הערכה stereological של דופאמין נוירון במספר העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד אופטי Fractionator

Summary

עבודה זו מציג עבור הערכת stereological לא משוחדת של מספרים דופאמינרגיים וכולינרגיים פרוטוקול צעד אחר צעד העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד (קרי, מיקרוסקופ אור, טבלה אובייקט ממונע (x, y, z המטוס), ותוכנה הציבור לניתוח תמונה דיגיטלית.

Abstract

במחקר פרקינסון ניסויים פרה-קליניים, ניתוח של דרכי nigrostriatal, לרבות כימות של דופאמין אובדן נוירון בתוך הסובסטנציה ניגרה, חיוני. להעריך את מספר נוירון וכולינרגיים הכולל, לא משוחד stereology בשיטת fractionator אופטי הוא נחשב כיום תקן הזהב. בגלל התיאוריה מאחורי השיטה fractionator אופטי מורכבת, וגם בגלל stereology קשה להשגת ללא ציוד מיוחד, מספר מערכות זמינים מסחרית stereology מלאה הכוללים את התוכנה הדרושה קיימות גרידא תא לספור את הסיבות. מאז רכישת מלכודת stereology המקצועית אינה תמיד אפשרית, מסיבות רבות, דו ח זה מתאר שיטה עבור הערכת stereological של תאים עצביים דופאמין שנחשב שימוש בציוד מיקרוסקופ רגיל, כולל מיקרוסקופ אור, מוטורי בטבלת האובייקטים (x, y, z המטוס) עם תוכנת הדמיה, מחשב לצורך ניתוח. הסבר צעד אחר צעד כיצד לבצע כמת stereological בשיטת fractionator אופטי, ונשאר ניתנים הקבצים מחיישנים לחישוב משוער תא ספירת. כדי להעריך את הדיוק של שיטה זו, בוצעה השוואה לנתונים המתקבלים מנגנון stereology זמינים מסחרית. מספרי הטלפון הנייד דומות נמצאו באמצעות פרוטוקול זה המכשיר stereology, ובכך הממחיש את מידת הדיוק של פרוטוקול זה עבור stereology לא משוחדת.

Introduction

כימות של מספר דופאמינרגיים הוא מרכזי במחקר פרקינסון קליניים כדי לקבוע את מידת הקשורים ניוון מוחיים בתוך הסובסטנציה ניגרה (SN)^1,2. הערכת stereological מוטים ממספר תאים באזור של הריבית נחשבת^4,3,5תקן הזהב.

לפני כניסתו של stereology מוטים, המספר של נוירונים בחלקים הוערך על-ידי מניפולציה תא שנספרו פרופילים לתיקון ההסתברויות משתנה כי נוירונים נכנס מראה במקטע. אחת השיטות הנפוצות ביותר היה התיקון של כימות ספירת מתוארת על ידי אברקרומבי⁶. שיטה זו ניסה לקחת בחשבון כי התאים ניתן לכמת יותר מפעם אחת אם נמצאו שברי באותו התא בסעיפים דק סמוכים. לכן, אברקרומבי, מחברים אחרים שנוצרו משוואות נדרש הנחות לגבי הצורה, הגודל והכיוון של תאים ספרתי^7,8. עם זאת, בהנחות אלו היו בדרך כלל לא הבין והוביל לכן שגיאות שיטתית של התפצלות ממספר התא בפועל (קרי, הטיה). יתר על כן, הטיה לא יופחת ע י דגימה נוספות³.

עבור הערכת stereological של מספרי הטלפון הנייד באמצעות את fractionator אופטי, עקרונות מתמטיים חלות ישירות מעריכים את מספרי הטלפון הנייד ישירות באמצעי אחסון מוגדרים, תלת-ממדי. היתרון של שיטה זו הוא כי זה אינו כרוך הנחות לגבי הצורה, הגודל והכיוון של התאים התפקדות. לפיכך, מספרי הטלפון הנייד המשוער קרובים יותר ערכי אמת, להתקרב ככל גודל המדגם (קרי, לא משוחד)³. כי רבים לציית לכללים בעת שימוש stereology כדי לשמור את השיטה לא משוחד, פותחו מערכות מוכנות לשימוש מסחרי stereology (לסקירה, ראה שמיץ והוף, 2005⁴). Stereology מתמחה במערכות ליישם מבוססי עיצוב stereological שיטות עם אפריורי שהוגדרו הגששים וערכות דגימה עבור הערכות stereological להוביל העצמאות צורה, גודל, התפוצה המרחבית, כיוון תאים להיות שנותחה^4,9. עם זאת, מערכות stereology זמינים מסחרית יקרים; זה עלול להגביל יישום במחקר חדש.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח טכניקה שמיש עבור הערכת stereological מבוסס על עיצוב של דופאמין תא ספירת העכבר SN, כשנוקטים בשיטה fractionator אופטי והשימוש בציוד מיקרוסקופ רגיל (קרי, אור מיקרוסקופ תוכנה מיקרוסקופ רגיל, ממונע x, y, z הבמה). בשביל זה, מוצג מדריך צעד אחר צעד על כיצד לעבד רקמת מוח העכבר וכיצד להעריך את מספרי הטלפון הנייד SN באמצעות מבוססי עיצוב stereology לא משוחדת. יתר על כן, תבניות עבור חישוב המספרים תא המשוער ואת המקדמים של שגיאה (CE) הינם מסופקים.

השיטה המתוארת כאן אינה מוגבלת לניתוח של SN, אך ניתן להתאים לשימוש באזורים שהוגדרו מבחינה אנטומית אחרים של המוח עכבר או חולדה. למשל, stereology מוטים שימש כדי להעריך את מספרי הטלפון הנייד עצביים בהיפוקמפוס¹⁰ , לוקוס coeruleus¹¹. בנוסף, סוגי תאים שאינם הנוירונים, כגון האסטרוציטים¹² ו מיקרוגלייה¹³, יכול להיות מוערך גם כן. לכן שיטה זו יכולה להיות שימושית למדענים מי מתכוון ליישם stereology מוטים במחקר שלהם אבל הם לא מוכנים להשקיע הרבה כסף כדי לרכוש מערכת stereology.

Protocol

כל הנחיות הבינלאומי, הלאומי, ו/או מוסדיים החלים על טיפוח ועל השימוש בבעלי חיים היו במעקב. הפרוטוקול שאושר על ידי רשויות מקומיות-Regierung פון Unterfranken, וירצבורג, גרמניה-

1. אימונוהיסטוכימיה ועיבוד רקמה

1. Euthanize עכברים עם CO ₂ או אחרת אישרה שיטה.
2. Perfuse 6 בן שבוע 12 C56Bl/6N עכברים זכרים transcardially עם 10 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS) באמצעות מחט 25-G ומשאבת אינפוזיה, ואחריו 70 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS 0.1 M.
   התראה: כדורגלן הוא רעיל, אלרגניים, מסרטנים.
3. לנתח את מוח העכבר בתוך המטוס הילתית עם מילות הקסם מטריקס המוח-האזור של +0.74 מ מ Bregma (באיור 25, Paxinos, פרנקלין העכבר מוח אטלס ¹⁴).
4. לשים את החלק הגבי של המוח, כולל את SN, 4% מחברים ב- PBS 0.1 M עבור 1 י ב 4 ° C עבור טבילה-קיבעון.
5. להחליף את כדורגלן לפתרון 30% סוכרוז/0.1 מול PBS להגנה-הקפאה, תקופת דגירה של אחר d 2-4 מעלות צלזיוס
6. לשים החלק הגבי של המוח לתוך cryomold מלא עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מורכבים, לאט הקפאת הרקמה ב איזופנטאן קרח יבש מקורר נוזל.
   התראה: קרח יבש הוא קר מאוד (-78 מעלות צלזיוס); השתמש ציוד מגן אישי (PPE), כולל כפפות, תוך כדי עבודה עם קרח יבש. קרח יבש מתאדה CO ₂; לכן, לעבוד תחת ברדס fume.
7. באופן סדרתי לחתוך 30-מיקרומטר הקפאה-מקטעים בתוך המטוס הילתית ולאסוף את הסעיפים, החל מ- 2.46 מ מ Bregma (איור 51, Paxinos, פרנקלין העכבר מוח אטלס ¹⁴) ומסתיים בנקודת 4.04 מ מ Bregma (איור 64, Paxinos, פרנקלין העכבר מוח אטלס ¹⁴).
8. לאחסן ארבע סדרות צינורות אשר מלאים cryoprotectant (גליצרול 30% ethoxyethanol 30%, 40% PBS) ב-20 ° C. במהלך ההליך אופטים, לסמן את האונה הימנית על-ידי ניקב חור קטן לתוך האזור העליון של גזע המוח.
9. עבור נוגדן, בחר סדרה אחת של מקטעים לכל העכבר. Preincubate לתרשים מקטעים עבור h 1 10% עז נורמלית בסרום (דטרגנט NGS)/2% BSA/0.5% ב- 0.1 מול PBS ב מטרף. דגירה הסעיפים עם ארנב אנטי-עכבר טירוזין hydroxylase (TH; 1:1,000 דילול) נוגדן מדולל ותחטא NGS/2% BSA/0.5% 2% ב- 0.1 מול PBS בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס
10. החל משני נוגדנים נגד הארנב Igs (דילול מטריים) עבור 2 h בטמפרטורת החדר, ואחריו ריאגנט אבידין/ביוטין (דילול מטריים). דגירה, כתם עם 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) ו- H ₂ O ₂. הר הסעיפים לאחר צביעת אותם על אובייקט מצופה שקופיות.
    הערה: TH + נוירונים דופאמין SN מוצגים איור 1a. על ידי צביעת סדרה אחת, ממוצע של 13 סעיפים SN, המשתרעת rostral לחלקים סימטרית של SN pars compacta (SNpc), reticulata, מוכתמים לכל חיה ( איור 1b). המקטעים מופרדים על-ידי 120 מיקרומטר (1/4 סדרות) ( איור 1 ג).
    התראה: DAB הוא קרצינוגן חשד. . זה רעילים על ידי שאיפת והתקשרות. להשתמש עיקרון השוויון הפוליטי בעת עבודה עם DAB.

2. רכישת תמונות

1. immunohistochemically TH ללכוד צבעונית מקטעים SN דיגיטלית באמצעות תוכנת הדמיה הוא מצמידים מיקרוסקופ. בנפרד לנתח כל מקטע של סדרה אחת.
2. להשתמש באפשרות שקופית סריקה של התוכנה הדמיה. לשמור את הקובץ בתבנית TIFF לתמונות באיכות גבוהה (איור 2).
   הערה: רזולוציית התמונה הוא 312 פיקסלים לכל ס מ.
3. העיתונות " ידרשו " כדי לפתוח את החלון רכישה (איור 2 א).
4. להגדיר את binning " 2 " לתמונות בגווני אפור-
   הערה: רכישת תמונות בגווני אפור במקום תמונות צבעוניות מקטין את גודל קובץ התמונה הסופית מחסנית (איור 2 א).
5. לחץ על " להראות חיים " בחלון רכישה כדי לפתוח חלון חדש המציג את התמונה בשידור חי של המקטע (איור 2 ו- b).
6. לחץ על " הבמה " בחלון רכישה. בחר " לסרוק שקופיות " התפריט הנפתח ואבדוק תיבת (איור 2 ג).
   הערה: פעולה זו מאפשרת רכישה ומכירה היישור של תמונות SN מאוד מוגדלת (630 X הגדלה) ב- x, y-המטוס, כמו גם רכישת תמונות בערימה עם המרחק בין תמונות רצופות של 1 מיקרומטר ב z-המישור, המכסים מגוון הכולל של 13 ממוצע מ
7. בחר המטרה X 2.5 כדי לחפש SN.
8. שינוי המטרה כדי 63 x.
9. להגדיר את הפינה השמאלית העליונה (השמאלית-עליונה) (איור 2 c) ואת הפינה הימנית התחתונה (תשמע לי) (איור דו-ממדי) של המקטע על-ידי לחיצה על " סט. "
10. לחץ על " Z-סדרת " לבדוק " מסדרת מטוסי ה-Z " תיבת (איור 2e).
אתרים
11. לקבוע עובי הנטען בפועל של הסעיפים בלספור שנבחרו באקראי שלוש לכל סעיף שימוש בתוכנת הדמיה. לשם כך, לחץ על " תצוגה העליון לקזז " כדי להגדיר את החלק העליון של המקטע (איור 2e) ולאחר מכן לחץ על " להפסיק Top View " (2f איור). לאחר מכן, לחץ על " תצוגה התחתון לקזז " (איור 2f) ולאחר מכן לחץ על " התחתון נוף להפסיק " (איור 2 g). תרשום את העובי של המקטע.
12. לחסר 3 מיקרומטר (אזור משמר) מלמעלה לקזז והקלד את התוצאה לתוך החריץ היסט העליונה (איור 2 h). להחסיר 13 מיקרומטר (גובה של disector אופטי) של המספר הנגדי העליונה והקלד את התוצאה לתוך החריץ היסט התחתון (איור 2i). בחר את הפרמטרים הבאים: שלבים, 14; גודל, 1.00 (איור 2i).
    הערה: זה תואם את עובי במישור-z של מיקרומטר 13, עם מרחק 1-מיקרומטר בין תמונות רצופות.
13. בחר את הספריה כדי לשמור את הקובץ (איור 2j).
14. לחץ על " רצף " להתחיל הרכישה (איור 2j).
15. לחץ על " עיבוד " ובחר את הפרמטרים הבאים: " בכל המישורים, " מן " רצף; " " מונטאז; " ו " מהר " ו " Stitching " תיבות, עם חפיפה תמונה של 10% (איור 2 k). מתחילים לתפור את התמונות על ידי לחיצה על " להתחיל ".
    הערה: פעולה זו תיצור תמונות בערימה לניתוח (איור 2 l, איור 3a -e).

3. רצף של הערכה Stereological

1. לבצע הניתוח של SN מחסנית תמונות באמצעות ImageJ NIH את גירסת התוכנה 4.7.
2. להוריד שני התוספים הנדרשים מאתר האינטרנט ImageJ.nih.gov: " רשת כיסוי " תוסף ¹⁵ ו " תא מונה " תוסף ¹⁶. להתקין שני תוספים כפי שמתואר.
3. להערכת stereological מוטים, להגדיר את הפרמטרים הספירה כדלהלן: גודל רשת, 130 x 130 מיקרומטר; ספירת מסגרת, 50 x 50 מיקרומטר; וגובה אופטי disector, 13 & #181; מ
4. פתחו את התמונה על ידי לחיצה על " קובץ " → " פתוח " (איור 4a) להגדיר את קנה המידה של התמונה באמצעות " ניתוח " → " לקבוע קנה מידה " הפקודה (איור 4b). בשלב זה, לשנות את גודל מוגדר מ פיקסלים מיקרומטר (איור 4 ג).
   הערה: לתמונות שנותחה, 425 פיקסלים מתאימה 100 מיקרומטר.
5. בחר " תוספים " → " רשת " → " סוג רשת: קווי " פקודה כדי להוסיף באופן אקראי ברשת. בדוק " לקזז אקראי " התיבה. מגדירים את הגודל של ריבוע אחד בתוך הרשת (רשת-ריבוע) 130 מיקרומטר x 130 מיקרומטר = 16,900 מיקרומטר ² ( 3b איור , איור 4 d ו- e)-
6. שינוי תמונה סוג מ 16-bit צבע RGB (לחץ על " תמונות " → " סוג " → " צבע RGB ") (איור 4f). לאתר של SNpc, כפי שתואר על ידי. Baquet et al. ¹⁷. להקיף את SNpc עם " הכלי מברשת צבע " (מברשת רוחב: 11) ( איור 3 c ו- g איור 4 -אני).
7. בטל " לקבוע קנה מידה " הפקודה על-ידי לחיצה " ניתוח " → " לקבוע קנה מידה " → " לחץ כדי להסיר מידה " (איור 4j -l) כדי לאפשר את הביצועים של החישובים בפיקסלים אלא מאשר מיקרומטר.
8. לעשות צילום מסך (איור 4 מ'), לשמור את קובץ התמונה ולפתוח את הקובץ החדש עם ImageJ (איור 4n). בחר " נקודת " (איור 4o) ורוחב מברשת של 25 (איור 4 p). סמן כל ריבוע הרשת את אנשי הקשר SN עבור מיקום של disector אופטי (4q איור). בצע ניתוח של מספר תאים כל disectors אופטי אשר מותאמים באופן מלא או חלקי בתוך SN מחולקת לרמות את.
9. בחר רשת-ריבוע אחד הכולל חלקים SN. מידה לפינה השמאלית העליונה של הכיכר עם הסמן ב- ImageJ להגדרת x ו- y מרכזת להתחיל עם (איור 4r).
   הערה: קואורדינטות יתווסף עבור disector אופטי מיצוב באמצעות " disector אופטי עמדה " (איור 4s), כמתואר בשלב 4.
10. לחשב את המיקום disector אופטי באמצעות תבנית גיליון אלקטרוני רשאית, " אופטי disector המיקום, " כפי שמתואר בשלב 4.
11. לכייל את disector אופטי (מאקרו שנכתב על ידי כריסטופר ס וורד, קובץ משלים) על ידי לחיצה על " תוספים " → " מאקרו " → " לערוך " (איור 4t), לפתוח " opt_dis_ grid.txt " קובץ (איור 4u) ולהגדיר את הגודל " usergrid " בפיקסלים שמתאים עם x, y ממד של disector אופטי (איור 4v). בחר בגודל של 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר, כך הגודל של צד אחד של usergrid מוגדר 212.5 פיקסלים (50 x 4.25 פיקסלים).
12. לקבוע את המיקום של disector אופטי בתמונה המחסנית על-ידי הוספת הקואורדינטות ImageX ו ImageY המגדירים במרכז disector אופטי (איור 4v). להפעיל את המאקרו (" מאקרו " → " להפעיל מאקרו ") (איור 4w).
    הערה: הרשת ייעלמו מהתמונה מחסנית ( איור תלת-ממד ואיור 4 x). Disector אופטי יישמר בעת העברת במישור z-( איור 3e, איור 4 x).
13. בחר " תוספים " → " תא מונה " כדי להפעיל את התוסף תא מונה (איור 4y). אתחל את המונה התא ובחר סוג סמן (איור 4z). להגדיל התמונה (לחץ על " + ") ולבצע את ההערכה stereological של המספרים תא בהגדלה גדולה של 200%.
14. Perikarya עצביים וכולינרגיים זיהוי על ידי מעוגל או אובאלית צורה ותא גודלם ( איור 1 א'). לכמת את מספר התאים באמצעות כללי stereological.
    הערה: מאחר disector אופטי קוביה תלת-ממדי ( איור 5a), מגדירים את אי-הכללה של הצדדים כמו הקדמי, שמאל, ואת הצדדים העליון של הקוביה (האדום). לכן, דון ' TH + t ספירת תאים שמגיעים במגע עם הקו האדום (קבלה ושמאלה) או הצד העליון. להוסיף את התוצאות של ספירת קובץ הגיליון האלקטרוני מוכן רשאית, " חישוב בספירת תאי " (שלב 5).
15. על פי התמונה SN, לחשב את הרשת-הכיכר הבאה שבה ניתן למקם את disector אופטי עבור הרוזן התא הבא, באמצעות x, y צעדים הגודל של הרשת שמעליה ( איור 5b) ו " אופטי disector עמדה " תבנית גיליון אלקטרוני, כפי שמתואר בשלב 4.
16. לבצע הערכה של מספר תאים באמצעות " חישוב בספירת תאי " גיליון אלקטרוני (שלב 5).

4. חישוב מיקום אופטי באמצעות Disector " עמדה Disector אופטי " תבנית גיליון אלקטרוני

1. לחשב את הגודל והמיקום של כל disector אופטי למקם לתוך הרשת שמעליה במבנה החלוקה לרמות של (SN איור 5b) באמצעות " אופטי disector position.xlsx " קובץ גיליון אלקטרוני (קובץ משלים).
2. להוסיף את ההמרה של פיקסל לכל מיקרומטר, כפי שהוגדרו על ידי " לקבוע קנה מידה " הפקודה, לעמדות צהוב מסומנים " אופטי disector position.xlsx " קובץ ( איור 6a, קובץ משלים ).
3. הכנס המתוכנן לגודל disector אופטי והגודל של הכיכר-הרשת של הרשת שמעליה, שהוגדרו על-ידי האורך של צד אחד (במיקרומטר), לעמדות המסומן כתום.
   הערה: תוצאות מתוארים בתיבות אדום ליד תיבות תפוזים.
4. להתחיל עם הרשת-כיכר במבנה החלוקה לרמות SN זה נקבע כנקודת ההתחלה (רשת-ריבוע אחד נבחר מלכתחילה, כמו שלב 3.9, לעיל).
5. הוספה x ו- y מרכזת, כפי שנמדד בשלב 3.9, לתוך הקופסאות הירוקות של הקובץ (באמצעות ערכים אלה, x, y קואורדינטות עבור מרכז disector אופטי בתוך הכיכר הראשונה הזאת מחושבים, התוצאות מתוארים בתיבות כחול). להפעיל את המאקרו opt_dis_grid.txt (קובץ משלים).
6. לחשב x, y הקואורדינטות של disectors אופטי ברציפות על-ידי הוספת המרחק מקודדים (נמדד במספר ריבועי) ביחס הרשת-הכיכר הראשונה (תיבות חום).
   הערה: + x: רשת-סקוור הינו ממוקם ימינה; -x: רשת-סקוור הינו ממוקם משמאל; + y: רשת-ריבוע ממוקם בתחתית; -יום: רשת-כיכר ממוקם לפסגה. התוצאות מוצגות בתיבות אפורה.

5. אומדן תא מספר משתמש " חישוב של ספירת התאים " גיליון אלקטרוני

1. חישוב המספר המשוער של תאי TH + SN לכל חיה (N) תוך שימוש בנוסחה לאור מאת המערבית et al., 1991 ³, איפה ∑ Q ^– מוגדרת בתור המספר הכולל של תאנון + נוירונים במניין disectors אופטי כל סעיף מח אחד.
   הערה: הגובה של disector אופטי (h) ביחס העובי מדודה של הסעיף (t) הינו כלול את המשוואה. השבר אזור הדגימה (asf) מוגדר את הפרופורציה של האזור (א) של גודל מסגרת אופטי disector (disector אופטי) בתוך ריבוע בגודל של הרשת (x, y שלב) (אופטי disector/A x, y שלב) ( איור 3b), ו שבר דגימה סעיף (ssf) מוגדר היחס בחלקים של המוח לחתוך כל באופן סדרתי:
   
   כדי להבטיח איכותי וכמותי הערכות, המקדם של שגיאה (CE) צריך להיות נמוך מ 0.10. לקבוע את לסה נ באמצעות הנוסחה מאת Keuker et al., 2001 ¹⁰:
   
2. עבור הערכת stereological של מספר תאים בתוך SN של כל אחד עכבר, הכנס את המידע המצוין לגבי המספר הכולל של סדרת שנוצר לכל עכבר, הגובה את disector אופטי, x, y באזור של disector אופטי (אופטי disector, מיקרומטר ²), x, y שטח של הרשת-מרובע (x, y שלב מיקרומטר ²), הממוצע נמדד עובי של המקטע (במיקרומטר) בתיבות צהוב באמצעות " חישוב של התא count.xlsx " קובץ הגיליון האלקטרוני ( איור 6b וקובץ משלימה ).
3. לנתח כל מקטע SN מן החיה אותו, כפי שמתואר בשלב 5.
תא
4. הוספה לא שווה כל disector אופטי בתיבות אפורות, כל שורה בהתייחס לסעיף SN אחד, משתמש " חישוב של התא count.xlsx " קובץ גיליון אלקטרוני (קובץ משלים).
   הערה: המספר המשוער תא ו- CE מחושב את מתוארים בתיבות כחול ( איור 6b).

6. הערכה של מספר הטלפון הנייד באמצעות מסחרית זמינים Stereology מערכת

1. התחל ההערכה של דופאמין SNpc את המספר על ידי לחיצה על " רגשים " → " אופטי זרימת Fractionator " כדי לפתוח את Fractionator אופטי זרימת העבודה חלון.
   הערה: חלון חדש יהיה המוקפץ כדי לקבוע אם סדרה חדשה של SN הולך לספור.
2. להתחיל סדרה חדשה של תאנון + SN סעיפים על ידי לחיצה " התחל נושא חדש " בחלון המוקפץ.
3. לעבור את השלבים השונים של זרימת העבודה Fractionator אופטי. להגדיר את הנושא בשלב הראשון. בשביל זה, הוסף את החוקר ' s שם, הנושא ' s (SN קבוצה), ושם ועוד מידע מועיל. הכנס את המספרים של מקטעים שווה זה SN. הכנס את העובי של הסעיפים רקמות לחתוך. הכנס את מרווח הזמן סעיף, אשר הוא ארבעה במקרה זה. הכנס את מספר הסעיף נקבע באופן אקראי כדי להתחיל עם.
4. בשלב השני, להגדיר המיקרוסקופ נמוכה הגדלה (המטרה X 2) ובחר " 2 X עדשה Mag " ' מתפריט '.
5. בשלב 3, לאתר את האזור של עניין עם לחצן העכבר השמאלי, המהווה SNpc, כפי שתואר על ידי Baquet et al., 2009 ¹⁷.
6. מוגדר המיקרוסקופ הגדלה גבוהה בשלב 4. בשביל זה, שינוי המטרה עד 100 X ובחר " 100 מג X עדשה " מתוך התפריט הנפתח.
7. למדידת העובי הנטען בשלב 5 על ידי התמקדות לראש, לתחתית של המקטע.
8. בשלב 6, מגדירים את גודל המסגרת ספירת 50 x 50 מיקרומטר; זה גודל disector אופטי (x, y)-
9. בשלב 7, הגדר את גודל הרשת דגימה אקראית שיטתית (SRS) 130 x 130 מיקרומטר.
10. להזין אזור משמר 3-מיקרומטר בשלב 8.
11. לשמור את ההגדרות בשלב 9.
12. בסופו של דבר, לספור את ה + וכולינרגיים התאים בכל אחד disectors אופטי בתוך הרשת SRS בשלב 10 של זרימת העבודה Fractionator אופטי. בשביל זה, להתחיל על-ידי לחיצה על " ספירת " כפתור.
13. מסיים מקטע אחד, לחץ על " בסעיף הבא להתחיל " כפתור כדי להתחיל את זרימת העבודה Fractionator אופטי של המקטע SN הבאה של הסדרה SN אותו.
14. כאשר יש כבר לכמת את המקטע האחרון SN סדרה SN אחת, לחץ על " אני ' ve סיום ספירת. "
15. לחץ על " הצג תוצאות " לחצן כדי להציג את התוצאות של דגימה stereology.

תוצאות

באמצעות שיטת שהוצגו, המספר המשוער של תאנון + וכולינרגיים נוירונים הזכות SN נע בין תאים 7,363 ו- 7,987 ו, ב שמאל SN, בין תאים 7,446 ו 7,904. לפיכך, המספר הממוצע של נוירונים דופאמין (± SEM) היה ± 7,647 83 תאים עבור הזכות SN ± 7,675 66 בעד השמאל SN. לסה נ מחושבת עבור כל חיה שנמוך מ 0.08 (טווח: 0.073-0.079) (

Discussion

Stereology מתחיל עם עיבוד רקמות. חיתוך סדרתי של SN רקמה יש לבצע בזהירות כדי למנוע האובדן של מקטעים במהלך ניתוח stereological. בנוסף, הוא צעד חיוני כדי לסמן והזיז חצי אחד על מנת לבדל את הזכות מן השמאל SN בעת ביצוע stereology. הצבת לחור קטן בחלק העליון של גזע המוח להפיק את התוצאות הטובות ביותר במחקר הציג. יתר על כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2