ذلك استخدام مطياف مع مقاعد البدلاء بصرية الذين تم إجلاؤهم.
2. ضع المطياف على طاولة مستقرة وخالية من الاهتزاز في نفس ارتفاع أهوائي (< 1 جزء في المليون س₂)، جاف الدرج الأمامي (نقطة الندى <-75 درجة مئوية). تحويل شعاع المطياف الأشعة تحت الحمراء إلى الدرج الأمامي، من خلال نافذة الأشعة تحت الحمراء شفافة التي كبيرة بما يكفي لاستيعاب شعاع الأبعاد.
   ملاحظة: من المهم أن المسافة بين الدرج الأمامي ومطياف أيضا إزالة أو إجلاء، خاصة إذا كانت مادة نافذة بلوري، مثل كلوريد الصوديوم أو شركة KBr، على سبيل المثال، يتم استخدام.
3. إجراء نسخ متماثل المقصورة الداخلية عينة من المطياف داخل الدرج الأمامي.
   1. توجيه الشعاع الداخل الدرج الأمامي على مرآة ارتفاعات خارج المحور، مثالي مع طول نفس التنسيق كمرآة والمطياف التركيز الداخلي.
      ملاحظة: من المفيد أن اثنين من المرايا طائرة إضافية وضعت قبل هذا التركيز مرآة، بغية السماح للارتفاع واتجاه شعاع الأشعة تحت الحمراء إلى تعديل داخل الدرج الأمامي؛ هذا وسوف يعوض أي عدم الدقة في وضع الأولية المطياف.
   2. ضع كاشف MCT خارجية، التركيز البصري (مثل عدسة قصيرة البعد البؤري زنسي أو مرآة مكافئ خارج المحور، مع طول بؤري قصير) داخل الدرج الأمامي، كاملة بمناسبة وضع مثل تكرار أبعاد العينة الداخلية مقصورة المطياف.
   3. ضبط 'محور' شعاع الأشعة تحت الحمراء لتكون على مسافة واحدة تقريبا بين مرآة التركيز وكاشف MCT.
4. بارد ديوار كاشف MCT الخارجية مع النتروجين السائل.
5. جبل الملحقات ATR في حجرة العينة الدرج الأمامي. محاذاة من الإدخال والإخراج تركز ATR التبعي لتحقيق أقصى قدر من الإنتاجية إلى كاشف MCT والبصريات. إذا لزم الأمر، استخدم فتحه أو توهين مناسبة أخرى (مثل شبكة أسلاك) لمنع أوفيرساتوريشن من الكشف عن إشارة.
   ملاحظة: للحصول على البيانات المعروضة هنا، ملحق ATR خمسة-تفكير مع جميع البصريات العاكسة و Si المنحرف القابلة للإزالة عنصر التأمل الداخلي (غضب) يستخدم (Crystal GmbH، أبعاد كاليفورنيا 5 × 8 × 1 مم³، زاوية الوجه 39.5 درجة). محمل غضب في اللوح الأساس القابل للإزالة تشكيلة من إيثر البروم ثنائي الفينيل كيتون (نظرة خاطفة).
6. استخدام الدرج الأمامي للبيت حجرة العينة صوغه مع فيدثروغس مناسبة للسماح بالاتصال بوتينتيوستات إيواء خارجياً (الغاز ضيق BNC اتصالات مفيدة لهذا الغرض)، وصول الغاز، وصغير لنقل الإشارات من MCT كاشف. من المهم أن تحتفظ بأي التدريع على الكابل كاشف لتجنب إدخال الضوضاء أو التدخل للقياسات.
7. مكان مضخة تمعجية، قادرة على معدلات تدفق أكبر من 60 مل/دقيقة داخل الدرج الأمامي. رؤية تخطيطية والمطياف، ATR التبعي، تحوي مضخة بوتينتيوستات الإعداد ويرد في الشكل 1.
8. إنشاء خلية سبيكترويليكتروكهيميكال، مثل التي تظهر تخطيطياً في الشكل 2، أن الأختام على أية تي آر التبعي. يجب أن تحتوي الخلية على قطب كهربائي عداد مساحة سطحية عالية (Pt الأسلاك أو شاش)، واتصال للعامل الكهربائي (قضبان الكربون) ومسرى مرجع مصغر. يجب أن تحتوي الخلية على منافذ إضافية اثنين على الأقل كمدخل ومخرج للتدفق السريع للحلول من خلال الخلية.
   ملاحظة: قطب مرجع كالومل مشبعة مصغرة مثالية لهذا الغرض. ³⁶

2-إعداد جسيمات الكربون الأسود تعديل مع Hydrogenase كولاي 1

1. في 'ويت' اللاهوائية الدرج الأمامي، مزيج 20 ملغ مساحة السطحية العالية جزيئات الكربون الأسود (> 1000 متر³/g) مع 1 مل أولتراهيغ نقاء المياه (المقاومة > 18 MΩ سم) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. تفريق الجزيئات التي sonication طاقة منخفضة (< 100 واط) لمدة 15 دقيقة على الأقل، أو حتى التشتت موحدة ولا لا من الرواسب ضمن ح 1، لإعطاء تشتت أسود الكربون مع تحميل حوالي 20 ملغ/مل.
2. تأخذ قاسمة hydrogenase كولاي 1 (Hyd1، حوالي 50 ميليلتر، أعدت وفقا لإجراء منشورة⁵⁵) بتركيز البروتين ~ 7 مغ/مل وتبادل ذلك إلى المخزن مؤقت منخفضة قوة الأيونية في درجة حموضة القرب من نقطة isoelectric ( مثال البوتاسيوم الفوسفات، 15 ملم، pH 5.8، لا الملح إضافية). لتحقيق أفضل النتائج، استخدم تحضير إنزيم النشط قدر الإمكان. أداء exchange المخزن المؤقت بتركيز وتمييع، في جهاز الطرد مركزي تصفية مع وزن الجزيئي مناسب استقطاع (50 كاتشين يعمل جيدا بالنسبة ل Hyd1).
   1. إضافة Hyd1 إلى جهاز عامل التصفية.
   2. تضعف مع ميليلتر حوالي 450 من مخزن exchange.
   3. ريكونسينتراتي إلى وحدة تخزين 50 ميليلتر استخدام الطرد المركزي خفيفة (< ~ 2700 × ز) لمنع هطول الأمطار لا رجعة فيه.
   4. كرر الخطوات من 2.2.2 و 2.2.3 حتى اكتمال exchange المخزن المؤقت (عادة ضمن دورات ~ 5).
3. مزيج تشتت أسود الكربون (أعد في 2.1) وحدة تخزين 5 ميليلتر من 20 ملغ/مل مع قاسمة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت-وتبادل Hyd1. تخزين الخليط إنزيم الجسيمات في ثلاجة (عند 0 درجة مئوية) بين عشية وضحاها للسماح للانزيم الجسميات. قد يكون من الضروري على يهز الخليط أحياناً لضمان الجسيمات تظل مشتتة.
4. أغسل الجسيمات المعدلة Hyd1 مع المخزن المؤقت منخفضة القوة الأيونية (فوسفات البوتاسيوم، 15 ملم، ودرجة الحموضة 5.8، لا الملح إضافية) بدورات المتتالية الترسيب وإعادة انتشارها في ميكروسينتريفوجي (~ 2,700 × ز). كرر هذه العملية من 3-5 مرات لإزالة الإنزيم غير تمتز.
   ملاحظة: قبل الغسيل الأولى ينبغي أن تكون المادة طافية عديم اللون تقريبا، تشير إلى الامتزاز جيدة للانزيم.
5. تركز الجزيئات لوحدة تخزين نهائي من ~ 5 ميليلتر، لإعطاء تحميل نهائي ~ 20 ملغ/مل من جزيئات الإنزيم معدلة.
   ملاحظة: الجسيمات المعدلة Hyd1 يمكن تخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين إذا كانوا لا يزالون رطب؛ وهذا يتحقق على أفضل وجه عن طريق تخزين الجسيمات تضعف مع ~ 50 ميليلتر من الماء نقاء أولتراهيغ.

3-التحضير للقياسات فر على Hydrogenase كولاي 1

1. تنظيف غضب Si سونيكيشن بالطاقة المنخفضة (< 100 W)، أولاً في ح₂حتى₄ (< 90% w/w) ~ 15 دقيقة، ومن ثم في HNO₃ (70% w/w) ليصل إلى 1 ساعة. ينبغي أن يؤدي هذا الإجراء التنظيف إلى سطح غضب ماء. إذا كان كذلك التنظيف مطلوب غضب يمكن أن توضع في حل البيرانا (بنسبة 1:3 ح₂س₂: ح₂هكذا₄) لأكسدة المواد العضوية المتبقية أي.
   ملاحظة: قد لا تكون قاسية أساليب التنظيف الحمضية مناسبة للاستخدام مع جميع المواد غضب. الحل البيرانا تآكل عالية والأسطح أكسدة قوية، ينبغي أن تكون نظيفة معقولة قبل استخدام حل البيرانا والرعاية ينبغي أن تؤخذ أثناء إعداد واستخدام حل البيرانا بسبب طبيعة طارد عملية--دائماً إضافة ح₂س ₂ ببطء إلى ح₂هكذا₄ والرجوع إلى إجراءات السلامة المناسبة لإعداد واستخدامها والتخلص منها.
2. شطف غضب نظيفة في نقاء أولتراهيغ المياه، والجاف تحت تيار غاز النيتروجين الجاف. القيام بجميع مناولة المنشور باستخدام الملقط نظيفة لتجنب التلوث.
3. ختم غضب في اللوح الأساس التبعي ATR استخدام شريحة رقيقة من تسرب السيليكون الكهربائية الصف. الحرص على الحد من التسرب إلى حواف غضب. تسمح تسرب لتجف تماما.
4. نقل اللوح الأساس ATR التبعي للدرج الأمامي مطياف وجبل على الملحقات ATR. مسح قياس طيف إشارة (خلفية) بين 4000-1,000 سم^-1 في القرار^-1 4 سم، سرعة قياسية باستخدام طريقة والمطياف و 1024 إينتيرفيروجرامس متوسط (قياس الوقت ~ 3-5 دقيقة). استخدام هذا الطيف كمدخل للسماح بعملية حسابية لامتصاص الأطياف في وقت لاحق في التجربة.
   ملاحظة: بسبب امتصاص الصغيرة المتوقع للموقع النشط Hyd1 من الضروري جمع الأطياف مع إشارة عالية لنسب الضوضاء.
5. نقل اللوح الأساس التبعي ATR على الدرج الأمامي 'ويت' الذي يحتوي على تشتت الجسيمات المعدلة Hyd1 المعدة مسبقاً (القسم 2). قطره الصب قاسمة 1 ميليلتر من تشتت الجسيمات على وجه كبير من غضب، ونشرها بشكل متساو عبر السطح. ملاحظة: لا تسمح الجسيمات لتصبح جافة تماما في غضب.
6. قص قطعة من الورق الكربون، مثل تلك المستخدمة كمواد طبقة نشر الغاز في خلايا الوقود، إلى ~0.1 حجم ملم أصغر من أبعاد السطحية من غضب (أي ca. 8.2 × 4.9 م²). المساحة السطحية لورق الكربون ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية الجسيمات المعدلة Hyd1 قطره--المدلى بها، ولكن ليست كبيرة جداً بحيث تتداخل تسرب السيليكون المستخدمة للحصول على غضب. نقع ورق الكربون في المياه، ووضعه برفق على الجزء العلوي من الفيلم الجسيمات. سوف تقدم في ورقة الكربون اتصال كهربائي جيد عبر الفيلم كله الجسيمات.
   ملاحظة: أنه مفيد لإعداد عدة قطع من ورق الكربون مقدما، وتخزينها مسبقاً غارقة في المياه الطهارة أولتراهيغ داخل الدرج الأمامي اللاهوائية 'ويت'.
7. تحميل الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال (الموصوفة في 1.7 وسيظهر تخطيطياً في الشكل 2) على مدى غضب، وتأمينه في اللوح الأساس بمسامير. إضافة ~ 200 ميليلتر من المخزن المؤقت التجريبي للحفاظ على الإنزيم رطب. نظام مختلط من المخزن مؤقت، قادرة على التخزين المؤقت عبر طائفة واسعة من درجة حموضة، مفيد للدراسات في هيدروجيناسيس NiFe: خلات الصوديوم⁵⁶ ، 2-[N'-morpholino] حمض الإيثان سولفونيك (MES)، N'-الببرازين [2-هيدروكسيثيل]-N' -[حمض 2-الإيثان-سولفونيك] (حبيس)، N'-تريس [هيدروكسيميثيل] حامض الميثيل-3-أمينو-البروبان-سولفونيك (الصنابير)، و 2-[ن'--سيكلوهيكسيلامينو] حمض الإيثان سولفونيك (أ)، مع كل مكون بتركيز نهائي 15 ملم و يحتوي على 0.1 م تتركز كلوريد الصوديوم كدعم الكهرباء، مع تعديلها باستخدام الرقم الهيدروجيني 6 الحموضة هيدروكسيد الصوديوم و HCl.
   ملاحظة: ينبغي أن تبرز الاتصال الكهربائي العامل قليلاً أدناه طائرة أعلى الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال (~0.1 ملم) لضمان اتصال إلكترونية جيدة لورق الكربون (الشكل 2).
8. الاتصال حل مدخل ومخرج من الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال بنظام تدفق التي تحتوي على أنابيب مضخة تمعجية وقنينة من المخزن المؤقت التجريبي. نقل الخلية المجتمعون إلى الدرج الأمامي 'جافة' تتضمن والمطياف.
9. تحميل الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال الجمعية العامة على الملحقات ATR. الاتصال العامل والعداد واقطاب المرجعية بوتينتيوستات. قم بتوصيل أنابيب مضخة تمعجية المضخة.
10. سجل طيف امتصاص مع إينتيرفيروجرامس 1024 في المتوسط في القرار^-1 4 سم على نطاق طيفي من سم 4,000-1,000^-1، استخدام الطيف التي جمعت في 3.4 كخلفية مرجعية. عند هذه النقطة يجب أن تحتوي على الطائفة كبيرة (> 100 mO.D.) أميد الفرق الثاني في سم ~ 1,540^-1 وعصابات الموقع النشط من Hyd1 ينبغي أن يكون واضحا في المنطقة الطيفية سم 1,850-2,150^-1، إلى حد كبير في الدول المؤكسد، غير نشط (رقم 3 ).

4-تفعيل Hydrogenase كولاي 1 واختبار الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال

1. تطبيق إمكانية تخفيض (V −0.8 مقابل SCE) على الفيلم الجسيمات تعديل Hyd1. تشبع المخزن المؤقت التجريبي مع المخزن ح₂ وتدفق ببطء من خلال خلية سبيكترويليكتروكهيميكال. اترك العينة بين عشية وضحاها تنشيط بالكامل Hyd1.
   ملاحظة: من المهم استخدام اللاهوائية ح₂, N₂ إلخ، وحتى يتسنى لجميع الغازات اللاهوائية يجب تمريرها من خلال عامل تصفية₂ س.
2. سجل طيف امتصاص العينة بعد التنشيط. Ν_CO و الخامس_أهي عصابات من الموقع النشط يجب أن يظهر الآن توزيع الدول مخفضة، 'النشط'. هذا هو الأكثر سهولة لاحظ من خلال استخدام طيف فرق، بالنسبة إلى الطيف، سجلت في 3.10 (الشكل 4).
3. اختبار التوصيل الكهربائي من الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال. للقيام بذلك، تشبع المخزن المؤقت التجريبي مع الغاز₂ ن. تطبيق تسلسل المؤكسدة (0 V مقابل لجنة الخبراء الدائمة) والحد من إمكانات (V −0.8 مقابل SCE) (من كاليفورنيا لمدة 30 دقيقة) للفيلم Hyd1 تعديل الجسيمات، وسجل طيف امتصاص في كل. أصبحت سرعة تتأكسد Hyd1 وخفض، وإذا كان الفيلم الجسيمات متصل جيدا 100% من أفراد العينة أن تستجيب لإمكانية تطبيقها.
4. تعيين معدل تدفق مناسب من المخزن المؤقت التجريبي. للقيام بذلك، تطبيق إمكانية تخفيض (V −0.8 مقابل لجنة الخبراء الدائمة) للعينة، وتشبع المخزن المؤقت التجريبي مع ح₂. تسجيل سلسلة من فولتاموجرامس دوري بين-0.707-0.039 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة بمعدل 10 mV/س. تفحص تدريجيا بزيادة معدل تدفق ح₂-العازلة المشبعة بين فولتاموجرامس حتى يشبه وافيشابي الحفاز في التناوب مستو القرص الكهربائي⁵⁵ وأقصى تيار مستقل عن معدل التدفق (الشكل 5).
   ملاحظة: حد الذوبان ح₂ في المياه مم ~0.8 في 293 كلفن و 1 بار.
5. كما النموذج جاهز الآن للقياسات فر، جمع الأطياف في طائفة من الإمكانات، ضمن مجموعة من شروط الحل (درجة الحموضة، درجة الحرارة، تركيز₂ ح إلخ). تسجيل جميع بيانات الكهروكيميائية باستخدام البرمجيات بوتينتيوستات، من المهم أن تكون قادرة على ربط البيانات الطيفية والكهروكيميائيه، خصوصا عند دراسة العمليات اليكتروكاتاليتيك مثل أكسدة₂ ح من Hyd1.

5. التعامل مع البيانات الطيفية

1. التأكد من أن موقع نشط لم يتم بشكل دائم تغيير أثناء القياسات عن طريق تسجيل الأطياف في 0 V و −0.8 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة في نهاية التجربة. هذه ينبغي أن تكون مطابقة للاطياف المسجلة في 4.3، وينبغي أن تراعي أي فقدان للموقع النشط أثناء أخذ القياس (الشكل 6).
2. تصدير أطياف امتصاص المطلقة من برمجيات مطياف في شكل مناسب (.csv، ASCII، 'matlab'، جكامب إلخ) لمعالجة باستخدام برامج مثل الأصل أو مطلب.
3. الأساس الصحيح البيانات، باستخدام عملية هو موضح في الشكل 7.
   1. أن المشتقة الثانية من كل طيف امتصاص في نطاق سم 1,800-2,150^-1، بغية تحديد الصغيرة (< 1 mO.D.) موقع نشط العصابات على خلفية المياه العالية منحنية.
   2. وضع الأساس ماركر النقاط على طيف امتصاص الأصلي، وتعيين النقاط 'المفاجئة' على نطاق تجريبي.
   3. تتناسب مع خط أساس عن طريق النقاط باستخدام دالة المفتاح مكعب محرف أو دالة متعدد الحدود. طرح هذه الوظيفة الأساسية من البيانات التجريبية.

النتائج

ويبين الشكل 1 تمثيل تخطيطي الترتيب التجريبي نظام تدفق مطياف والدرج الأمامي والملحقات ATR، بوتينتيوستات والغاز المستخدمة للقياسات فر. ويبين الشكل 2 ممثل رسم خلية سبيكترويليكتروكهيميكال.

ويبين الشكل 3 أطياف امتصاص الجزيئات تعديل Hyd1 قطره الصب، مع المخزن المؤقت التجريبي (نظام المخزن مؤقت مختلطة، الموصوفة في 3.7، pH 6.0) تتدفق من خلال خلية سبيكترويليكتروكهيميكال. تغطية سطح Hyd1 مرتفع خاصة في المثال الموضح في الشكل 3، مع شدة فرقة الثانية أميد من mO.D ~ 235. والحد الأدنى 'الأكبر' المياه كما يتضح من حجم منطقة تمتد س-ح (سم ~ 3,000-3,600^-1) بالنسبة للفرقة في سم ~ 1,640^-1، وهو الالتواء من أميد أنا عصابة من Hyd1 والانحناء الماء ح-س-ح. نطاقات إضافية بسبب البروتين يتبين في منطقة تمتد ح ج (ca سم 2900^-1). الفرقة واسعة تتمحور حول 2,100 سم^-1 هي فرقة مزيج من الاهتزاز الانحناء ح-س-ح مع مجموعة من الطاقة أقل يتهمها العصابات، الذي يتم تناوب مقيد ح₂س الجزيئات بسبب الشبكة الرابطة الهيدروجينية في الماء السائل. الفرقة_{أول أكسيد الكربون} νدولة ب ني المؤكسد، غير نشط، موقع نشط يتجلى بوضوح في سم 1,943^-1، حتى بدون تصحيح خط الأساس، وميزات_CN νمرئية بوضوح بين سم 2,050-2,100^-1 . في التغطيات Hyd1 عالية، يصبح كثير من هيكل microporous فيلم أسود الكربون⁵⁷ حظره بواسطة إنزيم ولذلك يتم تخفيض تركيز المياه 'الأكبر' خلال قياسات فر.

الأطياف في الشكل 3 تبين أنه، قبل التنشيط، تحتوي على أفلام Hyd1 Hyd1 في الدول المؤكسد، غير نشط. التنشيط بين عشية وضحاها في −0.8 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة تحت جو₂ ح يؤدي إلى تشكيل تخفيض، الدول حفازة نشطة كما هو موضح في الشكل 4 الذي يبين طيف كإعداد فرق (المؤكسد) المنشط (انخفاض) ناقص من Hyd1. ويمكن تفسير الأطياف الفرق من Hyd1 الأكثر وضوح استخدام منطقة_شركة ν. كل دولة فريدة من نوعها للموقع النشط الفرقة شركة واحدة فقط مقارنة بشريطين CN وذلك منطقة_CN νجوهريا أكثر تعقيداً، مع العديد من نطاقات متراكبة. يظهر الطيف الفرق في الشكل 4 أن التنشيط يؤدي إلى فقدان (عصابات الامتصاص السلبي) ب ني المؤكسد، غير نشط، وكمية صغيرة من ني-سي (الدولة 'النشط' الأكثر المؤكسد) الذي كان حاضرا في الفيلم Hyd1-أعد. يتم استبدال هذه الدول 'النشط' في Hyd1؛ ني-ج، لاحظ ني-R ولام ني علما أن هناك شكلين من آر ني ول ني الدول، كما يتضح من نطاقات_CO اثنين νلهذه الأنواع في الشكل 4. مراقبة متعددة الدول ني-R و L ني الاتفاق مع هيدروجيناسيس NiFe الأخرى. ^{48 , 58 , 59}

مفتاح تحقق من الأسلوب الذي فر هو أن تسجل فولتاموجرامس دوري من Hyd1 داخل المعرض خلية تدفق سبيكترويليكتروكهيميكال وافيشابيس الحفاز مشابهة لتلك التي سجلت في قطب قرص مستو الدورية. ⁵⁵ هذا يعني عمليا أن النقل الجماعي من الركازة (ح₂) والمنتج (ح⁺) من وإلى Hyd1 المعطل تداولها في الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال كفاءة في معدلات التدفق المستخدمة خلال قياسات فر. ويرد أثر معدل التدفق على وافيشابي الحفاز في الشكل 5، مما يدل على فولتاموجرامس المتتالية المسجلة في إطار جو₂ ح (1 بار) كما يتم زيادة معدل تدفق الحل عن طريق الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال. في جميع الحالات أوفيربوتينتيال للأكسدة₂ ح من Hyd1 متطابقة (أحمر مستطيل مظلل)، لكن مدى المنظمة عنصر مؤكسد (التباطؤ بين الحالي أثناء الأكسدة والتخفيض الاحتلالات في إمكانات أعلاه ca 0 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة) وأكسدة₂ ح الحد الأقصى الحالي تعتمد على معدل تدفق الحل. معدلات تدفق أعلاه 52 مل/دقيقة (فولتاموجرام رمادية خفيفة) غير مبال بمزيد من وافيشابي الحفاز يزيد معدل التدفق.

الشكل 6 يقارن الكثافات النسبية للفرقة CO νني ب الدولة بعد التنشيط الأولى وإعادة الأكسدة اللاهوائية في 0 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة (تحت ع جو، كما هو موضح في 4.3) وبعد المنظمة الأكسدة اللاهوائية تحت جو ع في 0 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة بعد 48 ساعة من تجارب مستمرة (كما هو موضح في 5.1). ويلاحظ عدم فقدان كثافة الفرقة الموقع النشط أثناء أخذ القياس، وجميع العينة Hyd1 يستجيب للإمكانات التطبيقية.

الشكل 7 يوضح الإجراء تصحيح الأساس المستخدمة في هذا العمل. ويتضمن الطيف المطلق للعينة Hyd1 في منطقة الموقع النشط (الشكل 7) انحناء كبيرة بسبب المياه. وفي الواقع، شرط لاستخدام الماء كمذيب مشكلة بالنسبة لمعظم تطبيقات مطيافية الأشعة تحت الحمراء في مجال علوم الحياة. يمكن استخدام المشتقة الثانية من الطيف المطلق (الشكل 7ب)، محسوبة باستخدام البرنامج الأصلي مع ساتفيتسكي-غولي تجانس عبر نافذة 9 نقطة، لتحديد نطاقات حادة للموقع النشط Hyd1 على خلفية منحنية. يسمح تحديد مواقف الذروة تقريبية استخدام طيف مشتقة ثانية نقاط ربط خط الأساس لتوضع في مناطق الطيف المطلقة التي مجانية من موقع نشط العصابات (الدوائر في الشكل 7). وظيفة المفتاح مكعب ثم مزودة من خلال نقاط الربط هذه لإنشاء دالة خط أساس التي يمكن ثم يتم خصمها من الطيف المطلق لإعطاء طائفة تصحيح خط الأساس التي تحتوي على فقط قمم الناشئة عن الموقع النشط Hyd1 (الشكل 7 ج).

يبين الشكل 8 نتائج قياس فر في Hyd1، تحت غير الدوران (ع الغلاف الجوي) ودوران (ح₂ الغلاف الجوي) الشروط في طائفة من الإمكانات. ³⁶ آثار الزمن الحالي (الشكل 8) تقرير عن الحالي الحفاز في كل تطبيق الإمكانات وتظل على مقربة من صفر الحالي تحت ظروف غير الدوران (ع الغلاف الجوي). لذلك تقارير المعايرة الأكسدة والاختزال سبيكترويليكتروكهيميكال الجزئية في الشكل 8ب على سلوك الموقع النشط، وتبين توزيع الدول المتوقع في كل الإمكانات في غياب دوران الحفاز الأكسدة التوازن. وسجلت تحت ظروف دوران (في إطار جو₂ ح) الأطياف في الشكل 8ج وتمثل بالتالي توزيع الحالة المستقرة للدول الموقع النشط الحالي خلال ح₂ أكسدة حفازة من Hyd1. أن ظروف الحالة المستقرة قد تحققت ما تؤكده حقيقة أن الحفاز ح₂ أكسدة الحالية (الشكل 8، ح₂) يبقى ثابتاً كدالة للزمن في −0.199 الخامس وقالت؛ −0.074 الخامس مقابل الانحلال رتيبة في +0.356 الخامس الحالي مقابل أنها سبب المنظمة الأكسدة اللاهوائية معروفة من Hyd1. ⁵⁵ توزيع الدول الموقع النشط وضوح مختلفة تحت ع وح₂ في كافة الإمكانات حيث يقوم Hyd1 بالحفز (الشكل 8ب، والأطياف في −0.199 و −0.074 و +0.356 الخامس مقابل أنها). الأطياف المسجلة تحت ع وح₂ متطابقة تقريبا في −0.594 الخامس مقابل أنها، مع ذلك، وهذا يمثل اختبارا هاما للاتساق التجريبية؛ Hyd1 لا تقلل من ح⁺ بمعدل كبير في درجة الحموضة 6.0 (الحالية في الشكل 8 تحت ع وح₂ قريبة من الصفر)، والأطياف في −0.594 الخامس ولذا من المتوقع أن يكون هو نفسه.

يوضح الشكل 9 المنظمة الأكسدة اللاهوائية من Hyd1 عن طريق تشكيل ب ني ني-سي من خلال أكسدة₂ ح في +0.356 ف³⁶ سجلت الأطياف أثناء الفواصل الزمنية رمادي لاحظت في تتبع الزمن الحالي في الشكل 9. −0.074 V Hyd1 لا تخضع للمنظمة الأكسدة والتوزيع لموقع نشط الدول تظل ثابتة طوال كامل الخطوة المحتملة. وهذا يتضح من الأطياف في الشكل 9ب_أنا، التي تقدم تقاريرها الطيف تصحيح الأساس المطلق في بداية الخطوة المحتملة −0.074، وب 9 الشكل_الثاني الذي تم تسجيله في وقت لاحق الوقت أثناء الخطوة المحتملة، ويقال كطائفة فرق بالنسبة إلى الرقم 9ب_أنا. الأطياف في الشكل 9ب_الثالث و ب_الرابع أفيد أيضا الأطياف الفرق بالنسبة إلى الشكل 9b_أنا، وإظهار التحويل التدريجي من سي ني ني باثناء عالية المحتملة المنظمة، تمشيا مع انخفاض رتيبة الحالي سيظهر في +0.356 الخامس في الشكل 9.

الأطياف التي سجلت في مجموعة من الأس الهيدروجيني الحل تعطي فكرة عن نقل بروتون دورة خطوات خلال Hyd1 الحفاز. ⁴³ الرقم 10 يظهر أطياف فر المسجلة على نفس الفيلم Hyd1 في 3.0 درجة الحموضة والحموضة 9.0، استخدام تدفق الحل في الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال لتبادل المخزن المؤقت التجريبي. تركيزات النسبية ج ني ول ني الدول تختلف من الواضح في هذه الأطياف اثنين. قبل متفاوتة الإمكانات التطبيقية تحت ظروف غير دوران الدول الاعتماد المحتمل NiC ول ني يمكن تحديده سريعاً في نطاق من قيم الأس الهيدروجيني (الشكل 10ب)، وتم العثور على كل الدول أن تكون إيسوبوتينتيال أكثر من مجموعة واسعة من الأس الهيدروجيني. (لاحظ أن أبسوربانسيس الذروة في الشكل 10ب إظهار فقط الدول ج ني ول ني للوضوح، الأكسدة الكاملة وأبلغت المعايرة Hyd1 هيدالغو et al.) ³⁶ معايرة درجة حموضة من تركيزات ني-ج ول ني يمكن ثم استخراج، أخذ امتصاص الذروة في الإمكانيات حيث يتم التركيز الكلي ني-ج ول ني إلى الحد الأقصى في كل درجة الحموضة (الشكل 10ج). بهذه الطريقة، وبالاقتران مع بيانات الجيش الشعبي الثوري، تم تحديد توازن الأس الهيدروجيني بين ج ني ول ني الدول. ⁴³

رقم 1: التخطيطي الترتيب من مطياف الأشعة تحت الحمراء، والدرج الأمامي اللاهوائية، التبعي ATR، كاشف MCT، الغاز نظام التدفق وبوتينتيوستات المستخدمة لقياس فر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: رسم تخطيطي لخلية سبيكترويليكتروكهيميكال المستخدمة للقياسات فر، عرض ترتيب أقطاب وحل مدخل/منفذ اتصالات. يتم تشكيلة بالخلية واللوح الأساس من إيثر البروم ثنائي الفينيل كيتون (نظرة خاطفة)، مع فتحات المسامير لقضيب الكربون يعمل اتصال قطب كهربائي، سلك العداد الكهربائي Pt، القطب مرجع كالومل المشبعة، وحل مدخل ومخرج. بناء القطب مرجع كالومل المشبعة كما سبق ذكر. ³⁶ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: طيف امتصاص جزيئات تعديل Hyd1 أسود الكربون، أودعت إلى غضب وامهاء مع المخزن المؤقت- مواقف منطقة الموقع النشط Hyd1 أميد أنا الفرقة، والفرقة الثانية أميد، وتظهر، جنبا إلى جنب مع ميزات إضافية بسبب الاهتزازات تمتد ح ج والمياه المذيبات. اقحم يظهر عرض مكبرة من المنطقة، وموقع نشط مع الخامس_{أول أكسيد الكربون} و الخامس_CN النطاقات المسماة. '--أعد' الجسيمات تحتوي على Hyd1 أساسا في الدولة ب ني المؤكسد، غير نشط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : تفعيل Hyd1 في −0.8 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة تحت جو₂ ح المقدمة كطائفة فرق المؤكسد انخفاض ناقص - عند التنشيط المحتملة الانخفاض تتأكسد، ب ني غير نشط (وتركيز صغيرة من سي ني) يحول إلى أكثر نشطة، وانخفاض الدول ني-ج، ني-R وعلما ني لام أن Hyd1 دولتين الفرعية متميزة ل ني وار ني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : تأثير معدل تدفق الحل على وافيشابي فولتاموجرامس دوري الحفاز المسجلة في الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال. وسجلت فولتاموجرامس في زيادة معدلات التدفق من ح₂-المشبعة المخزن المؤقت كما هو مبين. تدفق بمعدل 20 مل/دقيقة (أحمر) يبين فولتاموجرام المنظمة الهامة أعلاه 0 الخامس مقابل أنها على الفحص إلى الأمام. مدى المنظمة أقل إلى حد كبير في معدلات التدفق أعلاه 52 مل/دقيقة والحالية مستقلة عن معدل التدفق في كافة الإمكانات. معلمات أخرى: 1 بار ح₂، 10 معدل المسح mV/s. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : تصحيح الأساس أطياف الأشعة تحت الحمراء في منطقة شركة νالموقع النشط المؤكسد، غير نشط الدولة ب ني في 0 الخامس مقابل لجنة الخبراء الدائمة- لا يكون هناك فقدان للقياس من كثافة الموقع النشط خلال 48 ساعة متواصلة فر القياسات، وذلك هو تمتز Hyd1 قوة على جزيئات الكربون الأسود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

7 الرقم: تفاصيل إجراءات تصحيح خط الأساس المستخدمة لمعالجة البيانات- وتوضع نقاط ربط خط الأساس على طيف امتصاص المطلق في منطقة الموقع النشط ()، مع الحرص على تجنب أي ν νو_{شركاه CN} قمم المحددة من تحليل مشتقة ثانية (ب). (ج) يبين الطيف المصوبة الأساس الناتجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

8 الرقم: قياسات فر في Hyd1 تحت غير الدوران (ع) وتبدل الأحوال (ح₂)- () الزمن الحالي آثار Hyd1 في الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال المشبعة Ar (رمادي) وح₂-المشبعة المخزن المؤقت (أسود)؛ (ب)، (ج) فر الأطياف عرض المنطقة ν_CO في كل الإمكانات تحت ع (ب) و (ج) ح₂ . ونقلت في الخامس مقابل أنها إمكانات. استنسخت بإذن من هيدالغو et al. ³⁵ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 9: المنظمة اللاهوائية Hyd1 عن طريق تشكيل ب ني من ني-سي. () تتبع الزمن الحالي تحت جو₂ ح، عرض اليكتروكاتاليتيك مستقرة الحالي في −0.074 الخامس وبطء المنظمة اللاهوائية (انخفاض رتيبة الحالية) في +0.356 الخامس مقابل أنها. (ب) الأطياف المسجلة خلال المناطق المظللة رمادي ملحوظ في (أ). طيف ب_أنا من طائفة المصوبة أساس المسجلة في بداية الخطوة المحتملة −0.074 V. طيف ب_الثاني، سجلت في وقت لاحق خلال الخطوة الخامسة −0.074، كطائفة فرق بالنسبة إلى ب_أنا ويظهر أن يحدث أي تغيير في توزيع الدول الموقع النشط، اتساقا مع استقرار إمكانيتها في −0.074 الخامس. ب أطياف_الثالث وب_الرابع ترد أيضا الأطياف الفرق بالنسبة إلى ب_أنا وإظهار التحويل التدريجي من سي ني ني باثناء المنظمة اللاهوائية في +0.356 الخامس مقابل أنها. استنسخت بإذن من هيدالغو et al. ³⁵ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 10 : الأطياف المسجلة في مجموعة من الأس الهيدروجيني الحل تعطي فكرة عن نقل بروتون خطوات خلال دورة الحفاز Hyd1. () الأشعة تحت الحمراء الأطياف عرض منطقة Hyd1،_شركة νالمسجلة في الأس الهيدروجيني 3.0 (mV-54 مقابل أنها) ودرجة الحموضة 9.0 (mV-334 مقابل أنها). المعايرة (ب) سبيكترويليكتروكهيميكال أجريت لتحديد الإمكانات التي تكون تركيزات ني-ج ول ني كحد أقصى في نطاق من قيم الأس الهيدروجيني الحل. وترد تركيزات ني-ج ول ني فقط للتوضيح، لمعايرة سبيكترويليكتروكهيميكال كامل من Hyd1 انظر هيدالغو et al. ³⁶ (ج) الاعتماد على درجة الحموضة التركز النسبي من ج ني ول ني، كما هو محدد من سلسلة تجارب مثل تلك المبينة في الفقرة (ب). وسجلت الأطياف في 20 درجة مئوية. تكيف مع إذن من ميرفي et al. ⁴² الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

فر من تقنية الأشعة تحت الحمراء الطيفية المطبقة على نطاق واسع لمعالجة البروتينات الأكسدة والاختزال الكهربائي معطلة. على وجه الخصوص، يمكن سبر اليكتروكاتاليتيك ردود فعل إنزيمات الأكسدة والاختزال في ظروف دوران سريع. ويستند الأسلوب فر السيطرة الكهروكيميائية المباشرة المقدمة من تقنية أنوع، الذي لا يقدم أي معلومات هيكلية مباشرة، والأزواج أن مطيافية الأشعة تحت الحمراء في قطب الكربون. النهج الذي فر وهكذا تضيف البصيرة الكيميائية للمعلومات المتاحة من كهربية وحدها وهي مناسبة جداً لدراسة البروتينات الأكسدة والأنزيمات المشاركة في ربط جزيء صغير والتنشيط. وباﻹضافة إلى ذلك، فر يمكن تقديم معلومات عن إمكانات تعتمد على التغييرات الهيكلية في البروتينات في الغياب دوران الحفاز. مثل هذه الأحداث نقل الإلكترون غير دوران غالباً صعوبة في الكشف عن استخدام تطبيقات 'قياسي' من أنوع، على الرغم من تمديد أنوع لتحويل فورييه AC فولتاميتري قد استخدمت بنجاح كبير. ^{45 , 46}

طريقة فر، من حيث المبدأ، مناسبة لدراسة أي البروتين الأكسدة التي يمكن دراستها باستخدام أنوع. ولذلك، كما الحال مع أنوع، البروتين الامتزاز خطوة حاسمة لتجربة ناجحة لفر. في هذا البروتوكول يصف لنا تطبيق تقنية فر استخدام Hyd1 كولاي كدراسة حالة. ^{36 , 43} بيد أننا قد أيضا تطبيق تقنية بفيري hydrogenase التنظيمية هيولى من ر. يوتروفا،⁴⁴ ومونونوكليوتيدي فلافين تمتز على أسود الكربون. ⁴⁰ وفي جميع هذه الحالات، الامتزاز المادية بسيطة لمساحة سطح عالية غير معدلة الكربون الأسود (كما هو موضح في هذا البروتوكول) يوفر تغطية سطح البروتين مرتفعة بما فيه الكفاية لأطياف الأشعة تحت الحمراء ذات نوعية جيدة سجل نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. في الحالات حيث لا يمكن تحقيق هذه المستويات العالية من الامتزاز، قد يكون من الضروري تعديل سطح جزيئات الكربون، على سبيل المثال السماح لمرفق التساهمية من البروتين على سطح القطب. ^{60 , 61 , 62} استخدام الدرج الأمامي للقياسات فر فقط ضرورية تماما عند دراسة العينات التي يجب معالجتها من دون وجود عوامل هوائية. ومع ذلك في ممارسة ثابتة جداً ومستويات منخفضة (نقطة الندى < 80 درجة مئوية) لبخار الماء المقدمة من جو الدرج الأمامي تعطي مستويات عالية في إشارة إلى الضوضاء التي تسمح لاستخراج أبسوربانسيس صغيرة جداً. ⁴⁴ في كثير من الحالات بيئة اللاهوائية، مثل التي قدمتها الدرج الأمامي، المستحسن أيضا لقياس الكهروكيميائية (جزءا لا يتجزأ من أسلوب فر) بغية تجنب الحالي بسبب انخفاض₂ س في مسرى العامل.

أبسوربانسيس الأشعة تحت الحمراء بسبب المياه السائبة ومخازن تجريبية وجزيئات الكربون التي هي تمتز العينة كلها تسهم إسهاما كبيرا في أطياف التجريبية ويمكن أن تتداخل مع عصابات من الفائدة، لا سيما في أميد الأول، المناطق الثانية والثالثة طيف. ⁶³ منطقة أميد يحتوي أيضا على معلومات عن الأنواع العضوية مثل فلافينس أو نيكوتيناميد العوامل المساعدة، فضلا عن ركائز والمنتجات للعديد من تفاعلات الأكسدة والحد. في حالة هيدروجيناسيس NiFe، عصابات_{أهي أول أكسيد الكربون} و ν νللموقع النشط تقع في منطقة الطيف واضحة نسبيا وحتى يناسب أسلوب فر جيد جداً لدراسة هذه الإنزيمات. وفي حالات أخرى، بيد الأطياف الفرق مقترنة بنهج التوسيم النظائر المشعة قد يلزم لعزل التغييرات الناجمة عن البروتين المعطل تداولها. وقد استخدمت نهج مماثل لتحديد، على سبيل المثال، التغييرات بروتونيشن، ترتيبات هيكلية جديدة ودراسة مجمعات ميكايليس-مينتين استخدام مطيافية الأشعة تحت الحمراء. ^{64 , 65 , 66} فر يقتصر على دراسة هيدروجيناسيس لذلك، لا، ولكن يمكن تطبيقه على أي البروتين الأكسدة والاختزال التي تحتوي على (أو الذين ركائز أو المنتجات أو مثبطات تحتوي على) المجموعات مع تشخيص الأشعة تحت الحمراء نشط الاهتزازات؛ ديهيدروجينسيس أول أكسيد الكربون، نيتروجيناسيس⁶⁷ ،^{14 68،}فلافوبروتينس، ديهيدروجيناسيس⁴⁰ وفورمات، على سبيل المثال.

هذه التقنية ذات الصلة، سيرة، هو ملائمة تماما لدراسة البروتينات المرتبطة بغشاء في بيئة المحاكاة البيولوجية. ³² سيرة هو تكييف مطيافية الأشعة تحت الحمراء، كما يستخدم تكوين ATR، الأشعة تحت الحمراء، ويجعل من تأثير تعزيز السطحية أن يستفيض في امتصاص الأشعة تحت الحمراء من الجزيئات التي تقع قريبة من (في غضون بضعة نانومتر) استخدام سطح المنشور أية تي آر (غضب). ولذلك سيرة رائع الحساسة للتغيرات الطيفية التي تحدث داخل بنية البروتين والغشاء الممتزة وخال نسبيا من الإشارات المتضاربة من المذيبات وركائز/مثبطات الموجودة في الحل. هذا هو إلى حد ما على عكس الأسلوب فر الموصوفة هنا الذي يعتمد على عمق تغلغل أكبر بكثير فوق سطح غضب (~ 1 ميكرومتر)، مما يعني أن فر أكثر حساسية لركائز، مثبطات أو المنتجات الموجودة في الحل. هذا زيادة الحساسية للمذيبات 'الأكبر' يمكن أن يكون مفيداً؛ إذا كان يمكن ملاحظتها في الركيزة أو المنتج مباشرة بواسطة الأشعة تحت الحمراء، تقريرا الأطياف فر حركية حالة ثابتة كلا من الأنواع النشطة المعمرة وتشكيل المنتجات المرتبطة بها من خلال اليكتروكاتاليسيس. ⁶⁹ القدرة على مراقبة تركيزات حالة ثابتة من الركازة والمنتج سوف تكون قيمة خاصة للإنزيمات مثل نازعة أول أكسيد الكربون (والذي يحفز أكسدة عكسها من شركة إلى شركة₂، امتصاص الأشعة تحت الحمراء قوي) أو فورمات نازعة (الذي يحفز عكسها أكسدة فورمات إلى CO₂).

وفي الوقت الحاضر، فر يقتصر على دراسات الحالة المستقرة الحركية للانزيم اليكتروكاتاليسيس بسبب الأقطاب الكربونية العيانية استخدام 'التركيز' الإنزيم على سطح غضب لجمع البيانات في والهندسة ATR، الأشعة تحت الحمراء. وفي هذا الصدد دراسات فر NiFe هيدروجيناسيس مكملة لعمل داير وزملاء العمل،^،من⁴⁹⁵⁰ الذين يستخدمون مطيافية الأشعة تحت الحمراء الخفيفة تسبب امتصاص عابرة لدراسة حركية دون دوران. يجري العمل على تصغير الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال،⁴⁰ ، ومع استخدام ميكروليكتروديس القرار وقت يقارب ميكرو ثانية ينبغي أن تكون قابلة للتحقيق. وهذا سيمكن دراسة حركية شبه دوران للإنزيمات مع ترددات دوران يصل إلى ca 100-500 s^-1، وسيمكن دراسة عمليات التخفيض والأكسدة على حد سواء.

إجمالاً، فر هو أسلوب الطيفية التي يسمح لتوصيف المواد الكيميائية اليكتروكاتاليتيك ردود فعل إنزيمات الأكسدة تحت ظروف حالة ثابتة. يسمح هذا النهج فر المعايرة الكيميائية والكهروكيميائيه متعددة تنفذ على نفس العينة الإنزيم، كما توفر أقطاب كهربائية عالية المساحة المستخدمة امتزاز قوية من البروتين وهندسة ATR الأشعة تحت الحمراء يسمح تبادل الحلول السهلة. القدرة على جمع هذه المعلومات الهيكلية في الموقع أثناء وظيفة الإنزيم أداة لا تقدر بثمن للمجتمع بيويليكتروكهيميستري.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrometer	Agilent	680-IR	with an external MCT detector
ATR accessory	Pike Technologies	GladiATR	Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox	Glove Box Technology Ltd.	N/A	Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window	Crystran	Custom	To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics	Agilent	N/A	Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE	Crystal GmbH	Custom	Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat	Metrohm	Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1	Metrohm		Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump	Williamson Manufacturing Company Ltd	QL-1000-024-300
Pt wire	Surepure Chemetals	3272	99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod	WH Smith	30729209	0.7 mm HB pencil lead
Carbon black	Cabot Corporation	Black Pearls 2000
Ultrasonic bath	Ultrawave	U100	35 W
Centrifugal filter	Merck Millipore	UFC5050BK	Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge	Eppendorf	5452000018	MiniSpin
NaCl	Sigma	71376
H2SO4	Fisher	S/9240/PB17
HNO3	Fisher	N/2300/PB17
silicone sealant	Cow Corning Toray Co., Ltd.	SE 4486
Carbon paper	Toray	TGP-H-030
H2 gas	BOC
N2 gas	BOC
OriginPro 2015	OriginLab		Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0	Varian		Software for controlling FTIR spectrometer