ستيريولوجيكال تقدير عدد الخلايا العصبية تتميز في أسود الدماغ الماوس باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ومعدات مجهرية القياسية

Summary

يعرض هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لتقدير إعداد الخلايا العصبية تتميز ستيريولوجيكال غير متحيزة في أسود الدماغ الماوس باستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، مجهر ضوء، يجهز كائن جدول (x, y, z الطائرة)، وبرمجيات المجال العام لتحليل الصور الرقمية.

Abstract

في بحوث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية، تحليل المسالك نيجروسترياتال، بما في ذلك تحديد مقدار الخسارة العصبية تتميز داخل أسود الدماغ، أمرا أساسيا. لتقدير عدد الخلايا العصبية تتميز الإجمالي، يعتبر غير متحيز ستيريولوجي باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية حاليا معيار الذهب. لأن النظرية وراء الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية المعقدة ونظرا لأن ستيريولوجي أمر يصعب تحقيقه دون المعدات المتخصصة، عدة نظم ستيريولوجي كاملة المتاحة تجارياً التي تشمل البرمجيات اللازمة موجودة، محض لعد أسباب الخلية. منذ شراء إعداد ستيريولوجي متخصصة ليست دائماً ممكنة، لأسباب كثيرة، يصف هذا التقرير وسيلة لتقدير ستيريولوجيكال من الخلايا العصبية تتميز بحساب استخدام معدات الفحص المجهري القياسية، بما في ذلك مجهر خفيفة، يجهز كائن الجدول (x، y، z الطائرة) مع برامج التصوير، وجهاز كمبيوتر للتحليل. ويرد شرح خطوة بخطوة حول كيفية إجراء التقدير الكمي ستيريولوجيكال باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية، ويتم توفير ملفات مبرمجة مسبقاً لحساب عدد خلايا المقدرة. وأجرى لتقييم مدى دقة هذا الأسلوب، مقارنة بالبيانات التي تم الحصول عليها من جهاز ستيريولوجي متاحة تجارياً. أرقام الخلية القابلة للمقارنة تم العثور على استخدام هذا البروتوكول والجهاز ستيريولوجي، مما يدل على دقة هذا البروتوكول بالنسبة ستيريولوجي غير متحيزة.

Introduction

التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية يعتبر عنصرا محوريا في أبحاث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية لتحديد مستوى نيوروديجينيريشن داخل المادة الرمادية (SN)^1،2. ويعتبر تقدير عدد الخلايا في منطقة لمصلحة ستيريولوجيكال غير متحيزة معيار الذهب^3،،من⁴⁵.

قبل مجيء ستيريولوجي غير منحازة، تم تقييم عدد الخلايا العصبية في الأقسام عن طريق التلاعب في التشكيلات الجانبية للخلية التي تم جردها لتصحيح للاحتمالات متغير أن الخلايا العصبية حيز البصر في مقطع. إحدى الطرق الأكثر استخداماً هو تصحيح عدد خلايا كمياً تصفها ابركرومبي⁶. هذا الأسلوب وحاول أن تأخذ في الاعتبار أن الخلايا يمكن قياسها كمياً أكثر من مرة إذا تم العثور على أجزاء من نفس الخلية في أقسام رقيقة المتاخمة. وبالتالي، ابركرومبي ومؤلفين آخرين إنشاء المعادلات التي تتطلب افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه ل الخلايا التي تم جردها^7،8. بيد هذه الافتراضات عادة لم تتحقق وذلك أدى إلى أخطاء منهجية، والاختلاف من عدد الخلايا الفعلية (أي تحيز). وعلاوة على ذلك، يمكن تخفيض التحيز ليس بأخذ العينات الإضافية³.

لتقدير أرقام الخلية باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ستيريولوجيكال، يتم تطبيق المبادئ الرياضية مباشرة تقدير أرقام الخلية مباشرة في مجلد محدد، ثلاثي الأبعاد. وميزة هذا الأسلوب أنها لا تنطوي على افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه للخلايا يتم حسابها. وهكذا، أرقام الخلية المقدرة هي أقرب إلى القيم الحقيقية والاقتراب كما يزيد حجم العينة (أي، غير متحيز)³. نظراً لأن العديد من القواعد يجب أن يتبع عند استخدام ستيريولوجي للاحتفاظ الطريقة غير متحيزة، وضعت نظم جاهزة للاستخدام التجاري ستيريولوجي (للاستعراض، انظر شميتز وهوف، 2005⁴). نظم ستيريولوجي المتخصصة تنفيذ أساليب ستيريولوجيكال التصميم القائم مع خطط أخذ العينات والمسابير مسبقاً تعريف لتقييمات ستيريولوجيكال التي تؤدي إلى الاستقلال عن الشكل والحجم، والتوزيع المكاني، وتوجه الخلايا يتم تحليلها^4،9. ومع ذلك، نظم ستيريولوجي المتاحة تجارياً غالية الثمن؛ وهذا قد يحد من تنفيذ في بحث جديد.

كان الهدف من هذه الدراسة لتطوير تقنية يمكن استخدامها لتقدير ستيريولوجيكال المستندة إلى تصميم عدد خلايا تتميز في الماوس SN، استخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية واستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، خفيفة المجهر مجهر القياسية والبرامج ويجهز x، y، z المرحلة). لهذا، يرد دليل خطوة بخطوة حول كيفية معالجة أنسجة المخ الماوس وكيفية تقدير أرقام الخلية التعطيل باستخدام ستيريولوجي غير منحازة على أساس التصميم. وعلاوة على ذلك، يتم توفير قوالب لحساب أرقام الخلية المقدرة ومعاملات للخطأ (CE).

الأسلوب الموصوفة هنا لا يقتصر على تحليل التعطيل، ولكن يمكن تكييفها للاستخدام في المناطق الأخرى المحددة تشريحيا الدماغ الماوس أو الفئران. على سبيل المثال، استخدمت ستيريولوجي غير منحازة لتقدير أرقام الخلايا العصبية في قرن آمون¹⁰ و كوروليس موضع¹¹. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم أنواع الخلايا عدا الخلايا العصبية، مثل أستروسيتيس¹² و microglia¹³، كذلك. ولذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة للعلماء الذين تعتزم تنفيذ ستيريولوجي غير متحيزة في أبحاثهم ولكنهم ليسوا على استعداد لإنفاق الكثير من المال لشراء نظام ستيريولوجي.

Protocol

اتبعت جميع التوجيهية الدولية والوطنية، و/أو المؤسسية المطبق لرعاية واستخدام الحيوانات. واعتمد البروتوكول السلطات المحلية في اونترفرانكين فون ريجيرونج، ويرزبيرج، ألمانيا-

1-تجهيز الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري

1. الفئران يوثانيزي CO ₂ أو أي دولة أخرى وافقت الأسلوب.
2. عمره 12 أسبوع ستة بيرفوسي C56Bl/6N الفئران الذكور ترانسكارديالي مع 10 مل من مخزنة الفوسفات 0.1 M المالحة (PBS) باستخدام إبرة 25-ز، ومضخة لضخ، تليها 70 مل بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 0.1 م.
   تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة والمسببة للحساسية، ومسببة للسرطان.
3. تشريح الدماغ الماوس في الطائرة الاكليلية مع مقسم طريقة عرض مصفوفة الدماغ في منطقة مم +0.74 من بريجما (الرقم 25 وأوضح فرانكلين الماوس الدماغ أطلس ¹⁴)-
4. وضع الجزء الظهرية من الدماغ، بما في ذلك التعطيل، 4% في منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 0.1 م عن د 1 في 4 درجات مئوية للغمر-التثبيت-
5. تبادل منهاج العمل لحل مول برنامج تلفزيوني السكروز/0.1 30% للحماية من البرد واحتضانها لآخر 2 د 4 ° C.
6. وضع الجزء الظهرية من الدماغ في كريومولد مليئة بالقطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب وتجميد الأنسجة ببطء في سائل تبريد الثلج الجاف إيسوبينتاني.
   تنبيه: الثلج الجاف باردة للغاية (-78 درجة مئوية)؛ استخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، بما في ذلك القفازات، بينما كان يعمل مع الثلج الجاف. الثلج الجاف يتبخر في CO ₂؛ ولذلك، تعمل تحت غطاء دخان.
7. متسلسل قص 30-ميكرومتر cryo-المقاطع في الطائرة الاكليلية وجمع الفروع، بدءاً من 2.46 مم من بريجما (الرقم 51 وأوضح فرانكلين الماوس الدماغ أطلس ¹⁴) وتنتهي عند 4.04 مم من بريجما (الرقم 64، أوضح و فرانكلين الماوس الدماغ أطلس ¹⁴)-
8. تخزين سلسلة أربعة في الأنابيب التي تمتلئ كريوبروتيكتانت (والغليسيرول 30%، اثوكسييثانول 30%، وبرنامج تلفزيوني 40 ٪) في-20 درجة مئوية. أثناء إجراء تقطيع، وضع علامة في نصف الكرة الأيمن بثقب حفرة صغيرة في المنطقة العليا من الدماغ.
9. للتلوين المناعي، حدد سلسلة واحدة من الأقسام في الماوس. بريينكوباتي أبواب التعويم الحر ح 1 في مصل الماعز العادي 10% (NGS)/2% BSA/0.5% المنظفات في 0.1 مول برنامج تلفزيوني حول شاكر. احتضان الفروع مع أرنب تيروزين الماوس المضادة hydroxylase (TH؛ وإضعاف 1:1,000) جسم المخفف بنسبة 2% NGS/2% BSA/0.5% المنظفات في 0.1 مول برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 ° C.
10. تطبيق الثانوية أضداد الأرنب Igs (تخفيف 1: 100) ح 2 في درجة حرارة الغرفة، تليها عبدين/البيوتين كاشف (تخفيف 1: 100). احتضان ووصمة عار مع 3,3-ديامينوبينزيديني-تيتراهيدروتشلوريدي (DAB) وح ₂ س ₂. جبل المقاطع بعد تلطيخ لهم على الشرائح كائن المغلفة.
    ملاحظة: ال + تتميز SN الخلايا العصبية مبينة في الشكل 1a. تلطيخ سلسلة واحدة، ملطخة في متوسط 13 SN المقاطع، تمتد من روسترال إلى أجزاء والذيلية SN بارس المكتنزة (سنبك) والشبكي، كل الحيوانات ( الشكل 1b). يتم فصل المقاطع بواسطة 120 ميكرومتر (سلسلة 1/4) ( الشكل 1 ج)-
    تنبيه: الدأب مادة مسرطنة مشتبه فيها. أنها سامة بالاتصال واستنشاق. استخدام معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع الدأب.

2. الحصول على الصور

1. إيمونوهيستوتشيميكالي "ال التقاط" الملون SN المقاطع رقمياً باستخدام برامج التصوير التي تقترن مجهر. تحليل كل على حدة في كل قسم من سلسلة واحدة-
2. استخدام الخيار مسح الشرائح من برامج التصوير. حفظ في تنسيق TIFF لصور عالية الجودة (الشكل 2).
   ملاحظة: دقة وضوح الصورة 312 بكسل لكل سم.
3. الصحافة " الحصول على " لفتح نافذة اقتناء (الشكل 2a).
تعيين
4. binning إلى " 2 " للصور الرمادية.
   ملاحظة: الحصول على الصور الرمادية بدلاً من صور ملونة يقلل من حجم ملف الصورة النهائية المكدس (الشكل 2a).
5. انقر فوق " "عرض حية" " في إطار اقتناء لفتح نافذة جديدة تظهر الصورة الحية للقسم (الشكل 2 وب).
انقر فوق
6. في " مرحلة " في إطار اقتناء. اختر " "مسح الشرائح" " في القائمة المنسدلة والاختيار المربع (الشكل 2 (ج)).
   ملاحظة: هذا يمكن اقتناء والمحاذاة للصور SN تكبيرا عاليا (630 X التكبير) في x, y-الطائرة، فضلا عن الحصول على صور مكدس مع مسافة بين صور متتالية من 1 ميكرومتر في الطائرة-z، تغطي مجموعة إجمالي من 13 μ م.
7. حدد الهدف X 2.5 للبحث للتعطيل.
8. تغيير هدف 63 العاشر-
9. تحديد الزاوية اليسرى العليا (توبليفت) (الشكل 2 (ج)) والزاوية اليمنى السفلي (لوريت) (الشكل 2d) القسم بالنقر على " مجموعة-"
10. انقر فوق " ض سلسلة " وتحقق من " سلسلة Z-طائرة " مربع (الشكل 2e).
11. تحديد سمك المحملة الفعلية من المقاطع في عد تم اختيارها عشوائياً ثلاثة مواقع كل مقطع باستخدام برامج التصوير. لهذا، انقر فوق " "عرض أعلى الإزاحة" " لتحديد الجزء العلوي من هذا الباب (الشكل 2e) ثم انقر على " "إيقاف عرض أعلى" " (الشكل 2 واو). وبعد ذلك، انقر فوق " "إزاحة أسفل طريقة العرض" " (الشكل 2 واو) ثم انقر فوق " "وقف أسفل طريقة العرض" " (الشكل 2 ز). قم بتدوين سمك المقطع.
12. طرح 3 ميكرومتر (منطقة الحرس) من الأعلى الإزاحة واكتب النتيجة في الفتحة المقابلة أعلى (ح الشكل 2). طرح 13 ميكرومتر (ارتفاع ديسيكتور البصرية) من أعلى رقم الإزاحة واكتب النتيجة في الفتحة أسفل الإزاحة (الشكل 2 طاء). تحديد المعلمات التالية: الخطوات، 14؛ الحجم، 1.00 (الشكل 2 طاء).
    ملاحظة: وهذا يتوافق مع سمك في z-الطائرة من 13 ميكرومتر، مع مسافة 1 ميكرومتر بين صور متتالية.
13. حدد الدليل لحفظ الملف (2j الشكل)-
14. انقر فوق " تسلسل " لبدء الحصول على (الرقم 2j).
15. انقر فوق " تجهيز " وتحديد المعلمات التالية: " "جميع الطائرات"، " من " التسلسل؛ " " المونتاج؛ " " سريع " و " ستيتشينج " مربعات، مع وجود تداخل صورة بنسبة 10% (الشكل 2 ك). ابدأ بغرزة الصور عن طريق النقر على " بدء ".
    ملاحظة: سيؤدي هذا إلى إنشاء الصور المكدس للتحليل (الشكل 2 لتر، الشكل 3 ألف -ه)-

3. تسلسل من "تقييم ستيريولوجيكال"

1. إجراء تحليل SN رص الصور باستخدام إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة البرمجيات الإصدار 4.7.
2. تحميل اثنين الإضافات اللازمة من موقع ImageJ.nih.gov: " "تراكب الشبكة" " المساعد ¹⁵ " "العداد خلية" " المساعد ¹⁶. تركيب كل الإضافات كما هو موضح.
3. لتقييم ستيريولوجيكال غير منحازة، تعريف المعلمات فرز الأصوات كما يلي: حجم الشبكة، 130 × 130 ميكرومتر؛ عد الإطار, 50 x 50 ميكرومتر؛ والارتفاع ديسيكتور الضوئية، 13 & #181؛ م.
4. فتح الصورة عن طريق النقر على " ملف " → " فتح " (الشكل 4 أ) تعيين حجم الصورة باستخدام " تحليل " → " "ضبط مقياس" " الأمر (الشكل 4 باء). لهذه الخطوة، تغيير حجم محدد من بكسل ميكرومتر (الشكل 4 ج)-
   ملاحظة: للصور تم تحليلها، 425 بكسل يناظر 100 ميكرومتر.
5. حدد " الإضافات " → " شبكة " → " "نوع الشبكة": خطوط " الأمر إدراج عشوائياً شبكة. تحقق من " "إزاحة عشوائية" " مربع. تحديد حجم مربع واحد داخل الشبكة (الشبكة--مربع) ك 130 ميكرون x 130 مكم = 16,900 مكم ² ( الشكل 3b و الشكل 4 د و ه)-
6. تغير نوع من الصورة 16-بت للألوان RGB (انقر فوق " صورة " → " نوع " → " لون RGB ") (الشكل 4f). قم بتحديد موقع سنبك، كما وصفها باقويت et al. ¹⁷. تطويق سنبك مع " "أداة فرشاة الطلاء" " (فرشاة العرض: 11) ( الشكل 3 جيم و زاي 4 الرقم -أنا).
7. تراجع " "ضبط مقياس" " الأوامر بواسطة النقر فوق " تحليل " → " "ضبط مقياس" " → " انقر "إزالة مقياس" " (4j الشكل -l) لتمكين أداء العمليات الحسابية في بكسل بدلاً من ذلك من ميكرومتر.
8. جعل لقطة (الشكل 4 م) وحفظ ملف الصورة، وفتح الملف الجديد مع إيماجيج (4n الشكل). حدد " نقطة " (4o الشكل) وعرض فرشاة من 25 (الشكل 4 ف). مارك كل مربع الشبكة أن إجراء اتصالات التعطيل للموضع من ديسيكتور الضوئية (4q الشكل). إجراء تحليل لعدد الخلايا في جميع ديسيكتورس الضوئية التي تكون مترجمة كاملا أو جزئيا داخل التعطيل المبينة.
9. حدد مربع شبكة واحد يحتوي على أجزاء من التعطيل. قياس الزاوية اليسرى العليا من هذه الساحة مع المؤشر في إيماجيج لتعريف x و y تنسق لتبدأ مع (الرقم 4r).
   ملاحظة: سيتم إدراج إحداثيات لبصرى ديسيكتور تحديد المواقع باستخدام " موقف ديسيكتور الضوئية " (4s الشكل)، كما هو موضح في الخطوة 4.
10. حساب موقف ديسيكتور الضوئية باستخدام قالب جدول عنوان، " موقف ديسيكتور الضوئية، " كما هو موضح في الخطوة 4.
11. معايرة ديسيكتور الضوئية (ماكرو كتبه كريستوفر وارد س.، الملف تكميلية) بالنقر فوق " الإضافات " → " وحدات الماكرو " → " تحرير " (الرقم 4t)، فتح " opt_dis_ grid.txt " ملف (الرقم 4u)، وتحديد الحجم " أوسيرجريد " في بكسل الذي يتوافق مع x، y البعد ديسيكتور الضوئية (4v الشكل). حدد حجم 50 ميكرومتر µm x 50، بحيث يعرف الحجم جانب واحد من أوسيرجريد كسل 212.5 (4.25 × 50 بكسل)-
12. تحديد موقف ديسيكتور الضوئية في الصورة المكدس عن طريق إدراج إحداثيات ImageX وإيماجيي التي تقوم بتعريف مركز ديسيكتور الضوئية (4v الشكل). تشغيل الماكرو (" وحدات الماكرو " → " "تشغيل الماكرو" ") (رقم 4w)-
    ملاحظة: سوف تختفي الشبكة من الصورة المكدس ( الشكل 3d و الشكل 4 x). سوف تستمر ديسيكتور الضوئية عند تحريك لأسفل في z-الطائرة ( الرقم 3e و الشكل 4 x)-
13. تحديد " الإضافات " → " "العداد الخلية" " لبدء تشغيل البرنامج المساعد "العداد الخلية" (الشكل 4y). تهيئة "العداد الخلية" وتحديد نوع علامة (4z الشكل). قم بتكبير الصورة (اضغط على " + ") والقيام بتقييم أرقام الخلية في تكبير من 200% ستيريولوجيكال.
14. تحديد بيريكاريا تتميز الخلايا العصبية بتقريب أو مغزليا الشكل وخلية حجمها ( الشكل 1a). تحديد عدد الخلايا باستخدام قواعد ستيريولوجيكال.
    ملاحظة: منذ ديسيكتور الضوئية مكعب ثلاثي الأبعاد ( الشكل 5a)، تعريف الجانبين الاستبعاد كالجبهة، اليسار، والجانبين العلوي للمكعب (أحمر). ولذلك، دون ' عد تي ال + الخلايا التي تأتي مع الخط الأحمر (اليسار والجبهة) أو أعلى الجانب. إضافة نتائج عدد خلايا إلى ملف جدول البيانات المعدة بعنوان، " حساب عدد الخلايا " (الخطوة 5)-
15. وفقا للصورة SN، حساب المربع الشبكة التالي الذي وضع ديسيكتور الضوئية للعد الخلية التالية، استخدام x، y الخطوات حجم الشبكة السطحية ( الشكل 5b) " موقف ديسيكتور الضوئية " قالب جدول البيانات، كما هو موضح في الخطوة 4.
16. إجراء تقدير لاستخدام الخلية رقم " حساب عدد الخلايا " جدول البيانات (الخطوة 5)-

4. حساب "موقف ديسيكتور الضوئية باستخدام" " "الضوئية ديسيكتور موقف" " "قالب جدول"

1. حساب حجم وموضع لكل ديسيكتور الضوئية وضعها في الشبكة السطحية داخل المخطط التفصيلي (SN الشكل 5 (ب)) استخدام " position.xlsx ديسيكتور الضوئية " ملف جدول بيانات (ملف تكميلي).
2. إدراج عملية التحويل من بكسل لكل ميكرومتر، حسب تعريف " "ضبط مقياس" " الأمر، إلى مواقف ملحوظة صفراء " الضوئية ديسيكتور position.xlsx " ملف ( الشكل 6a و "ملف إضافي" ).
3. إدراج حجم المخطط ديسيكتور الضوئية وحجم الشبكة-ساحة الشبكة السطحية، يعرف بطول جانب واحد (في ميكرومتر)، في مواقف ملحوظ البرتقال.
   ملاحظة: النتائج هي صورت في مربعات حمراء بجوار المربعات البرتقالية.
4. ابدأ مع الشبكة المربع ضمن مخطط التعطيل التي تم تحديدها كنقطة انطلاق (شبكة واحدة-ساحة اختير بادئ ذي بدء، كما هو الحال في الخطوة 3، 9، أعلاه)-
5. إدراج x و y تنسق، مقيسا بخطوة 3.9، إلى مربعات خضراء للملف (باستخدام هذه القيم, x, y إحداثيات ليتم حساب مركز ديسيكتور الضوئية داخل هذا المربع الأول، ويصور النتائج في مربعات زرقاء). تشغيل الماكرو opt_dis_grid.txt (ملف تكميلي).
6. حساب x, y إحداثيات ديسيكتورس الضوئية على التوالي عن طريق إدراج مسافة الشبكة-ساحة (مقيسة بعدد من المربعات) بالنسبة إلى ساحة الشبكة الأولى (مربعات براون)-
   ملاحظة: + x: الشبكة-ساحة يقع إلى اليمين؛ -x: الشبكة-ساحة يقع إلى اليسار؛ + y: شبكة مربعة تقع إلى الأسفل؛ -ص: شبكة مربعة تقع إلى الأعلى. وترد النتائج في مربعات رمادية.

5. تقدير "عدد الخلايا باستخدام" " حساب عدد الخلايا " جدول

1. حساب العدد المقدر للخلايا TH + SN كل الحيوانات (N) باستخدام الصيغة المنشورة بالغرب et al.، 1991 ³، حيث ∑ س ^– يعرف العدد الكلي للخلايا العصبية ال + عد في جميع ديسيكتورس الضوئية قسم الدماغ واحد.
   ملاحظة: يتم تضمين ارتفاع ديسيكتور الضوئية (ح) فيما يتعلق بقياس سمك المقطع (t) في المعادلة. يعرف الكسر مجال أخذ العينات (asf) كنسبة المنطقة (أ) حجم الإطار ديسيكتور الضوئية (ديسيكتور ضوئية) داخل مربع حجم الشبكة (x, y خطوة) (بصري ديسيكتور/A x، y خطوة) ( الشكل 3)، يتم تعريف قسم أخذ العينات كسر (صندوق الضمان الاجتماعي) كنسبة أقسام الدماغ قطع كامل متسلسل:
   
   لضمان الجودة الكمية المقدرة، المعامل وينبغي أن يكون الخطأ (CE) أقل من 0.10. تحديد CE استخدام الصيغة التي كوكر et al., 2001 ¹⁰:
   
2. لتقدير عدد الخلايا داخل التعطيل كل ستيريولوجيكال الماوس، قم بإدراج المعلومات المشار إليها فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للسلسلة التي تم إنشاؤها في الماوس، وارتفاع ديسيكتور الضوئية، x، y منطقة ديسيكتور الضوئية (بصري ديسيكتور، في ميكرومتر ²)، x، y مجال الشبكة مربعة (x، y خطوة ، ميكرومتر ²)، ويعني قياس سماكة المقطع (في ميكرومتر) في المربعات الصفراء باستخدام " حساب count.xlsx خلية " ملف جدول بيانات ( الشكل 6b و "ملف إضافي" ).
3. تحليل كل قسم التعطيل من الحيوان نفسه، كما هو موضح في الخطوة 5.
خلية
4. إدراج حساب لكل ديسيكتور الضوئية في مربعات رمادية، كل سطر الإشارة إلى مقطع واحد من التعطيل، واستخدام " حساب count.xlsx خلية " ملف جدول بيانات (ملف تكميلي).
   ملاحظة: عدد الخلايا المقدرة و CE المحسوبة هي صورت في مربعات زرقاء ( الشكل 6b).

6. تقدير عدد الخلايا باستخدام "نظام ستيريولوجي المتاحة تجارياً"

1. ابدأ تقدير تتميز سنبك عدد الخلايا بالنقر فوق " يسبر " → " "الضوئية فراكتيوناتور سير" " لفتح "فراكتيوناتور الضوئية" إطار سير العمل.
   ملاحظة: نافذة جديدة سوف المنبثقة لتحديد إذا سلسلة جديدة من التعطيل لن تحسب.
2. بدء سلسلة جديدة من ال + SN المقاطع بواسطة النقر فوق " بدء موضوع جديد " في نافذة منبثقة.
3. تذهب من خلال الخطوات المختلفة "سير العمل فراكتيوناتور الضوئية". قم بإعداد هذا الموضوع في الخطوة الأولى. لهذا، إدراج المحقق ' اسم s، الموضوع ' دا اسم (SN المجموعة)، ومعلومات أخرى مفيدة. إدراج أرقام المقاطع لعد لهذا التعطيل. إدراج سمك الفروع قطع الأنسجة. إدراج المقطع الفاصل الزمني، وأربعة في هذه الحالة. إدراج رقم المقطع تصميماً عشوائياً لتبدأ.
4. وفي الخطوة الثانية، تعيين المجهر انخفاض التكبير (2 X الهدف)، وحدد " 2 X عدسة ماج " من القائمة.
5. في الخطوة 3، تتبع منطقة الاهتمام باستخدام زر الماوس الأيسر، وهو سنبك، كما وصفها باقويت et al., 2009 ¹⁷-
تعيين
6. المجهر إلى تضخم عالية في الخطوة 4. لهذا، قم بتغيير الهدف إلى 100 X وحدد " 100 "ماج س" عدسة " من القائمة المنسدلة.
7. قياس سماكة المحملة في الخطوة 5 بالتركيز إلى الأعلى وإلى أسفل المقطع.
8. في الخطوة 6، تحديد حجم الإطار عد ك 50 x 50 ميكرون؛ وهذا هو حجم ديسيكتور الضوئية (x, y).
9. في الخطوة 7، تعيين حجم عينة عشوائية منتظمة (SRS) الشبكة ك 130 x 130 ميكرومتر.
10. إدخال منطقة حرس 3 ميكرومتر في الخطوة 8.
11. حفظ الإعدادات في الخطوة 9-
وأخيراً، عد
12. ال + تتميز الخلايا الموجودة في كل من ديسيكتورس البصرية داخل الشبكة SRS في الخطوة 10 من "سير فراكتيوناتور البصري". لذلك، ابدأ بالنقر فوق " عد " زر.
13. بعد الانتهاء من مقطع واحد، انقر على " "يبدأ المقطع التالي" " زر لبدء تشغيل "سير العمل فراكتيوناتور الضوئية" للمقطع التالي من التعطيل لنفس سلسلة SN.
14. عند قد تم تحديده كمياً SN القسم الأخير من سلسلة SN واحدة، انقر على " وأنا ' ve انتهى العد. "
15. انقر فوق " "عرض نتائج" " الزر لعرض نتائج العينات ستيريولوجي.

النتائج

استخدام أسلوب عرضها، العدد المقدر لل + تتميز الخلايا العصبية في حق التعطيل وتراوحت بين الخلايا 7,363 و 7,987، وفي اليسار التعطيل، بين الخلايا 7,446 و 7,904. وبالتالي، كان متوسط عدد الخلايا العصبية تتميز (± SEM) 7,647 الخلايا 83 ± ± 7,675 66 لليسار التعطيل وحق التعطيل. CE المحسوبة لكل الحيوانا?...

Discussion

ويبدأ ستيريولوجي مع معالجة الأنسجة. يجب أن يتم قطع الأنسجة SN المسلسل بعناية لمنع الخسائر في الأقسام أثناء تحليل ستيريولوجيكال. بالإضافة إلى ذلك، خطوة أساسية للاحتفال واحد نصف الكرة الأرضية بغية تمييز الحق من اليسار SN عند تنفيذ ستيريولوجي. وضع ثقب صغير في الجزء العلوي من جذع الدماغ تولد نت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2