عزل ميوبلاستس الإنسان، تقييم التمايز العضلي، وقياس دخول الكالسيوم التي تديرها المخازن

Summary

هنا، نحن تصف منهجية للحصول على السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من الأنسجة العضلية الكبار. وتستخدم هذه الخلايا لدراسة في المختبر التمايز العضلات والهيكل العظمي، وعلى وجه الخصوص، لدراسة البروتينات المشاركة في كا ^{2 +} الإشارات.

Abstract

الخلايا الأقمار الصناعية (سك) هي الخلايا الجذعية العضلية الواقعة بين غشاء البلازما من ألياف العضلات والصفيحة القاعدية المحيطة بها. وهي ضرورية لتجديد العضلات. عند الإصابة، والذي يحدث في كثير من الأحيان في العضلات والهيكل العظمي، يتم تنشيط سس. أنها تتكاثر كما ميوبلاستس والتفريق لإصلاح آفات العضلات. من بين العديد من الأحداث التي تحدث خلال تمايز العضلات، كا ² عصاري خلوي إشارات ذات أهمية كبيرة. هذه الإشارات كا ^{2 +} تنشأ من كا ^{2 +} الإفراج عن كا ^{2 +} مخازن الداخلية، وكذلك من كا ^{2 +} دخول من الفضاء خارج الخلية، ولا سيما إدخال كا ^{2+ التي} تديرها مخزن (سوس). تصف هذه الورقة المنهجية المستخدمة للحصول على السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من عينات العضلات التي تم جمعها بعد جراحة العظام. يتم هضم الأنسجة ميكانيكيا و إنزيميا، ويتم تضخيم الخلايا ومن ثم فرزها عن طريق التدفق الخلوي وفقا لوجود سبيسيعلامات غشاء فيك. بمجرد الحصول عليها، يتم توسيع ميوبلاستس الإنسان وملتزمة للتمييز عن طريق إزالة عوامل النمو من وسط الثقافة. يتم استخدام مستويات التعبير من عوامل النسخ المحددة والمناعية في المختبر لتقييم عملية التمايز العضلي في ظروف السيطرة وبعد إسكات البروتينات المشاركة في كا ^{2 +} الإشارات. وأخيرا، ونحن بالتفصيل استخدام فورا-2 باعتباره كا ² راتيوميتريك مسبار التي توفر قياسات موثوقة وقابلة للتكرار من سوس.

Introduction

وتتكون عضلات الهيكل العظمي البشري من مجموعات من الألياف العضلية مقلص، متعددة النوى الناجمة عن انصهار الخلايا السلائف عضلي المنشأ. العضلات الهيكلية لديها القدرة على تجديد بعد الاصابة وذلك بفضل وجود سس، الخلايا الجذعية العضلات والهيكل العظمي تقع بين غشاء البلازما ميوفيبرز (ساركولما) والصفيحة القاعدية. في العضلات غير المصابة، سس موجودة في الغالب في حالة هادئة. ردا على الإجهاد الميكانيكي أو الإصابة، سس تصبح تفعيلها (ميوبلاستس)، تتكاثر، وتخضع إما التمايز لتشكيل ميوفيبرز جديدة أو التجديد الذاتي لتجديد تجمع سك ^{1 ، 2} . على مر السنين، تم تطوير العديد من التقنيات لعزل سس وذريتها، ميوبلاستس، من خزعات العضلات والهيكل العظمي. مع فهم أكبر من علامات سطح الخلية أعرب عن هذه الخلايا ومنهجية الفلورسنت تنشيط خلية الفرز (فاكس) ^{3، 4 ، 5} ، فمن الممكن الآن لعزل السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من عينات العضلات.

إشارات الكالسيوم ينظم تطوير العضلات والهيكل العظمي، والتوازن، والتجديد. على وجه الخصوص، كا ^{2 +} دخول التي يتم تنشيطها بعد استنزاف مخزن داخل الخلايا، ودعا سوس، له أهمية كبيرة ⁶ لهذه العمليات. على التحفيز الخلية، وانخفاض مستوى كا ^{2 +} في الشبكة إندو / ساركوبلازميك (إير / سر)، والذي بدوره ينشط غشاء البلازما كا ^{2 +} القنوات التي تسمح كا ^{2 +} دخول لإعادة ملء إير / سر ⁷ . البروتينات الرئيسية اثنين المشاركة في سوس هي إير / سر كا ^{2 +} -Sensing التفاعل اللحمية جزيء 1 (STIM1) البروتين وغشاء البلازما كا ²⁺ قناة Orai1. العضلات والهيكل العظمي يعبر عن هذه البروتينات اثنين، فضلا عن البروتينات الأخرى من نفس الأسر (STIM2 أند Orai2-Orai3) ^{8 ، 9} والعديد من كا ²⁺ قنوات -permeable من مستقبلات عابرة كانونيكال (تريك) الأسرة ^{10 ، 11 ، 12 ، 13} . كا ^{2 +} دخول من خلال مسار سوس هو من أهمية كبيرة لتشكيل العضلات / تجديد ¹⁴ . الطفرات من STIM1 أو أوراي 1 البروتينات لها آثار ضارة على وظيفة العضلات، مما يؤدي أساسا إلى نقص التوتر العضلي ¹⁵ . نماذج حيوانية مع ضعف سوس كما عرض انخفاض كتلة العضلات والقوة، جنبا إلى جنب مع تعزيز فتيغابيليتي ^{6 ، 16 ، 17} . كما ذكر، يتم التعبير عن ستيم أخرى والبروتينات أوراي، فضلا عن العديد من القنوات تريك، في العضلات والهيكل العظمي، ولم يتم تحديد أدوار كل منها حتى الآن. بواسطة يطرق دتملك مستوى التعبير، وبالتالي فمن الممكن للتحقيق في آثارها في سوس وأدوارها خلال التمايز العضلات الهيكل العظمي البشري.

ويمكن إجراء قياس سوس باستخدام نهجين مختلفين: التسجيلات الكهربية الحالية والقياسات كا ^{2 +} . الفيزيولوجيا الكهربية هو بالتأكيد طريقة أكثر مباشرة، كما أنه يقيس التيار من الفائدة والتوقيع الكهربية المرتبطة بها. ومع ذلك، هذه التقنية من الصعب جدا أن تنطبق على خلايا العضلات، وذلك أساسا بسبب حجم كبير من خلايا العضلات وصغر حجم التيار سوس الذاتية. سايتوسوليك كا ^{2 +} التصوير هو من الناحية الفنية يمكن الوصول إليها جدا، ولكن التدبير هو أكثر مباشرة، كما كا ^{2 +} مستوى يقاس في السيتوسول يعكس كلا من دخول كا ^{2 +} وإعادة ضخ للخروج من الخلية أو في المخازن الداخلية.

منهجية تشمل عزل ميوبلاستس من قطع صغيرة من سكيل الإنسانإتال العضلات بعد الهضم الأنزيمي، التضخيم، و فاكس هو موضح في هذه الورقة. يتم وصف عملية تمايز العضلات والبروتوكول المناعي لمتابعة التعبير عن علامات التمايز مع مرور الوقت ¹⁸ . وأخيرا، يتم شرح قياس سوس ودور القنوات الأيونية المختلفة في كا ^{2 +} الإشارات والتمايز العضلات والهيكل العظمي.

Protocol

تم جمع عينات العضلات البشرية (الأنسجة التي تم الحصول عليها من عضلات نصف نصية) خلال جراحة العظام على المرضى الأصحاء كنفايات جراحية. وقد أجريت جميع الأساليب المتعلقة بالدراسة البشرية وفقا للمبادئ التوجيهية والأنظمة الصادرة عن السلطات الصحية التنظيمية السويسرية ووافقت عليها اللجنة الكانتونية للدراسات العليا من سلطات كانتون جنيف بسويسرا (البروتوكول رقم سير 12-259) . تم الحصول على موافقات مستنيرة ومكتوبة من جميع الأشخاص البالغين المشاركين في الدراسة.

1. عزل ميوبلاستس من العضلات والهيكل العظمي البشري

1. خلال جميع الإجراءات، والحفاظ على ظروف معقمة من خلال العمل تحت المستوى الثاني نسيج هود الثقافة واستخدام العقيمة المتوسطة والعقيمة مخازن.
   ملاحظة: هذا الإجراء يمكن تطبيقها على العديد من العضلات والهيكل العظمي البشري.

2. بروتوكول التفكك

1. نقل عينات العضلات (2 - 3 ز) في معقمة 6 سمطبق.
2. غسل عينات العضلات مع 5 - 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس). كرر غسل.
3. إزالة الأنسجة الضامة والدهنية باستخدام مقص منحني ومشبك.
4. وزن عينة العضلات (انظر الخطوة 2.13) ونقله إلى لوحة معقمة 6 سم جديدة.
5. إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين-إدتا.
6. باستخدام مقص، وقطع واللحم المفروم الأنسجة العضلية إلى قطع صغيرة (أقل من 2 مم).
7. باستخدام ماصة 10 مل المصلية، ونقل العضلات المفروم إلى زجاجة التفكك 200 مل تحتوي على شريط المغناطيسي. كرر هذه الخطوة حتى 90 مل من 0.05٪ تم نقل التربسين-إدتا مع جميع العضلات المفروم إلى مربع التفكك. إغلاق زجاجة التفكك واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة تحت التحريض خفيفة.
8. إزالة زجاجة التفكك من حمام التدفئة ووقف رد الفعل الأنزيمية بإضافة 10 مل من مصل العجل الجنين (فس، 10٪ الحجم النهائي) إلى زجاجة التفكك. تجانس الخليط مع ماصة.
9. الإعداديةهما أنابيب 50 مل مع مصفاة خلية 70 ميكرون على كل منهما. تمرير نصف تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية على كل أنبوب عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا على مرشح حتى يمر تعليق من خلال.
10. أجهزة الطرد المركزي أنابيب في 200 x ج و 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف.
11. ريسوسبيند الخلايا مع 10 مل من النمو المتوسطة (جنرال موتورز، الجدول 1 ) وتمرير الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون وضعت على أنبوب واحد 50 مل. الطرد المركزي أنبوب في 200 x ج و 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف.
12. ريسوسبيند الخلايا مع 10 مل من جنرال موتورز وأجهزة الطرد المركزي أنبوب في 200 x ج و 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف.
13. ريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من جنرال موتورز واعتماد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور.
    ملاحظة: عادة، ينبغي حصاد 3 × 10 ⁵ خلايا لكل غرام من العضلات. ويحسب العائد عن طريق قسمة عدد الخلايا من وزن بيوب العضلاتسي (الخطوة 2.4).
14. وضع 2 × 10 ⁵ خلايا في معقمة 6 سم لوحة تحتوي على 4 مل من جنرال موتورز واحتضان عند 37 درجة مئوية و 7٪ كو ₂ . إعداد العديد من لوحات حسب الضرورة.
15. تغيير جنرال موتورز بعد 3 أيام.
    ملاحظة: الخلايا فصلها حديثا تحتاج إلى وقت التمسك لوحة الثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن أول مرة مضاعفة الخلية العضلية حوالي 50 - 60 ساعة. بعد التقسيم الأول، ومضاعفة الوقت حوالي 20 ساعة.
16. بعد 5 - 7 أيام، عندما تصل الخلايا 70-80٪ التقاء (حوالي 1.5 × 10 ⁶ خلايا / لكل 6 سم لوحة)، تبدأ تلطيخ الأجسام المضادة وفرز الخلية (الخطوة 3).

3. تلطيخ الأجسام المضادة وفرز الخلايا

1. بعد الشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا الملتصقة (في لوحة 6 سم) مع 1 مل من 0.05٪ التربسين-إدتا في 37 درجة مئوية و 7٪ كو ₂ لمدة 3 دقائق (أو احتضان في 5٪ كو ₂ ). وقف رد فعل بإضافة 2 مل من جنرال موتورز وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل. بعد الطرد المركزي (200 x ج لمدة 5 دقائق)، ريسأوبيند الخلايا في 1 مل من جنرال موتورز.
2. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور.
3. تنفيذ الإجراءات التالية على الجليد.
   ملاحظة: الإجراء لتحديد التعويض مضان الصحيح على مقياس الكريات أمر ضروري ويجب أن تكون مماثلة على أي مقياس الكريات. يتم استخدام أنابيب 1 و 2 كما الضوابط السلبية. وتستخدم الأنابيب 3 - 7 لتعيين التعويض على مقياس الكريات خلال التجربة الأولى ( الجدول 2 ). وينبغي أن يكون التركيز النهائي المستخدمة لكل الأجسام المضادة والنمط النظير المقابلة لها (حوالي 1 ميكروغرام / 10 ⁶ خلايا).
4. إيفاد 1 × 10 ⁵ خلايا لكل أنبوب (أنبوب 5 مل) للأنابيب 1-7 ( الجدول 2 ). وضع تعليق خلية المتبقية في أنبوب 8 لفرز الخلية.
5. غسل الخلايا مع 1 مل من العازلة فاكس الباردة (بس-5٪ فس). إغلاق وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 200 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف.
6. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة فاكس لكل أنبوب. إضافة الأجسام المضادة إلى الe أنبوب وفقا للجدول 2 . احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
7. غسل الخلايا: إضافة 1 مل من العازلة فاكس لكل أنبوب. إغلاق وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 200 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
8. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة فاكس. إغلاق الأنابيب والاحتفاظ بها على الجليد حتى الفرز الخلية. إعداد 4 أنابيب من 1.5 مل، تحتوي كل منها 500 ميكرولتر من جنرال موتورز، وهو أمر ضروري لجمع الخلايا أثناء الفرز الخلية. الاحتفاظ بها على الجليد.
9. فرز ميوبلاستس الإنسان عن طريق التدفق الخلوي ( الشكل 1 ). بعد استبعاد CD45 إيجابية الخلايا المكونة للدم، منفصلة CD45 الخلايا السلبية على أساس التعبير CD56. ثم، بوابة السكان إيجابية CD56 ل CD34، CD144، و CD146 (ميوبلاستس الإنسان تعرف بأنها CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- الخلايا). رياناليز جزء صغير من السكان خلية فرزها للتحقق من النقاء.
10. تجمع الأنابيب التي تحتوي على ميوبلا الإنسانستس في أنبوب واحد 15 مل وغسل مرة واحدة بإضافة 5 مل من جنرال موتورز. الطرد المركزي أنبوب في 200 x ج و 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف.
11. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من جنرال موتورز لوحة الخلايا على لوحة غير مصقول 6 سم تحتوي على 4 مل من جنرال موتورز (2 × 10 ⁵ خلايا لكل لوحة). احتضان عند 37 درجة مئوية و 7٪ كو ₂ .

4. صيانة الخلية

1. تغيير نصف الوسط الثقافي كل يومين. إزالة 2 مل من غم القديم من طبق الثقافة وإضافة 2 مل من جنرال موتورز.
   ملاحظة: ميوبلاستس تنتج عوامل النمو التي هي مفيدة لظروف الثقافة.
2. تريبسينيز الخلايا عندما تصل إلى 70-80٪ التقاء لتجنب ما قبل التمايز. بعد الشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا الملتصقة (في لوحة 6 سم) مع 1 مل من 0.05٪ التربسين-إدتا في 37 درجة مئوية و 7٪ كو ₂ لمدة 3 دقائق. وقف رد فعل عن طريق إضافة 2 مل من جنرال موتورز وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل. بعد الطرد المركزي (200 x ج لمدة 5 دقائق)، ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من جنرال موتورز.
3. عد الخلايا وإعداد لوحات 6 سم مع 2 × 10 ⁵ خلايا لكل لوحة في 4 مل من جنرال موتورز.
4. إبقاء ميوبلاستس الإنسان تصل إلى 6 ممرات أو تجميدها في جنرال موتورز تحتوي على 10٪ دمسو، 1 × 10 ⁶ خلايا لكل مل. تجميد الخلايا في مربع تجميد التقدمي (1 درجة مئوية / دقيقة). للتخزين على المدى الطويل، ووضع الخلايا في النيتروجين السائل.

5. ترنسفكأيشن من ميوبلاستس الإنسان مع سيرنا

ملاحظة: يتم ترانزفكتد ميوبلاستس باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجارية قبل يومين من تحريض التمايز. يتم مقارنة تأثير سيرنا محددة ضد الجينات دائما لتأثير سيرنا السيطرة. سيرناس هي رناز المزدوج تقطعت بهم السبل التي يجب أن تبقى على الجليد والتلاعب مع القفازات.

1. الحصول على أحادي الطبقة 70-80 متموجة من ميوبلاستس الإنسان في لوحة 6 سم (حوالي 1.5 × 10 ⁶ خلايا).
   ملاحظة: هناك حاجة 5 × 10 ⁵ خلايا في ترنسفكأيشن للحصول على كونأحادي الطبقة بطلاقة من ميوبلاستس ترانزفكتد بعد 2 أيام في جنرال موتورز.
2. إعداد كوفرسليبس الزجاج (وصفت للتصوير الكالسيوم في الخطوة 7).
3. دافئ جنرال موتورز، 0.05٪ التربسين-إدتا، وبرنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية.
4. تنفيذ جميع الخطوات التالية في المستوى الثاني نسيج هود الثقافة للحفاظ على العقم.
5. في أنبوب 1.5 مل، وإرسال 500 ميكرولتر من انخفاض المصل المتوسطة، 3 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن، و 1 ميكرولتر من سيرنا في 20 ميكرومتر. مزيج بلطف والحفاظ على درجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 15-20 دقيقة.
6. خلال هذا الوقت الحضانة، وإعداد ميوبلاستس لترنسفكأيشن. بعد الشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا الملتصقة (في لوحة 6 سم) مع 1 مل من 0.05٪ التربسين-إدتا في 37 درجة مئوية و 7٪ كو ₂ لمدة 3 دقائق. وقف رد فعل عن طريق إضافة 2 مل من جنرال موتورز وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل. بعد الطرد المركزي (200 x ج لمدة 5 دقائق)، ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من جنرال موتورز.
7. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور.
8. ريسوسبيند 5 × 10 ⁵ خلايافي 200 ميكرولتر من جنرال موتورز لكل ترنسفكأيشن ( أي ل 2 ترانسفكتيونس، ريسوسبيند في 400 ميكرولتر).
9. إضافة 200 ميكرولتر من تعليق خلية إلى كل 500 ميكرولتر من خليط سيرنا-ترانسفكتانت. ماصة صعودا وهبوطا مرتين واحتضان لمدة 5 دقائق في رت.
10. إضافة 700 ميكرولتر (خلايا + سيرنا-ترانسفكتانت) إلى طبق الثقافة 3.5 سم تحتوي على ساترة الزجاج. إضافة جنرال موتورز للحصول على الحجم النهائي من 2 مل.
11. بعد 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 7٪ كو ₂ ، تماما محل المتوسطة مع 2 مل من غم جديدة. بعد 24 ساعة أخرى، أحادي الطبقة متموجة من الخلايا ترانزفكتد عادة ما تكون موجودة. إذا كان الأمر كذلك، تحفيز ميوبلاست التمايز عن طريق استبدال جنرال موتورز مع 2 مل من وسط التمايز (دم، الجدول 1 ).
12. إجراء تجارب التصوير الكالسيوم 24 - 48 ساعة بعد تحريض التمايز أو على ميوبلاستس التكاثر.
    ملاحظة: يتم تنفيذ المناعي عادة 48 ساعة بعد تحريض التمايز.

6 -أونوفلورزنس تلطيخ علامات التمايز

ملاحظة: يتم تنفيذ تلطيخ المناعي بعد 48 ساعة في دم، ولكن يمكن أيضا أن يؤديها في أوقات التمايز الأخرى. ميوجينين و MEF2 هي البروتينات النووية أعرب فقط في خلايا متباينة (قبل الانصهار في ميوتوبيس)، وتلطيخها يسمح لتقييم عملية التمايز. ميوسين سلسلة الثقيلة (ميهك) أعرب فقط في ميوتوبيس ويستخدم لتقدير حجم ميوتوب ومؤشر الانصهار (عدد نوى في ميوتوبيس / العدد الإجمالي للنوى).

1. بعد 48 ساعة في دم، وغسل أحادي الطبقة متموجة من خلايا متباينة مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في رت. القيام بذلك بعناية لتجنب فصل ميوتوبيس.
2. إصلاح الخلايا مع 1 مل من بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) لمدة 15 دقيقة في رت. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، لمدة 5 دقائق لكل منهما.
3. بيرمابيليز الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25٪ تريتون X-100 لمدة 45 دقيقة ويغسل 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
4. حظر أونسمواقع ملزمة من خلال احتضان الخلايا في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.2٪ مصل الدم الماعز توين-10 و 2٪ (حل كتلة) لمدة 30 دقيقة في رت.
5. إعداد الأجسام المضادة الأولية المخفف في حل كتلة (600 ميكرولتر لكل لوحة 3.5 سم).
   ملاحظة: يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الماوس المضادة للميوجينين (1: 600)، أرنب المضادة لل MEF2 (1: 300)، والفأر المضادة لل ميهك الأجسام المضادة (MF20، 1: 1،000). فمن الممكن لخلط في نفس الحل حجب، الماوس المضادة للميوسين سلسلة الثقيلة أو الماوس المضادة للميوجينين، مع الأرنب المضادة MEF2.
6. إزالة حل كتلة وإضافة 600 ميكرولتر من الحلول الأجسام المضادة الأولية لكل لوحة 3.5 سم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب.
7. غسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 1 ساعة في رت في غرفة مظلمة مع 600 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية أعدت في حل كتلة، على النحو التالي: الماعز المضادة للفأر اليكسا 488 (1: 1،000)، الماعز المضادة للأرنب اليكسا 546 (1: 1،000)، و دابي (1:50، حل المخزون في 15 ميكرومتر).
   CAUTION: دابي هو مركب سامة التي ينبغي التعامل معها مع القفازات.
8. نضح وغسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
9. جبل كوفرسليبس الزجاج باستخدام البولي فينيل الكحول تصاعد المتوسطة مع حل أنتيفادينغ. الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية ومحمية من الضوء حتى تصوير الخلايا.

7. التصوير الكالسيوم

1. الثقافة السابقة، وإعداد كوفرسليبس الزجاج 25 ملم في القطر. وضع كوفرسليبس في الايثانول 70٪ لمدة 48 ساعة لإزالة أي الشحوم والأوساخ من السطح، مما يقلل من التزام الخلية ساترة.
2. بعد الشطف مرات كوفرسليبسيفيرال مع الماء، ووضعها مرة أخرى في الماء وتعقيم لهم (تعقيمها).
3. وضع ساترة واحدة لكل 3.5 سم لوحة الثقافة والسماح لهم الجافة. تخزين أطباق بتري لمزيد من التجارب أو استخدامها على الفور.
4. إضافة ميوبلاستس ترانزفكتد (5 - 6 × 10 ⁵ خلايا) إلى ساترة الزجاج.
   ملاحظة: يتم التجارب 24 - 48 ساعة بعد تحريض ديفيرنتياتيعلى، أو على انتشار ميوبلاستس.
5. لأداء كا ^{2 +} التصوير، وغسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني أو مباشرة مع المتوسطة المستخدمة للتجارب (التي تحتوي على الكالسيوم المتوسطة؛ الجدول 3 ). تحميل الخلايا مع 2 ميكرومتر فورا -2 / آم زائد 1 ميكرومتر حمض بلورونيك لمدة 30 دقيقة في الظلام في رت.
   ملاحظة: حمض بلورونيك يساعد على ذوبان فوري-2. يتم حل فوري-2 / آم وحمض بلورونيك في وسط يحتوي على الكالسيوم.
6. غسل الخلايا مرتين في نفس المتوسطة ولكن من دون فورا -2 / آم وحمض بلورونيك وتركها في الظلام لمدة إضافية 10 - 15 دقيقة للسماح لإزالة دي من Fura- 2 / آم.
7. إذا كانت كفاءة تحميل فورا-2 منخفضة جدا، إضافة المزيد فوري-2 (على سبيل المثال، 4 ميكرومتر) و / أو احتضان الخلايا لفترة أطول (على سبيل المثال، 40 دقيقة).
8. إزالة ساترة من لوحة الثقافة وتثبيته في الغرفة التجريبية. إضافة ~ 1 مل من الكالسيوم التي تحتوي على المتوسطة (اعتمادا على حجم التجربةغرفة العقلية). تثبيته على مرحلة المجهر وبدء التسجيل.
   ملاحظة: الكالسيوم الفلورسنت ^{2 +} التحقيق الحساسة فورا -2 هو متحمس بالتناوب في 340 نانومتر و 380 نانومتر، ويتم جمع ضوء الانبعاثات في 510 نانومتر. كما تقلبات تركيز كا ^{2 +} بطيئة نسبيا، والحصول على 1 نسبة كل 2 ثانية.
9. لتنشيط سوس، يستخدم الكلاسيكي ثابسيجارجين / كا ^{2 +} بروتوكول إعادة الإضافة التالية: ترك الخلايا لمدة 2-3 دقائق في وسط يحتوي على الكالسيوم. استبدال المتوسطة مع وسط خالية من الكالسيوم لمدة 1-2 دقيقة.
   1. إضافة 1 ميكرومتر ثابسيجارجين لاستنفاد مخازن الكالسيوم الداخلية.
      ملاحظة: ثابسيغارجين هو مانع لا رجعة فيه من ساركو-إندوبلاسميك الشبكة كا ^{2 +} أتباس (سيركا) النشاط مضخة.بعد 8-10 دقيقة، بسرعة محل المتوسطة مع التي تحتوي على الكالسيوم المتوسطة. كا ²⁺ سوف يدخل الخلايا من خلال قنوات سوس. انتظر حوالي 5 دقائق قبل إنهاء التجارب.
      تنبيه: ثابسيجارجين هو مركب سامة التي ينبغي التعامل معها مع القفازات.

8. كا ^{2 +} قياس التحليل

ملاحظة: إجراء التحليل مع برنامج الاستحواذ.

1. افتح التجربة. رسم المنطقة 1 في منطقة حيث لا توجد خلايا (منطقة الخلفية)، ورسم المناطق الأخرى في السيتوبلازم من الخلايا ليتم تحليلها (المناطق يمكن استخلاصها على أي صورة: 340 نانومتر، و 380 نانومتر، أو نسبة الصورة). انتقل إلى "تشغيل التجارب"> "الصور المرجعية". ضمن القنوات 340 و 380، حدد "المنطقة 1" ثم انقر على "طرح الخلفية".
2. تشغيل التجربة بأكملها (F4: إلى الأمام) للتأكد من أن لا شيء يتداخل مع منطقة الخلفية، مثل بقعة الغبار الفلورسنت التي تنتقل عبر منطقة الخلفية، وأن الخلايا لا تتحرك خلال وقت التجارب.
   ملاحظة: مناطق الاهتمام التي يتم تحديدهايجب أن لا تشمل المناطق المظلمة. وإلا، فإن قيمة نسبة تظهر صاخبة، كجزء من الخلفية سيتم تضمينها في القياس.
3. انقر على "تسجيل البيانات" وتشغيل التجربة بأكملها مرة أخرى.
   ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى فتح جدول بيانات يتم فيه تسجيل الوقت والنسبة. ومن الممكن أيضا لإنقاذ 340 نانومتر و 380 نانومتر الأطوال الموجية الفردية.
4. للحصول على معلومات حول سوس، استخراج البارامترات الهامة اثنين من التجربة: اتساع كا ^{2 +} إعادة إضافة ومنحدر المرحلة كا ^{2 +} دخول ( الشكل 3 ).
5. الحصول على السعة عن طريق طرح قيمة نسبة فقط قبل كا ^{2 +} إعادة إضافة من السعة القصوى لل كا ^{2 +} الارتفاع. الحصول على المنحدر الأقصى من خلال تركيب الانحدار الخطي للثواني الأولى بعد كا ^{2 +} إعادة إضافة.
   ملاحظة: المنطقة تحت منحنى الاستجابة ثابسيجارجين هو أيضا معلمة بالمعلومات ل إكستراكt، حيث أنه يعكس كمية الكالسيوم الحر المخزن في سر.

النتائج

بعد التفكك الأنزيمي لعينة العضلات البشرية، تم تضخيم الخلايا في جنرال موتورز. تم الحصول على ميوبلاستس الإنسان، والمعروفة باسم CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- الخلايا، بعد فاكس. ميوبلاستس تمثل أكثر من 60٪ من السكان تحليلها ( الشكل 1 ). تم إعادة تكوين ميوبلاستس ال?...

Discussion

العزلة والثقافة ميوبلاستس الإنسان من العضلات والهيكل العظمي الكبار يقدم نموذج في المختبر لدراسة التمايز العضلات وتجديد العضلات. في هذه الورقة، ونحن نقدم بروتوكول يسمح لتنقية غلة عالية من ميوبلاستس الإنسان بطريقة بسيطة ومحدودة التكلفة. وبالإ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F10	ThermoFisher Scientific	31550-023
FCS	ThermoFisher Scientific	10270-106	Lot 41G5532K
BSA	Sigma	O5482
fetuin	Sigma	F3385
EGF	Corning	354001
Dexamethansone	Sigma	D1756
Insulin	Sigma	I9278
Creatine	Sigma	27900
Pyruvate	Sigma	P4562
Uridine	Sigma	U3003
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15710-049
Trypsin-EDTA 0.05%	ThermoFisher Scientific	25300-062
70 μm cell strainer	Falcon	352350
40 μm cell strainer	Falcon	352340
Falcon 50 ml tube	Falcon	352070
Falcon 15 ml tube	Falcon	352096
Falcon 5 ml tube (FACS)	Falcon	352058
Culture medium: OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	31985-047
Transfectant reagnt: RNAiMax	ThermoFisher Scientific	1756064
PBS	ThermoFisher Scientific	14190-094
Mounting medium	Fluka	10981
Mouse anti-MyHC *	DSHB	MF20	concentrate
Mouse anti-myogenin	BD Pharmigen	556358
Rabbit anti-MEF2	Santa Cruz Biotech	C-21
Goat anti-mouse Alexa488	ThermoFisher Scientific	A11029
Goat anti-rabbit Alexa 546	ThermoFisher Scientific	A11035
Mouse anti human CD56-Alexa488	BD Pharmingen	557699
Mouse anti human CD146-PECy7	BD Pharmingen	562135
Mouse anti human CD45-PE-CF594	BD Pharmingen	562279
Mouse anti human CD34-APC	BD Pharmingen	345804
Mouse anti human CD144-PE	BD Pharmingen	560410
Alexa Fluor 488 mouse IgG1k	BD Pharmingen	557702
PECy7 mouse IgG1k	BD Pharmingen	557872
PE-CF594 mouse IgG1k	BD Pharmingen	562292
APC mouse IgG1k	BD Pharmingen	550854
PE mouse IgG1k	BD Pharmingen	556650
DAPI	Sigma	D9542	CAUTION:  toxic compound
Paraformaldehyde	Fluka	762400
Fura-2 AM	ThermoFisher Scientific	F1201
Pluronic F-127	ThermoFisher Scientific	P3000MP
Thapsigargin	Sigma	T9033	CAUTION : toxic compound
Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3	Molecular Device
* : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A.