Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

Summary

ويقدم بروتوكول microinjection بسيطة وفعالة لتحرير الجينات في أجنة سمك السلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9. في هذا البروتوكول، دليل الكشف وكانت ميكروينجيكتيد Cas9 البروتين في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول بانقطاع قناة سمك السلور اثنين من الجينات المتصلة بجهاز المناعة.

Abstract

تم تسلسل الجينوم الكامل من سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus،، مما يؤدي إلى المزيد من الفرص لدراسة وظيفة الجينات سلور قناة. وقد استخدمت الجينات بالضربة القاضية لدراسة هذه وظائف الجينات في فيفو. بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في البروتين قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر المرتبطة 9 (كريسبر/Cas9) نظام أداة قوية تستخدم لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي لتغيير وظيفة الجينات. بينما كان النهج التقليدي لإدخال مرناً كريسبر/Cas9 في الأجنة خلية مفردة من خلال microinjection، وهذا يمكن أن يكون عملية بطيئة وغير فعالة في سمك السلور. ويرد هنا، بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة مع البروتين كريسبر/Cas9. بإيجاز، كانت البيض والحيوانات المنوية إخصاب المجمعة ومصطنعة ثم يقوم. ونقل البويضات المخصبة إلى طبق بتري يحتوي على الحل هولتفريتير. معايرة حجم الحقن وثم دليل استهداف الكشف/Cas9 تم ميكروينجيكتيد عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المحتوية على المجال محول جزيء (تيكام 1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. خروج المغلوب الجينات كانت ناجحة حيث تم تأكيد إينديلس بتسلسل الحمض النووي. شملت فراميشيفت التعديلات تسلسل البروتين المتوقعة بسبب هذه الطفرات واقتطاع البروتين بسبب codons توقف سابق لأوانه.

Introduction

Microinjection أسلوب مختبرية شائعة المستخدمة لتسليم كمية صغيرة من مادة مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين، والجزيئات الكبيرة الأخرى في الخلايا أو الأجنة من خلال زجاج شعرية¹. Microinjection تتم باستخدام إعداد المعدات الخاصة بما في ذلك من ميكروينجيكتور، ميكرومانيبولاتور، و مجهر². وقد استخدمت التقنية باحثون وراثيا تعديل العديد من الكائنات الحية من خلال توليد الوراثي والجينات بالضربة القاضية، والعلاج الجيني، بهدف فهم ديناميات المكونات داخل الخلايا^{3،4 , 5}.

سمك السلور قناة (Ictalurus punctatus) من أنواع سمك السلور الأكثر شعبية في تربية الأحياء المائية وأنشطة الصيد الترفيهي في الولايات المتحدة. هناك حاجة متزايدة لدراسة الجينوم الوظيفي في سمك السلور القناة، وتسلسل الجينوم الكامل لسمك السلور قناة يعزز فائدة التقدم الذي أحرز مؤخرا في أدوات التحرير الجينوم^6،7. فهم وظيفة الجينات ليس من شأنه أن يثري البحوث التي تجري على سمك السلور، بل قد يؤدي أيضا إلى زيادة فعالية برامج التحسين الوراثي لتعزيز صناعة سمك السلور. حالما يتم تحديد الجينات الحاسمة لسمة معينة للفائدة، يمكن استخدامها لتحسين وراثيا إنتاج سمك السلور عن طريق تحرير الجينوم لتوليد الآليلات مفيدة، التحديد لهذه الآليلات، قمع الآليلات الضارة، نقل الآليلات مفيدة من خلال ترانسجينيسيس أو بعض تركيبة من هذه الخيارات. الجمع بين الجينات أفضل لمختلف الصفات المفيدة تجارياً من مختلف الأنواع في الأسماك أحد أن يحسن الإنتاجية والربحية ل عمليات إنتاج الأسماك⁸كثيرا.

خروج المغلوب الجينات أسلوب مباشر لدراسة وظائف الجينات في فيفو. سوف وراثة الطفرات على مستوى الحمض النووي من قبل الأجيال القادمة التي سوف تسهل دراسة آثارها في مختلف الأجيال. الجينوم مختلف أدوات التحرير تم المتقدمة بما في ذلك الزنك الإصبع نوكليسيس (زفنس)، النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس)، وتجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (كريسبر/Cas9 ) نظام^9،10،،من¹¹¹².

نظام كريسبر/Cas9 هو أداة قوية وفعالة التي تم استخدامها لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي بما في ذلك خروج المغلوب الجينات في الأسماك إلى الجيش الملكي النيبالي تسترشد خاصة بالموقع الحمض النووي انشقاق^5،13. يتألف النظام من دليل رنا (جرنة)، الذي يحدد تسلسل المستهدفة في الجينوم وإنزيم اندونوكليسي الحمض النووي، Cas9. يمكن تصميم نظام كريسبر/Cas9 لاستهداف أي تسلسل في الجينوم مع العديد من المزايا زفنس وتالينس: (1) انخفاض التكاليف الهندسية (2) أسهل ملزمة محددة (3) أكثر من دليل الحمض النووي الريبي لتسلسل المستهدفة، وتخفيض الطفرات خارج الهدف (4) يمكن استهداف سلاسل متعددة مع جرنة مختلفة في نفس الوقت (5) معدل الطفرات عالية في الجينات التي يمكن أن لا تكون المتحولة بواسطة تالينس، وتحسين الخط (6) انتقال معدل الطفرات ليصل إلى 6-fold عند زفنس وتالينس^{14، بالمقارنة 15،16،،}من¹⁷¹⁸.

هو الأسلوب البديل الرئيسي ل microinjection انهانسر، التي تطبق فيها النبضات الكهربائية للأجنة أو الخلايا لزيادة نفاذية الغشاء وامتصاص الجزيئات البيولوجية^19،20. عدة من الأسماك المحورة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام انهانسر مثل الميداكا (Oryzias latipes)، الزرد (دانيو rerio)، سلمون شينوك (Oncorhynchus تشاويتشا)، وسمك السلور القناة، الشبوط (Sparus صربا)، و المشتركة الكارب (Cyprinus carpio)^21،،من^2223،24،،من²⁵²⁶.

وقد استخدمت انهانسر توفير البروتين بلازميد الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، و Cas9 لخروج المغلوب الجينات. في خلايا الثدييات، Cas9/جرنة بلازميد الحمض النووي، مرناً Cas9/جرنة، ومجمعات البروتين/جرنة Cas9 تم تسليمها باستخدام انهانسر وكانت المعدلات الطفرات أعلى باستخدام مجمعات البروتين/جرنة Cas9 لمعظم شروط اختبار انهانسر²⁷. حبليات أسسيديان (سيونا إينتيستيناليس)، كانت تالينس الإعراب عن نيات اليكتروبوراتيد في البيض المخصب للحث على خروج المغلوب من جينات متعددة²⁸. وكانت زفنس الإعراب عن نيات بلازميد اليكتروبوراتيد لضرب الهرمون في سمك السلور القناة²⁹. ومع ذلك، بمجرد إدخال في الخلية، سوف تحتاج ثوابت بلازميد نسخها للجيش الملكي النيبالي وترجم إلى البروتينات الوظيفية قبل أن يمكن توجيهها بتسلسل الحمض النووي المطلوب، والمرجح أن تأخير وقت الطفرات microinjection من الجيش الملكي النيبالي بالمقارنة مع/ البروتين. كما يتم وضع جنين، يزيد الطفرات تأخر mosaicism المؤسسين حقن. وباﻹضافة إلى ذلك، التعبير المعدلة وراثيا غير المحتمل أن يحقق مستوى التعبير الممكنة مع microinjection، خفض كفاءة الطفرات.

كوسيلة لإدخال أدوات التحرير الجينوم في الخلايا، microinjection مزايا عديدة على مدى انهانسر. ويمكن إدخال الجينوم تحرير جزيئات موثوق في الخلايا أو الأجنة من خلال microinjection³⁰. هناك حاجة أقل مواد الحقن. فمن السهل لتحديد كميات المواد التي تحقن. تحقيق طفرة أعلى يمكن أن تكون معدلات مع mosaicism منخفضة في الأسماك مؤسس الذي من شأنه أن يحسن نقل الخط من الطفرات و₁. أقل مؤسس الأسماك تحتاج إلى تحليل لإنتاج الجيل الأول، نظراً لارتفاع معدل التحور. في انهانسر، المزيد من الأسماك مؤسس بحاجة إلى تحليل مما يزيد من التكاليف. ومع ذلك، بقاء الأجنة سلور قناة ميكروينجيكتيد أقل من اليكتروبوراتيد منها، على الرغم من أن هذا يمكن التغلب عليها عن طريق حقن الأجنة أكثر^31،32. في القناة سمك السلور وبقاء الأجنة ميكروينجيكتيد صفار البيض تراوحت من 16 إلى 55%، اعتماداً على الجينات المستهدفة وجرعة البروتين جرنة/Cas9³².

من الناحية الفنية تطالب microinjection العادية أجنة سمك السلور ومضيعة للوقت، ومع ذلك، بروتوكول microinjection بروتين كريسبر/Cas9 سريعة وفعالة ويرد لاجنة سمك السلور قناة. يتطلب هذا البروتوكول أقل من الوقت والخبرة منذ حل البروتين كريسبر/Cas9 يحقن صفار البيض من إحدى خلايا الأجنة. يمكن حقن مئات بويضات المخصبة في ح 1 (تقريبا الوقت اللازم لانقسام الخلية الأولى تحدث). للتحقق من البروتوكول، خرج اثنين من الجينات المتعلقة بقابلية المرض في قناة سمك السلور وعدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجين والجين يكتين (ربل) ملزمة rhamnose. 1 تيكام تشارك في مسار الإشارات بدأها عدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 3. 1 تيكام كان هائلا في سمك السلور القناة، upregulated عقب التحدي البكتيرية مع إيكتالوري ادواردسيلا، بينما كان دوونريجولاتيد في سمك السلور الزرقاء، الأنواع المقاومة إيكتالوري هاء-³³. ربل تلعب دوراً هاما في الإصابة المبكرة مع كولومناري فلافوباكتيريوم، المسبّب للمرض كولومناريس، حيث الحادة وسجلت upregulation قوية في سلالة كولومناريس عرضه قناة قرموط بالمقارنة مع ³⁴من سلالة كولومناريس المقاوم.

Protocol

أجريت هذه التجربة في وحدة بحوث الوراثة السمكية، هاء دبليو شل مركز بحوث مصائد الأسماك، وجامعة أوبورن، بن. بموافقة جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه التجربة برعاية الحيوان المؤسسية جامعة أوبورن واستخدام اللجنة (الاتحاد الأفريقي-IACUC) قبل الشروع التجربة. يمكن الاطلاع على قائمة بالمعدات واللوازم التي استخدمت في هذه التجربة في "الجدول المواد". فيما يلي خطوات وإجراءات إعداد و microinjection أجنة سمك السلور القناة خلية واحدة كما هو موضح في الشكل 1.

1-الحضنة اختيار الأسهم والتفريخ

1. اختر سمك السلور قناة صحية الأسهم الحضنة من سلالة أو الخط الوراثي للفائدة. قناة سمك السلور الذكور والإناث يجب أن يحمل الخصائص الجنسية الثانوية جيدة.
2. حدد الذكور التي لها رأس عضلي واسع الذي أوسع من بقية أجسادهم مع الحليمة الأعضاء التناسلية نمواً جيدا. الألوان الداكنة وتندب الجروح من المعارك الإقليمية أيضا علامات الاستعداد الجنسي. حدد الإناث التي لها رؤساء التي أضيق من بقية أجسادهم، ويكون البطن لينة، ملموس، جيدا مقربة. للتأكد من دقتها وتجنب مؤكدا أن الأسماك أثناء المناولة الأولى، وقف تغذية الإناث 2-3 أيام قبل دراسة عن استعدادها لوضع البيض.
3. أداء الأسماك معالجة بسرعة، ولكن بعناية. للحد من التعامل مع الإجهاد، القيام بجميع الإجراءات التي تتطلب التعامل مع الإناث أثناء الضغط على الأسماك في تفريخ أكياس (مش حجم 32 مم).
4. قبل حقن الهرمون للحث على التبويض، قياس وزن الجسم للإناث.
5. شنق في أكياس التفريخ مع الإناث داخل في تدفق من خلال الدبابات مع تدفق المياه المستمر وتهوية كافية.
6. تحميل أسيبتيكالي، إيمبلانتير له إبرة ز 14 مع 85 ميكروغرام/كغ من الإفراج عن هرمون التناظرية (لهرها) زرع الهرمون. شطف الحقن (العضلات الظهرية) مع المحلول الملحي المعقم 0.9% قبل الحقن. إدراج في إيمبلانتير بزاوية 45 درجة، والإفراج عن عملية الزرع. سحب بإبرة ومرر الحقن مع كرة القطن سابقا غارقة في الإيثانول 70%.
7. مكان حقيبة التناسل في خزان القابضة حيث أن الأسماك هي مغمورة تماما في الماء 15-20 سم تحت سطح الماء. تهوية كافية (أعلاه 5 جزء في المليون حله الأكسجين) ونوعية المياه الجيدة مهمان إباضة بيض ذات جودة عالية.
8. التنبؤ بوقت الإباضة بناء على درجة حرارة الماء باستخدام العلاقة درجة ساعة (ح)³⁵. وقت استجابة درجة-ح = الوقت بين الحقن بالهرمونات والتبويض (ح) * المياه درجة الحرارة (درجة مئوية). على سبيل المثال، وقت استجابة درجة-ح 900-1000، أنثى من المتوقع أن تفرخ في ح 36-40 من وقت حقن الهرمونات عند 25 درجة مئوية. عادة، يتم الاختيار الأولى للبيض في حوالي 36 ساعة بعد الحقن بالهرمونات، ومن ثم في الفاصل الزمني ح 4.
9. للتحقق من وجود الإباضة، بلطف رفع حقيبة التناسل فوق سطح الماء بينما كنت تبحث عن البيض المرفقة داخل حقيبة التناسل. رؤية البيض على الأقل 10 يشير إلى هذا ذكر البيض وعلى استعداد لتجريد اليد.

2. إعداد الحيوانات المنوية

ملاحظة: الحيوانات المنوية يمكن إعداد قليلة ح قبل وقت الإباضة المتوقع.

1. Euthanize الذكور بضربه الرأس دون تخدير، طرقي منذ التخدير قد يكون له تأثير سلبي على عدد الحيوانات المنوية الحركة.
2. جمع الخصيتين في مقلاة صغيرة وزنها وإزالة أي أنسجة وغسلها مع 50 مل من المحلول الملحي 0.9% لإزالة الدم، إذا لزم الأمر. الخصيتين متطورة بيضاء مع كثير من الإسقاطات فيليفورم ( الشكل 2).
3. تحديد وزن الخصيتين.
4. إعداد الحل الحيوانات المنوية لاخصاب البويضة، نقل الخصيتين إلى مركز سم 100² 100 ميكرون باستخدام الملقط. أمثال مش مع الخصيتين داخل، سحق الخصيتين وتصفية الحيوانات المنوية في أنبوب جمع 50 مل. يمكن أن يتم ذلك عن طريق تطبيق الضغط على الخصيتين داخل الشبكة ضد حافة أنبوب جمع عن طريق الإبهام. استخدم المحلول الملحي 0.9% لغسل الحيوانات المنوية من الشبكة في أنبوب جمع. يمكن إضافة المحلول الملحي حتى 10 مل/ز الخصيتين.
5. تحديد تركيز الحيوانات المنوية، وتحقق من حركية والجدوى.
   ملاحظة: يمكن تحديد تركيز قبل عد الخلايا المنوية بحجم مخفف معروفة في ميلت استخدام هيموسيتوميتير. وبدلاً من ذلك، يمكن تقدير كثافة الحيوانات المنوية بتقييم الكثافة البصرية ميلت باستخدام جهاز المطياف الضوئي. في هذا الأسلوب، يتم مقارنة الامتصاص في الطول الموجي نانومتر 505 إلى تخطيط عنصر تحكم الذي تم إعداده مسبقاً لامتصاص تركيزات مختلفة من الحيوانات المنوية³⁶. يمكن التحقق من عدد الحيوانات المنوية الحركة تحت المجهر كالوقت من التنشيط للحيوانات المنوية حتى وقف الحيوانات المنوية الحركة (وتسمى المدة حركية)³⁷. يمكن تحديد صلاحية الحيوانات المنوية بواسطة تلطيخ الحيوانات المنوية مع الأصباغ انتقائية مثل تريبان الأزرق، الذي سيكون وصمة عار الخلايا المنوية غير قابل للحياة فقط، بينما تبقى الحيوانات المنوية سليمة أونستينيد. ومع ذلك، هذا ليس ضروريا إذا الخصيتين متطورة لهذه الإجراءات microinjection،.
6. تخزين الحيوانات المنوية في المحلول الملحي 0.9% من الخطوة 2، 5 في 4 درجات مئوية، واستخدم خلال 24 ساعة بعد التحضير.

3-البيض جمع والتسميد

1. تطبيق طبقة رقيقة جداً من تقصير ليبلغ قطرها 20 سم نظيفة جافة التفريخ عموم الخضر.
2. وضع الأنثى في حل مخدر تحتوي على 100 جزء من المليون من فلورو أوكتان المشبع الميثان تريكيني مخزنة مع بيكربونات الصوديوم (يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للحل النهائي 7.0) حتى يتم تخديره كلياً³⁸من الأسماك.
   تنبيه: قد تكون مزعجة إذا استنشق، بلعها أو امتصاصه عن طريق الجلد تريكيني الميثان المشبعة بالفلور أوكتين.
3. بعناية إزالة الأسماك من حقيبة التناسل وتراجع أنه ملحي 0.9% يغسل الحل مخدر. جاف السمك تماما باستخدام منشفة نظيفة، تجنب إزالة طبقة المخاط على سطح جسم الأسماك.
4. تطبيق تقصير الخضر على المنطقة المحيطة التنفيس، بما في ذلك زعانف الحوض، لمنع مرفقات البيض خلال تجريد اليد.
5. قطاع اليد البيض في عموم التفريخ مدهون بتطبيق ضغط لطيف على المبيض. البيض جيدة ينبغي أن تتدفق بحرية ويكون أصفر اللون الذهبي، ويكون الحد الأدنى أو لا كتل أو تجلط الدم (الشكل 2). تجنب الاتصال بين البيض والماء قبل الإخصاب، كما أن المياه يمكن أن تحفز الإغلاق micropyle.
6. لتسميد البيض ل microinjection، نقل البيض 200-300 إلى وعاء التفريخ مدهون. يمكن استخدام التسميات معمل بلاستيك مدهون كملعقة لنقل البيض إلى عموم التفريخ مدهون. أضف 1 – 2 مل حل الحيوانات المنوية (من الخطوة 2، 5) البيض وتخلط برفق. يجب أن تكون نسبة الحيوانات المنوية للبويضة تقريبا 11,000 الحيوانات المنوية/البيض.
7. إضافة المياه العذبة للبيض لتنشيط الحيوانات المنوية والبيض. إضافة ما يكفي من الماء لتغطية البيض قليلاً. بلطف دوامة البيض للاخصاب س. 30 ينبغي أن يحدث في 1-2 دقيقة. من المهم أن تخصب البيض التي يتم ترتيبها في طبقة واحدة. بيض سمك السلور التمسك ببعضها البعض مما يجعل من الصعب على ميكروينجيكت طبقات متعددة من الأجنة.
8. إضافة المزيد من المياه العذبة إلى البيض المخصب والسماح للبيض تتصلب لمدة 10 – 15 دقيقة.
9. تغطية عموم التفريخ التي تحتوي على البيض المخصبة المتبقية بمنشفة مبللة لمنع تجفيف وتخصب خلال بضع ساعات. التسميد يمكن القيام به بطريقة متعاقبة، على سبيل المثال المخصبة، دفعة واحدة من 200-300 البيض يمكن أن يكون كل 30-60 دقيقة لضمان إمدادات مستمرة من الأجنة في مرحلة خلية واحدة ل microinjection والتحكم غير حقن الأجنة. تجنب الاتصال بين منشفة رطبة والبيض البيض يجوز التمسك بمنشفة رطبة مما يجعل من الصعب إزالتها. في هذا البروتوكول، كفاءة ميكروينجيكتيد البيض المخصبة داخل ح 2 – 3 بعد تجريد وكان نجاح مماثل كالبيض المخصبة فورا بعد تجريد.

4-إبرة سحب وتحميل

1. سحب زجاج البورسليكات OD 1.0 مم الشعرية في الإبر 2 (الشكل 3). تخزين الإبر في علبة ورق بقطعة من الأسفنج وبذلت فيه شقوق عديدة. تجنب كسر الإبرة، ينبغي أن يكون قطر الأسفنج أصغر من طول الساق الإبرة.
2. فتح طرف إبرة عن طريق كسر قطعة صغيرة من المنطقة أنحف الإبرة استخدام كائن حادة. وبدلاً من ذلك، افتح الإبرة معسر قبالة المنطقة أنحف من التلميح بالملقط تحت المجهر.
3. تحضير حل الحقن بخلط gRNA(s) مع البروتين Cas9. ويمكن أيضا حقن أنواع أخرى من الحمض النووي الريبي أو البروتين مع نفس الإجراء. في هذا البروتوكول، وصممت للهدف اثنين من الجينات ذات الصلة المناعي قناة سمك السلور، عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المحتوية على المجال محول جزيء (TICAM1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات جرناس والمعدة وفقا لشاه وآخرون. باستخدام الدقة العالية [تق] [بولمرس]^32،39. كانت أهداف المجينية جرناس 5 ' GGA GGT جا الائتلاف CGT CGA GGA 3' للجينات تيكام 1 (الشكل 4) و GGA ضريبة تحويل العملة TGA غيغاطن GGA جا دايمنشن ز 3 '5' لتسلسل إكسون 1 من الجينات ربل مع بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) مسطر (الشكل 6).
   1. أهداف دليل الحمض النووي الريبي الانفجار ضد الجينوم سلور قناة تسلسل وتحديد تلك مع لا مواقع خارج الهدف المحتمل.
   2. إضافة الفينول الأحمر إلى لون خلط البروتين جرنة/Cas9 إلى ثلث الحجم الإجمالي.
   3. ضبط تركيز النهائي لمزيج البروتين جرنا/Cas9 مع نوكلياسي المياه مجاناً بحيث يتم حقن كل جنين مع 50 nL تحتوي على حوالي 2.5 نانوغرام جرنا و 7.5 نغ Cas9 البروتين. احتضان المخلوط لمدة 10 دقيقة على الجليد قبل الاستخدام.
4. مع ميكرولوادير، تحميل 5 – 10 ميليلتر من خليط جرنا/Cas9 إبرة حقن بإدراج ميكرولوادير الجذعية إبرة وطرد المخلوط ببطء أثناء تراجعه نصيحة ميكرولوادير (الشكل 3). تجنب تصيد فقاعات الهواء داخل.
5. إرفاق الإبرة لصاحب ميكروبيبيتي وضمان اتصال ضيق ثم إرفاق الحائز ميكرومانيبولاتور. ضمان حرية حركة مستقرة. تطبيق الضغط على microinjection بفتح اسطوانة النيتروجين وضبط منظم الضغط.
   ملاحظة: حجم الحقن يمكن أن تتأثر الضغط، وقطر فتحه الإبرة، ومدة الحقن. لتحديد حجم لحقن, حقن قطره الزيوت المعدنية على هيموسيتوميتير. إذا لزم الأمر، يمكن تعديلها الضغط، ومدة الحقن، والإبر القطر لزيادة أو إنقاص حجم الحقن. حقن عدة مرات في الزيوت المعدنية لضمان حجم متسقة.

5-microinjection أجنة سمك السلور

1. تطبيق طبقة رقيقة جداً من الخضروات تقصير إلى طبق بتري نظيفة 100 مم.
2. استخدام تسمية معمل بلاستيك مدهون، نقل البيض 50 – 100 من عموم الإخصاب إلى طبق بتري وغطاء لهم مع الحل هولتفريتير (جدول المواد). قم بمحاذاة البيض ضد بعضها البعض في طبقة واحدة. وينبغي عقد هذه المحاذاة البيض في مكان أثناء عملية microinjection.
3. ضع طبق بيتري مع البيض في مرحلة المجهر وأنه عقد مع جهة واحدة. أقل الإبرة باليد الأخرى (الشكل 3) حتى أنه يثقب المشيمة وصفار البيض في حركة واحدة سلسة. ينبغي أن يكون غيض الإبرة أقرب ما يكون إلى بلاستوديسك قبل تسليم مواد الحقن.
   1. خفض دواسة لتسليم مواد الحقن إلى الصفار. إذا لم يكن بلاستوديسك واضحة للعيان، ثم يمكن أن تنتشر بحقن المواد في مواقع مختلفة في صفار البيض. للقيام بذلك، يتم إدخال الإبرة في نهاية بكثير من صفار البيض، ثم تتم كئيبة على دواسة وسحب الإبرة في نفس الوقت لنشر مواد الحقن من خلال مجالات مختلفة من صفار البيض. ما يصل إلى 50 نانوليتيرس يمكن يكون حقن صفار البيض لسمك السلور قناة الأجنة، ومع ذلك، كمية البروتين جرنا/Cas9 بحاجة إلى أن يكون الأمثل لكل الجينات لتحقيق أفضل النتائج للطفرة الجنين ومعدل البقاء على قيد الحياة³².
4. سحب الإبرة بشكل سلس حتى لا يؤدي إلى الأضرار البيض. تحريك الطبق بيتري لحقن البيض آخر بنفس الإجراء. تجنب حركة طبق بتري أثناء عملية الحقن كهذه قد تلحق الضرر البيض أو كسر الإبرة. إزالة البيض التي تمزق أو تلف بسبب microinjection. الحقن يمكن أن تبدأ في 15-20 دقيقة بعد الإخصاب ويستمر طالما الأجنة لا تزال في مرحلة خلية واحدة (حتى حوالي 60-90 دقيقة بعد الإخصاب).
5. مكان حقن الأجنة مرة أخرى في الحل في هولتفريتير مع 10 أجزاء من المليون من الدوكسي وتهوية لطيف مستمر لمدة 6-7 أيام حتى الفقس⁴⁰. تغيير الحل يوميا وإزالة أجنة ميتة.

6. الكشف عن الطفرة

1. عشوائياً، جمع عدة أجنة حقن في ح 72 وظيفة الإخصاب، وإزالة الصفار واستخراج الحمض النووي. وتشمل 3-5 غير حقن الأجنة كعنصر تحكم.
   ملاحظة: يمكن استخراج الحمض النووي من الأجنة بعد إزالة قشرة البيض والمواد صفار البيض باستخدام الهضم بروتيناز ك و هطول الأمطار الإيثانول³².
2. تضخيم قطعة الحمض النووي الجينوم أهداف جرنة من كل الجينات، حيث من المتوقع أن تحدث، باستخدام دقة العالية من [تق] [بولمرس]³²الطفرات المرافقة. تيكام 1، كبسولة تفجير 5 'جكتجكتجاتجتكتجاتاتج 3' (إلى الأمام) و 5 'جتككتككاكاكتككتجاج 3' (عكس) استخدمت لتضخيم 750 bp بينما بالنسبة ربل، كبسولة تفجير تكاتاتتككتجتاكتكاجتا 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'أجاجاتاجتكاكاكاتكاتات 3' (عكس) كانت تستخدم ل تضخيم قطعة bp 375 من الجينات ربل.
   1. استخدام تفاعل PCR التالية: تصل إلى 20 ميليلتر بكر الصف المياه؛ مزيج 1 x عالي الدقة العازلة رد فعل إنزيم بوليميراز مع مجكل₂، دنتب 0.2 مم، 0.4 ميكرون لكل من التمهيدي إلى الأمام وعكس نفس المجموعة، 100-300 نانوغرام الحمض النووي ووحدات 1.25 من مزيج إنزيم بوليميراز عالية الدقة. تنفيذ شروط ركوب PCR: تمسخ الأولى في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 35 من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، الصلب في 60 درجة مئوية مقابل 55 s تيكام، و 40 s ربل، ملحق في 72 درجة مئوية لدقيقة 1/كيلو بايت؛ والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
3. الكشف عن الأجنة متحولة باستخدام أسلوب الكشف عن الطفرات مثل تسلسل المنقي PCR المنتجات، مساح الطفرة الكشف والرزن، هيتيرودوبليكس التنقل المقايسة، فقدان إنزيم تقييد الاعتراف بالموقع، أو أي أسلوب الكشف عن الطفرات الأخرى مناسباً من أجل الهدف. في هذا البروتوكول، والكشف عن الأجنة متحولة باستخدام مقايسة الكشف عن الطفرات مساح 1 تيكام وفقدان إنزيم التقييد SapI قطع الموقع، فضلا عن تسلسل من منتجات بكر المنقي للجينات ربل.
4. تحديد الآليلات متحولة، استنساخ متجهات تسلسل من مستعمرات فردية ومنتجات PCR. جاء الآليلات متحولة المعروضة في الشكل 4 ، و الرقم 6 من حقن الأجنة. منتجات PCR من ستة ميكروينجيكتيد وتم تجميع التحكم 3 أجنة لكل الجينات في أنبوبين منفصلين، أحدهما للأجنة ميكروينجيكتيد وأخرى لمراقبة الأجنة، سرعة المستنسخة وناقلات 86 1 تيكام ومتجهات 48 للجينات ربل متسلسلة، بما في ذلك 8 تسلسل ردود فعل من الأجنة غير حقن مراقبة 3 لكل الجينات.
5. لتحديد مختلف الآليلات متحولة، مقارنة في التسلسل من الأجنة متحولة إلى تسلسل نوع البرية باستخدام أي أداة المحاذاة تسلسل الحمض النووي مثل الانفجار أو تي-البن.

النتائج

لإثبات فعالية البروتوكول microinjection، كانت ميكروينجيكتيد جرناس مصممة لاستهداف قناة سمك السلور مستقبلات عدد القتلى/انترلوكين 1 التي تحتوي على المجال محول جزيء (TICAM1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات.

تيكام 1
تسلسل الحمض النوو?...

Discussion

وقدم بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة لتحقيق الضربة القاضية الجينات. الحقن بالبروتين كريسبر/Cas9 في صفار البيض هي أبسط بكثير ويوفر الوقت ولا تتطلب تدريبا مكثفا بالمقارنة مع ميكروينجيكتينج بلاستوديسك الجنين خلية واحدة، وهي تقنية شائعة لمعظم نقل الجينات والجينات التحرير مع الأس...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reproboost implant	Center of Marine Biotechnology		Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	0.5%, sterile filtered
Stereo microscope	Olympus	213709	For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MPPI-3	For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MM33	For holding and controlling the movement of the injection needle.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 720	For pulling microinjection needles
Cas9 protein	PNA Bio Inc.	CP01	Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System	Roche Diagnostics, USA		For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries	Fisher Scientific		1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish	VWR	25384-302	For holding the embryos during the microinjection.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.
Holtfreter`s solution	Home Made		59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)	Letco Medical	690904	Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.