Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell'entrata del calcio a livello di deposito

Riepilogo

Qui descriviamo una metodologia per ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal tessuto muscolare adulto. Queste cellule sono utilizzate per studiare la differenziazione muscolare scheletrica in vitro e, in particolare, per studiare le proteine ​​coinvolte nella segnalazione Ca ²⁺ .

Abstract

Le cellule satellitari (SC) sono cellule staminali muscolari situate tra la membrana plasmatica delle fibre muscolari e la lamina basale circostante. Sono essenziali per la rigenerazione muscolare. A seguito di lesioni, che si verificano spesso nei muscoli scheletrici, vengono attivati ​​SC. Si proliferano come mioblasti e si differenziano per riparare le lesioni muscolari. Tra molti eventi che si verificano durante la differenziazione muscolare, i segnali citocholic Ca ²⁺ sono di grande importanza. Questi segnali Ca ²⁺ derivano da Ca ²⁺ rilascio dalla interne Ca ^{2 +} negozi, nonché da Ca ²⁺ voce dallo spazio extracellulare, in particolare il negozio azionato Ca ²⁺ entrata (Soče). Questo documento descrive una metodologia utilizzata per ottenere una pura popolazione di mioblasti umani provenienti da campioni muscolari raccolti dopo la chirurgia ortopedica. Il tessuto viene digerito meccanicamente ed enzimatico e le cellule vengono amplificate e poi ordinate mediante citometria a flusso in funzione della presenza di speciMarcatori a membrana fic. Una volta ottenuto, i mioblasti umani si espandono e si impegnano a differenziarsi rimuovendo i fattori di crescita dal mezzo di coltura. I livelli di espressione di fattori specifici di trascrizione e di immunofluorescenza in vitro vengono utilizzati per valutare il processo di differenziazione miogenica nelle condizioni di controllo e dopo la silenziazione delle proteine ​​coinvolte nella segnalazione Ca ²⁺ . Infine, abbiamo dettagliato l'uso di Fura-2 come una sonda ratiometrica Ca ²⁺ che fornisce misure affidabili e riproducibili di SOCE.

Introduzione

I muscoli scheletrici umani sono composti da gruppi di fibre muscolari contrattili e multinucleate derivanti dalla fusione di cellule precursori miogeniche. I muscoli scheletrici hanno la capacità di rigenerarsi dopo lesioni grazie alla presenza di SC, le cellule staminali del muscolo scheletrico situate tra la membrana plasmatica delle miofibere (sarcolemma) e la lamina basale. Nel muscolo non sinistro, gli SC sono prevalentemente presenti in uno stato quiescente. In risposta a stress meccanici o lesioni, le SC si attivano (myoblasti), si proliferano e subiscono differenze per formare nuove miofibere o auto-rinnovamento per ricostituire il pool SC ^{1 , 2} . Nel corso degli anni sono state sviluppate diverse tecniche per isolare SC e la loro progenie, i mioblasti, dalle biopsie muscolari dello scheletro. Con la maggiore comprensione dei marker di superficie delle cellule espressi su queste cellule e la metodologia della classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) ^{3, 4 , 5} , è ora possibile isolare popolazioni puro di mioblasti umane dai campioni muscolari.

La segnalazione del calcio regola lo sviluppo muscolare scheletrico, l'omeostasi e la rigenerazione. In particolare, la voce Ca ²⁺ attivata dopo l'esaurimento intracellulare del negozio, chiamata SOCE, è di grande importanza ⁶ per questi processi. Con la stimolazione cellulare, il livello Ca ²⁺ nel reticolo endo / sarcoplasmatico (ER / SR) diminuisce, che a sua volta attiva il canale Ca ²⁺ delle membrane plasmatiche che consentono l'ingresso di Ca ²⁺ per riempire l'ER / SR ⁷ . Le due principali proteine ​​coinvolte nella SOCE sono la proteina di interazione stromale 1 (STIM1) ER / SR Ca ²⁺ e la membrana plasmatica Ca ²⁺ canale Orai1. Il muscolo scheletrico esprime abbondantemente queste due proteine, così come altre proteine ​​delle stesse famiglie (STIM2 aNd Orai2-Orai3) ^{8 , 9} e diversi canali permeabili Ca ²⁺ della famiglia canonica potenziale recettoriale transiente (TRPC) ^{10 , 11 , 12 , 13} . La penetrazione Ca ²⁺ attraverso il percorso SOCE è di grande importanza per la formazione / rigenerazione muscolare ¹⁴ . Le mutazioni delle proteine ​​STIM1 o Orai1 hanno effetti deleteri sulla funzione muscolare, determinando principalmente l'ipotonia muscolare ¹⁵ . Modelli animali con insufficienza SOCE mostrano anche ridotta massa muscolare e della forza, insieme con una maggiore affaticabilità ^{6, 16, 17.} Come già accennato, altre proteine ​​di STIM e Orai, così come molti canali TRPC, sono espresse in muscoli scheletrici, ei loro rispettivi ruoli non sono stati ancora determinati. Colpendo dPossiede il loro livello di espressione, è quindi possibile esaminare le loro implicazioni nella SOCE e nei loro ruoli durante la differenziazione muscolare scheletrica umana.

La misurazione SOCE può essere effettuata utilizzando due approcci diversi: registrazioni elettrofisiologiche di corrente e misurazioni Ca ²⁺ . L'elettrofisiologia è sicuramente un metodo più diretto, in quanto misura la corrente dell'interesse e la relativa firma elettrofisiologica. Tuttavia, questa tecnica è molto difficile applicarsi alle cellule muscolari, soprattutto a causa della grande dimensione delle cellule muscolari e della piccola dimensione della corrente SOCE endogena. L'imaging Cytosolic Ca ²⁺ è tecnicamente molto accessibile, ma la misura è più indiretta, poiché il livello Ca ²⁺ misurato nel citosol riflette sia l'ingresso di Ca ²⁺ che il riapprocco della cellula o nei negozi interni.

Una metodologia che prevede l'isolamento di mioblasti da piccoli pezzi di scafo umanoIl muscolo etale dopo la digestione enzimatica, l'amplificazione e la FACS è spiegato in questo articolo. Il processo di differenziamento muscolare e il protocollo immunofluorescenza per seguire l'espressione dei marcatori di differenziazione nel tempo sono descritti ^18. Infine, si spiega la misurazione del SOCE e il ruolo dei differenti canali ionici nella distinzione del segnale di Ca ²⁺ e della differenziazione muscolare scheletrica.

Protocollo

I campioni muscolari umani (tessuti ottenuti da muscoli semitendinosi) sono stati raccolti durante la chirurgia ortopedica su pazienti sani come rifiuti chirurgici. Tutti i metodi relativi allo studio umano sono stati eseguiti secondo le linee guida e le regolamentazioni delle autorità svizzere di regolamentazione sanitarie e approvate dalla Commissione Cantonale d'Etichetta de la Recherche delle autorità cantonali di Ginevra (protocollo CER n. 12-259) . Consensi informati e scritti sono stati ottenuti da tutti i soggetti adulti coinvolti nello studio.

1. Isolamento dei mioblasti dal muscolo scheletrico umano

1. Durante tutte le procedure, mantenere le condizioni sterili lavorando sotto una cappa di coltura tissutale di livello II e utilizzando buffer sterili e sterili sterili.
   Nota: questa procedura può essere applicata a molti muscoli scheletrici umani.

2. Protocollo di dissociazione

1. Portare i campioni muscolari (2 - 3 g) in un sterile 6 cmpiatto.
2. Lavare i campioni muscolari con 5 - 10 ml di soluzione salina fosfata tamponata (PBS). Ripetere il lavaggio.
3. Rimuovere i tessuti connettivi e adiposi usando forbici curve e un morsetto.
4. Pesare il campione muscolare (vedere passo 2.13) e trasferirlo in una nuova piastra sterile di 6 cm.
5. Aggiungere 5 mL di 0,05% di Trypsin-EDTA.
6. Usando le forbici tagliate e strappate il tessuto muscolare in piccoli pezzi (meno di 2 mm).
7. Usando una pipetta serologica da 10 ml, trasferire il muscolo scremato in una bottiglia di dissociazione da 200 mL contenente una barra magnetica. Ripetere questa fase fino a quando 90 mL di 0,05% di Trypsin-EDTA sono stati trasferiti con tutti i muscoli tritati alla scatola di dissociazione. Chiudere la bottiglia di dissociazione e incubare a 37 ° C per 60 minuti con agitazione minima.
8. Rimuovere la bottiglia di dissociazione dal bagno di riscaldamento e fermare la reazione enzimatica aggiungendo alla bottiglia di dissociazione 10 ml di siero di vitello fetale (FCS, 10% di volume finale). Homogenizzare la miscela con una pipetta.
9. PrepSono due tubi da 50 mL con un filtro di cellule da 70 μm su ciascuno. Passare la metà della sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare su ciascun tubo pipettando su e giù sul filtro finché la sospensione non passa.
10. Centrifugare i tubi a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
11. Resuspendere le cellule con 10 ml di mezzo di crescita (GM, Tabella 1 ) e passare le cellule attraverso un filtro di cellule da 40 μm posto su un tubo da 50 ml. Centrifugare il tubo a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
12. Riposizionare le cellule con 10 ml di GM e centrifugare il tubo a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
13. Risospendere le cellule con 1 ml di GM e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer.
    Nota: di solito, una raccolta di 3 x 10 ⁵ cellule per g di muscolo dovrebbe essere raccolta. La resa è calcolata dividendo il numero di cellule per il peso del biopicino muscolare(Punto 2.4).
14. Mettere 2 x 10 ⁵ cellule in una piastra sterile da 6 cm contenente 4 mL di GM e incubare a 37 ° C e 7% CO ₂ . Preparare il maggior numero di piatti come necessario.
15. Cambiare il GM dopo 3 giorni.
    Nota: le cellule appena dissociate necessitano di tempo per aderire alla piastra di coltura. Inoltre, il primo tempo di radiazione cellulare myogenica è di circa 50-60 h. Dopo la prima divisione, il tempo di raddoppiamento è di circa 20 h.
16. Dopo 5 - 7 giorni, quando le cellule raggiungono la confluenza del 70-80% (circa 1,5 x 10 ⁶ cellule per ogni piastra di 6 cm), avviare la colorazione degli anticorpi e l'ordinamento delle cellule (fase 3).

3. Colorazione degli anticorpi e selezione delle cellule

1. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule aderenti (nella piastra da 6 cm) con 1 ml di Trypsin-EDTA 0,05% a 37 ° C e 7% di CO ₂ per 3 minuti (o incubare a 5% CO ₂ ). Interrompere la reazione aggiungendo 2 mL di GM e raccogliere le cellule in un tubo di 15 mL. Dopo centrifugazione (200 xg per 5 min), resMuovere le cellule in 1 ml di GM.
2. Contare le celle usando una camera Neubauer.
3. Eseguire le seguenti procedure su ghiaccio.
   Nota: la procedura per l'impostazione della corretta compensazione della fluorescenza sul citometro è essenziale e dovrebbe essere simile a qualsiasi citometro. I tubi 1 e 2 sono usati come controlli negativi. I tubi da 3 a 7 vengono utilizzati per impostare la compensazione sul citometro durante il primo esperimento ( Tabella 2 ). La concentrazione finale utilizzata per ogni anticorpo e il relativo isotipo corrispondente deve essere la stessa (circa 1 μg / 10 ⁶ cellule).
4. Spedire 1 x 10 ⁵ cellule per tubo (tubo da 5 mL) per i tubi da 1 a 7 ( Tabella 2 ). Posizionare la sospensione cellulare residua nel tubo 8 per l'ordinamento delle cellule.
5. Lavare le cellule con 1 mL di freddo FACS buffer (PBS-5% FCS). Chiudere e centrifugare i tubi a 200 xg e 4 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
6. Aggiungere 200 μL di buffer FACS per tubo. Aggiungere gli anticorpi a thTubo secondo la tabella 2 . Incubare su ghiaccio per 30 min.
7. Lavare le cellule: aggiungere 1 mL del tampone FACS ad ogni tubo. Chiudere e centrifugare i tubi a 200 xg e 4 ° C per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
8. Resuspendere le cellule in 500 μL di buffer FACS. Chiudere i tubi e tenerli in ghiaccio fino alla selezione delle celle. Preparare 4 tubi da 1,5 mL ciascuno contenente 500 μL di GM, che è necessario per raccogliere le cellule durante la selezione delle cellule. Tenerli in ghiaccio.
9. Ordinare i mioblasti umani mediante citometria a flusso ( Figura 1 ). Dopo aver escluso le cellule ematopoietiche CD45-positive, le cellule separate CD45-negative basate sull'espressione CD56. Quindi, portare la popolazione CD56-positiva per CD34, CD144 e CD146 (mioblasti umani sono definiti come cellule CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Riesaminare una piccola frazione della popolazione cellulare ordinata per controllare la purezza.
10. Raccogliere i tubi contenenti myobla umanaIn un tubo da 15 ml e lavare una volta aggiungendo 5 ml di GM. Centrifugare il tubo a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
11. Resuspendere le cellule in 1 mL di GM e piastrare le cellule su una piastra di 6 cm non rivestita contenente 4 mL di GM (2 x 10 ⁵ cellule per piastra). Incubare a 37 ° C e 7% CO ₂ .

4. Manutenzione delle cellule

1. Cambi la metà del terreno di coltura ogni 2 giorni. Rimuovere 2 mL di vecchio GM dal piatto di coltura e aggiungere 2 mL di GM.
   Nota: I mioblasti producono fattori di crescita che beneficiano di condizioni di coltura.
2. Trypsinize le cellule quando raggiungono la confluenza del 70-80% per evitare la pre-differenziazione. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule aderenti (nella piastra da 6 cm) con 1 mL di trypsin-EDTA allo 0,05% a 37 ° C e 7% di CO ₂ per 3 min. Interrompere la reazione aggiungendo 2 mL di GM e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. Dopo centrifugazione (200 xg per 5 min), resusIncollare le cellule in 1 mL di GM.
3. Contare le cellule e preparare piastre da 6 cm con 2 x 10 ⁵ cellule per piastra in 4 mL di GM.
4. Mantenere i mioblasti umani fino a 6 passaggi o congelarli in GM contenenti 10% DMSO, 1 x 10 ⁶ cellule per ml. Bloccare le cellule in una scatola di congelamento progressiva (1 ° C / min); Per l'immagazzinamento a lungo termine, posizionare le cellule in azoto liquido.

5. Trasfezione di mioblasti umani con siRNA

Nota: I mioblasti vengono trasfettati utilizzando un reagente di transfection commerciale due giorni prima dell'induzione della differenziazione. L'effetto di siRNA specifico contro un gene è sempre paragonato all'effetto di un siRNA di controllo. I siRNA sono RNA a doppio filamento che devono essere mantenuti sul ghiaccio e manipolati con guanti.

1. Ottenere un monolayer confluento del 70-80% di mioblasti umani in una piastra da 6 cm (circa 1,5 x ¹⁰⁶ cellule).
   Nota: 5 x 10 ⁵ cellule per transfezione sono necessarie per ottenere un conFluido monolayer di mioblasti transfettati dopo 2 giorni in GM.
2. Preparare le copertine di vetro (descritte per l'imaging del calcio nel passaggio 7).
3. GM caldo, 0,05% Trypsin-EDTA e PBS a 37 ° C.
4. Eseguire tutte le fasi seguenti in un cappuccio per la cultura tissutale di livello II per mantenere la sterilità.
5. In un tubo da 1,5 ml, spedire 500 μl di mezzo sierico ridotto, 3 μl di reagente di trasfezione e 1 μL di siRNA a 20 μM. Mescolare delicatamente e mantenere a temperatura ambiente (RT) per 15 - 20 min.
6. Durante questo periodo di incubazione, preparare i mioblasti per la trasfezione. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule aderenti (nella piastra da 6 cm) con 1 mL di trypsin-EDTA allo 0,05% a 37 ° C e 7% di CO ₂ per 3 min. Interrompere la reazione aggiungendo 2 mL di GM e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. Dopo centrifugazione (200 xg per 5 minuti), risospendere le cellule in 1 mL di GM.
7. Contare le celle usando una camera Neubauer.
8. Resuspendere 5 x 10 ⁵ celluleIn 200 μL di GM per ogni transfezione ( vale a dire, per 2 transfezioni, risospendere in 400 μL).
9. Aggiungere 200 μL di sospensione cellulare ad ogni 500 μL di miscela di siRNA-transfettante. Pipette su e giù due volte e incubare per 5 minuti a RT.
10. Aggiungere il 700 μL (cellule + siRNA-transfettante) ad un piatto di coltura da 3,5 cm contenente una copertura in vetro. Aggiungere GM per ottenere un volume finale di 2 ml.
11. Dopo 24 h a 37 ° C e 7% CO ₂ , sostituire completamente il mezzo con 2 ml di GM fresco. Dopo altri 24 h, è solitamente presente un monolayer confluente di cellule trasfettate; In caso affermativo, indurre la differenziazione del mioblasto sostituendo il GM con 2 mL di mezzo di differenziazione (DM, Tabella 1 ).
12. Eseguire esperimenti di formazione del calcio 24 - 48 h dopo l'induzione della differenziazione o sulla proliferazione di mioblasti.
    Nota: L'immunofluorescenza viene di solito eseguita 48 h dopo l'induzione della differenziazione.

6. ImmUnofluorescenza Colorazione dei marker di differenziazione

Nota: La colorazione dell'immunofluorescenza viene eseguita dopo 48 ore in DM, ma può essere eseguita anche in altri tempi di differenziazione. Myogenin e MEF2 sono proteine ​​nucleari espresse solo in cellule differenziate (prima della fusione in miotubi) e la loro colorazione consente di valutare il processo di differenziazione. La catena pesante Myosin (MyHC) è espressa solo in myotubes ed è usata per stimare la dimensione del myotube e l'indice di fusione (numero di nuclei in myotubes / numero totale di nuclei).

1. Dopo 48 h in DM, lavare il monolavoro confluente di cellule differenziate due volte con 1 ml di PBS a RT. Fai questo con attenzione per evitare di staccare i myotubes.
2. Fissare le cellule con 1 ml di 4% di paraformaldeide (PFA) per 15 minuti a RT. Lavare le cellule con PBS due volte, per 5 minuti ciascuno.
3. Permeabilizzare le cellule con 1 ml di PBS contenente 0,25% Triton X-100 per 45 minuti e lavare 3 volte con 1 ml di PBS.
4. Blocca unsPecifici incubando le cellule in PBS integrate con 0,2% Tween-10 e 2% di capra di capra (soluzione di blocco) per 30 minuti a RT.
5. Preparare anticorpi primari diluiti in soluzione a blocchi (600 μL per piastra da 3,5 cm).
   Nota: vengono utilizzati gli anticorpi primari seguenti: anti-miogenina del mouse (1: 600), coniglio anti-MEF2 (1: 300) e anticorpi anti-MyHC del mouse (MF20, 1: 1000). È possibile mescolare nella stessa soluzione di blocco, la catena pesante anti-myosina del mouse o anti-miogenina del mouse, con anti-MEF2 coniglio.
6. Rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere 600 μL di soluzioni anticorpali primarie per una piastra da 3,5 cm e incubare per una notte a 4 ° C in una camera umidificata.
7. Lavare le cellule 3 volte con 1 ml di PBS. Incubare per 1 h alla RT in una camera oscura con 600 μL degli anticorpi secondari preparati nella soluzione di blocco, come segue: Alexa 488 anti-mouse capra (1: 1,000), Alexa 546 anti-rabbino capra (1: 1000) E DAPI (1:50, soluzione di riserva a 15 μM).
   CAUTION: DAPI è un composto tossico che deve essere manipolato con i guanti.
8. Aspirare e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS.
9. Montare le copertine di vetro usando il mezzo di montaggio dell'alcool polivinilico con la soluzione antifading. Tenerli a 4 ° C e protetti dalla luce fino all'immagine delle cellule.

7. Calcio Imaging

1. Cultura precedente, preparare le copertine in vetro di 25 mm di diametro. Mettere le copertine in etanolo al 70% per 48 ore per rimuovere grassi e sporcizia dalla superficie, che riduce l'adesione cellulare alla copertura.
2. Dopo aver risciacquato le copertine più volte con acqua, metterle nuovamente in acqua e sterilizzarle (autoclavate).
3. Mettere una copertura per la piastra di coltura da 3,5 cm e lasciarli asciugare. Conservare i piatti di Petri per ulteriori esperimenti o utilizzarli immediatamente.
4. Aggiungere i myoblasti transfettati (5 - 6 x 10 ⁵ cellule) alla copertura in vetro.
   Nota: gli esperimenti vengono eseguiti 24 - 48 h dopo l'induzione di differentiatiOn, o sulla proliferazione di mioblasti.
5. Per eseguire l'imaging Ca ²⁺ , lavare le cellule 2 volte con PBS o direttamente con il mezzo utilizzato per gli esperimenti (terreno contenente calcio, Tabella 3 ). Caricare le cellule con 2 μM Fura-2 / AM e 1 μM di acido pluronico per circa 30 minuti al buio a RT.
   Nota: L'acido pluronico aiuta a solubilizzare Fura-2. Fura-2 / AM e acido pluronic sono sciolti nel mezzo contenente calcio.
6. Lavare le cellule due volte nello stesso mezzo ma senza Fura-2 / AM e acido pluronico e lasciarle al buio per altri 10-15 minuti per consentire la de-esterificazione di Fura-2 / AM.
7. Se l'efficienza di caricamento di Fura-2 è troppo bassa, aggiungere un altro Fura-2 ( ad esempio, 4 μM) e / o incubare le cellule per un tempo più lungo ( ad esempio, 40 minuti).
8. Rimuovere il coperchio dalla piastra di coltura e installarlo nella camera sperimentale. Aggiungere 1 ml di mezzo contenente calcio (a seconda del volume dell'espertoCamera mentale). Installarlo sulla fase del microscopio e avviare la registrazione.
   Nota: La sonda fluorescente Ca 2 ⁺ -sensitiva Fura-2 viene eccitata alternativamente a 340 nm e 380 nm e la luce di emissione viene raccolta a 510 nm. Poiché le oscillazioni della concentrazione Ca ²⁺ sono relativamente lente, acquisire 1 rapporto ogni 2 s.
9. Per attivare SOCE, viene utilizzato il seguente classico protocollo thapsigargin / Ca ^{2+ di} re-aggiunta: lasciare le cellule per 2-3 min in mezzo contenente calcio. Sostituire il supporto con un mezzo privo di calcio per 1-2 minuti.
   1. Aggiungere 1 μM thapsigargin per esaurire i depositi di calcio interni.
      Nota: Thapsigargin è un bloccante irreversibile di attività della pompa sarco-endoplasmatica Ca ²⁺ ATPase (SERCA). Dopo 8-10 minuti sostituire rapidamente il mezzo con il mezzo contenente calcio. Ca ²⁺ entrerà nelle celle attraverso i canali SOCE. Attendere circa 5 minuti prima di terminare gli esperimenti.
      ATTENZIONE: Thapsigargin è un composto tossico che deve essere manipolato con guanti.

8. Ca ²⁺ Analisi delle misure

Nota: eseguire l'analisi con il software di acquisizione.

1. Apri l'esperimento. Disegna la regione 1 in una zona in cui non esistono celle (regione di sfondo) e tracciano le altre regioni nel citoplasma delle cellule da analizzare (le regioni possono essere disegnate su qualsiasi immagine: i 340 nm, i 380 nm, O l'immagine di rapporto). Vai a "Esegui esperimenti"> "immagini di riferimento". Sotto i 340 e 380 canali, seleziona "regione 1" e poi clicca su "Sottrarre lo sfondo".
2. Esegui l'intero esperimento (F4: in avanti) per assicurarsi che nulla interferisca con la regione di sfondo, ad esempio un punto di polvere fluorescente che attraversa la regione di sfondo e che le cellule non si muovono durante il tempo degli esperimenti.
   Nota: Le regioni di interesse selezionateNon dovrebbe includere aree scure; Altrimenti, il valore di rapporto apparirà rumoroso, come parte dello sfondo sarà incluso nella misurazione.
3. Fai clic su "Dati del registro" e riproduce di nuovo l'intero esperimento.
   Nota: aprire un foglio di calcolo in cui viene registrato il tempo e il rapporto. È anche possibile salvare le singole lunghezze d'onda 340 nm e 380 nm.
4. Per ottenere informazioni su SOCE, estrarre i due parametri importanti dall'esperimento: l'ampiezza della re-aggiunta Ca ²⁺ e la pendenza della fase di ingresso Ca ²⁺ ( Figura 3 ).
5. Ottieni l'ampiezza sottraendo il valore di rapporto appena prima della ricomposizione Ca ²⁺ dall'amplificazione massima dell'elevazione Ca ²⁺ . Ottieni la pendenza massima montando una regressione lineare dei primi secondi dopo la ricomposizione Ca ²⁺ .
   Nota: L'area sotto la curva della risposta di thapsigargin è anche un parametro informativo per estrarreT, in quanto riflette la quantità di calcio libero immagazzinato nel SR.

Risultati

Dopo la dissociazione enzimatica di un campione muscolare umano, le cellule sono state amplificate in GM. I mioblasti umani, definiti come cellule CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, sono stati ottenuti dopo FACS. Myoblasti rappresentavano più del 60% della popolazione analizzata ( Figura 1 ). I mioblasti umani primari sono stati riversati, coltivati ​​alla confluenza e coltivati ​​in DM per 48 h. Dopo l'immunostaining per l'espressione del fattore di trascrizione ME...

Discussione

L'isolamento e la cultura dei mioblasti umani dal muscolo scheletrico adulto offre un modello in vitro per studiare la differenziazione muscolare e la rigenerazione muscolare. In questo documento, forniamo un protocollo che consente la purificazione di elevate rese di mioblasti umane in modo semplice e costoso. Inoltre, questa tecnica fornisce risultati affidabili e riproducibili in termini di percentuale di mioblasti isolati e della loro efficacia di differenziazione myogen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F10	ThermoFisher Scientific	31550-023
FCS	ThermoFisher Scientific	10270-106	Lot 41G5532K
BSA	Sigma	O5482
fetuin	Sigma	F3385
EGF	Corning	354001
Dexamethansone	Sigma	D1756
Insulin	Sigma	I9278
Creatine	Sigma	27900
Pyruvate	Sigma	P4562
Uridine	Sigma	U3003
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15710-049
Trypsin-EDTA 0.05%	ThermoFisher Scientific	25300-062
70 μm cell strainer	Falcon	352350
40 μm cell strainer	Falcon	352340
Falcon 50 ml tube	Falcon	352070
Falcon 15 ml tube	Falcon	352096
Falcon 5 ml tube (FACS)	Falcon	352058
Culture medium: OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	31985-047
Transfectant reagnt: RNAiMax	ThermoFisher Scientific	1756064
PBS	ThermoFisher Scientific	14190-094
Mounting medium	Fluka	10981
Mouse anti-MyHC *	DSHB	MF20	concentrate
Mouse anti-myogenin	BD Pharmigen	556358
Rabbit anti-MEF2	Santa Cruz Biotech	C-21
Goat anti-mouse Alexa488	ThermoFisher Scientific	A11029
Goat anti-rabbit Alexa 546	ThermoFisher Scientific	A11035
Mouse anti human CD56-Alexa488	BD Pharmingen	557699
Mouse anti human CD146-PECy7	BD Pharmingen	562135
Mouse anti human CD45-PE-CF594	BD Pharmingen	562279
Mouse anti human CD34-APC	BD Pharmingen	345804
Mouse anti human CD144-PE	BD Pharmingen	560410
Alexa Fluor 488 mouse IgG1k	BD Pharmingen	557702
PECy7 mouse IgG1k	BD Pharmingen	557872
PE-CF594 mouse IgG1k	BD Pharmingen	562292
APC mouse IgG1k	BD Pharmingen	550854
PE mouse IgG1k	BD Pharmingen	556650
DAPI	Sigma	D9542	CAUTION:  toxic compound
Paraformaldehyde	Fluka	762400
Fura-2 AM	ThermoFisher Scientific	F1201
Pluronic F-127	ThermoFisher Scientific	P3000MP
Thapsigargin	Sigma	T9033	CAUTION : toxic compound
Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3	Molecular Device
* : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A.