Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Resumen

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Resumen

Se ha secuenciado el genoma completo del bagre de canal, Ictalurus punctatus, conduciendo a mayores oportunidades para estudiar la función genética de bagre de canal. Golpe de gracia del gene se ha utilizado para el estudio de estos genes funciones en vivo. El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) el sistema es una potente herramienta para editar secuencias genómicas de ADN para alterar la función génica. Mientras que el enfoque tradicional ha sido introducir CRISPR/Cas9 mRNA en los embriones de la célula a través de microinyección, esto puede ser un proceso lento e ineficiente en el bagre. Aquí, se describe un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal con CRISPR/Cas9 proteína. Brevemente, óvulos y espermatozoides fueron recogida y luego artificial fertilización realizada. Los huevos fertilizados se transfirieron a una placa de Petri que contenga solución de Holtfreter. Volumen de inyección fue calibrado y luego guía RNAs/Cas9 dirigido a los toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM 1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene fueron microinyectados en la yema de los embriones de una célula. El golpe de gracia del gene era acertado como indels fueron confirmados por secuenciación del ADN. Las alteraciones de la secuencia de la proteína prevista debido a estas mutaciones incluyen mutágeno ' frameshift ' y truncarán de la proteína debido a codones de parada prematura.

Introducción

Microinyección es una técnica de laboratorio común utilizada para entregar una pequeña cantidad de una sustancia tales como DNA, RNA, proteínas y otras macromoléculas en células o embriones a través de un capilar de vidrio¹. Microinyección se realiza mediante la instalación de equipos especiales incluyendo un microinyector, instrumental quirúrgico y un microscopio². La técnica se ha utilizado por los investigadores para modificar genéticamente muchos organismos a través de la generación de transgénicos, knockouts de genes y terapia genética, con el objetivo de comprender la dinámica de componentes intracelulares^{3,4 , 5}.

El bagre de canal (Ictalurus punctatus) es la especie más popular del bagre en la acuicultura y las actividades de pesca recreativa en los Estados Unidos. Hay una creciente necesidad de estudio de genómica funcional en bagre de canal, y la secuencia del genoma completo de bagre de canal aumenta la utilidad de los recientes avances en genoma edición herramientas^6,7. Comprender la función del gen no sólo enriquecería la investigación que se lleva a cabo en el bagre, pero también podría conducir a programas de mejoramiento genético más efectivos para mejorar la industria del bagre. Una vez que se identifican genes críticos para un determinado rasgo de interés, pueden ser utilizados para mejorar genéticamente la producción de bagre a través de la edición del genoma para generar alelos beneficiosos, selección de estos alelos, suprimiendo los alelos perjudiciales, transferencia de los alelos beneficiosos a través de la transgénesis, o alguna combinación de estas opciones. Combinar los mejores genes para diferentes características comercialmente beneficiosos de diferentes especies de una peces mejoraría grandemente la productividad y rentabilidad de las operaciones de producción de pescado⁸.

Knockout de genes es un método directo para el estudio de las funciones del gene in vivo. Mutaciones a nivel de ADN serán heredadas por las generaciones futuras que facilitarán el estudio de sus efectos en diferentes generaciones. Herramientas de edición diferentes del genoma han sido desarrollados incluyendo zinc finger nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas activador como efectoras (TALENs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones/CRISPR-proteína asociada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema^9,10,11,12.

El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta potente y eficaz que se ha utilizado para editar secuencias genómicas de ADN incluyendo knockout de genes de peces a través de RNA-dirigida específica escote de DNA^5,13. El sistema consta de un RNA de la guía (gRNA), que determina la secuencia específica en el genoma y una enzima endonucleasa de ADN, Cas9. El sistema CRISPR/Cas9 puede diseñarse para cualquier secuencia en el genoma con varias ventajas sobre ZFNs y TALENs de destino: (1) menor costo de ingeniería (2) más fácil Unión (3) más específica de RNA guía de la secuencia Diana y reducido objetivo mutaciones (4) secuencias múltiples pueden ser dirigidas con gRNA diferentes en la misma proporción de tiempo (5) alta mutagénesis en los genes que podrían no ser transformado por TALENs y (6) tasa de transmisión mejorada del germline de mutaciones para hasta doblez 6 comparado con ZFNs y TALENs^{14, 15,16,17,18}.

El principal método alternativo para la microinyección es electroporación, en el cual se aplican impulsos eléctricos a embriones o células para aumentar la permeabilidad de la membrana y la absorción de moléculas biológicas^19,20. Varios peces transgénicos se generaron usando electroporación como medaka (Oryzias latipes), pez cebra (Danio rerio), salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre, dorada (Sparus sarba), y común carpa (Cyprinus carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

La electroporación se ha utilizado para ofrecer proteína de DNA, RNA y Cas9 de plásmido por golpe de gracia del gene. En células de mamífero, Cas9/gRNA plásmido ADN Cas9 mRNA/gRNA y complejos de la proteína/gRNA Cas9 fueron entregados mediante electroporación y las tarifas de mutagénesis fueron mayores con complejos de proteínas/gRNA Cas9 para más electroporación condiciones probadas²⁷. En el cordado de la coloración (Savignyi intestinalis), TALENs expresar construcciones fueron electroporated en los huevos fertilizados para inducir knockout de genes múltiples²⁸. ZFNs expresando plásmido construcciones fueron electroporated para noquear a la hormona luteinizante en el bagre de canal²⁹. Sin embargo, una vez introducidos en la célula, plásmido construcciones deberá ser transcrito a RNA y traducido a proteínas funcionales antes de que puede apuntar la secuencia de ADN deseada, que probablemente retrasaría el momento de la mutagénesis en comparación con microinyección del ARN / proteína. Como el desarrollo de un embrión, mutagénesis tardía aumenta el mosaicism de fundadores inyectados. Además, la expresión transgénica es poco probable alcanzar el nivel de expresión posible con microinyección, bajando la eficiencia de mutagénesis.

Como un medio para introducir herramientas de edición del genoma en las células, microinyección tiene varias ventajas sobre electroporación. Moléculas de edición genómica puede introducirse confiablemente en células o embriones mediante microinyección³⁰. Se necesita menos material de inyección. Es fácil determinar las cantidades de material inyectado. Mayor mutación tarifas con mosaicism bajo en los peces del fundador pueden ser alcanzado que mejoraría del germline transmisión de mutaciones a F₁. Menos peces fundador deben ser analizados para producir la primera generación, debido a la mayor tasa de mutación. En electroporación, peces fundador deben analizarse que aumentarán los costos. Sin embargo, la supervivencia de los embriones microinyectados de bagre de canal es menor que electroporated que, aunque esto se puede solucionar mediante la inyección de más embriones^31,32. En bagre de canal, la supervivencia de los embriones microinyectados yema osciló entre 16 y 55%, dependiendo de los genes blanco y la dosis de proteína de gRNA/Cas9³².

Regular microinyección de embriones de bagre es técnicamente exigente y mucho tiempo, sin embargo, un rápido y eficaz protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 proteína se presenta para embriones de bagre de canal. Este protocolo requiere menos tiempo y experiencia ya que la solución de proteína CRISPR/Cas9 se inyecta en la yema de uno de embriones de células. Cientos de huevos fecundados se pueden inyectar en 1 h (aproximadamente el tiempo necesario para que la primera división celular que se produzca). Para validar el protocolo, dos genes relacionados con la susceptibilidad de la enfermedad fueron eliminados en bagre de canal, toll/interleukin 1 gene del receptor del dominio-que contienen adaptador molécula (TICAM1) y el gene de lectinas (RBL) obligatorio de ramnosa. TICAM 1 participa en la vía de señalización iniciada por el receptor de tipo toll (TLR) 3. En bagre de canal, TICAM 1 fue significativamente upregulated después del desafío bacteriano con Edwardsiella ictaluri, mientras que fue regulada en bagre azul, una especie resistente E. ictaluri³³. RBL desempeña un papel importante en la infección temprana con Flavobacterium columnare, el agente causativo de la enfermedad columnaris, donde aguda y robusta upregulation se registró en una cepa susceptible columnaris bagre de canal en comparación con un cepa resistente columnaris³⁴.

Protocolo

Este experimento se llevó a cabo en la unidad de investigación de genética de peces, centro de investigación de pesquerías de E. W. Shell, Universidad de Auburn, Alabama. Todos los protocolos experimentales utilizados en este experimento fueron aprobados por la Universidad de Auburn institucional Animal Care y Comité uso (IACUC-AU) antes de inicia el experimento. Una lista de la maquinaria y equipo utilizado en este experimento puede encontrarse en la tabla de materiales. Los siguientes son los pasos y procedimientos para la preparación y microinyección de embriones de una célula de bagre de canal como se ilustra en la figura 1.

1. selección de acciones y desove de reproductores

1. Elegir sano bagre cría de la cepa o línea genética de interés. Hembras y machos de bagre de canal deben exhibir buenas características secundarias del sexo.
2. Seleccionar los machos que tienen una amplia cabeza muscular que es más ancha que el resto de sus cuerpos con la papila genital bien desarrollada. Color oscuro, cicatrices y heridas de lucha territorial son también signos de preparación sexual. Seleccionar las hembras que tienen jefes que son más estrechos que el resto de sus cuerpos y tienen abdomen suave, palpable, bien redondeado. Para la precisión y evitar destacando los peces durante el manejo inicial, pare el alimentar a las hembras 2-3 días antes de examinar su preparación para el desove.
3. Realizar manejo rápidamente pero con cuidado de peces. Para reducir el estrés de manejo, realizar todos los procedimientos que requieren manejo de hembras manteniendo peces en bolsas (32 m m tamaño de malla) de desove.
4. Justo antes de la inyección de hormonas para inducir la ovulación, medir el peso corporal de las hembras.
5. Colgar las bolsas de desove con las mujeres dentro de un flujo a través del tanque con el flujo de agua continuo y suficiente aireación.
6. Asépticamente, carga al implantador que tiene una aguja 14 G con 85 μg/kg de implante de (LHRHa) análogo de la hormona de liberación de la hormona luteinizante. Enjuagar el sitio de inyección (musculatura dorsal) con solución salina estéril 0,9% antes de la inyección. Inserte al implantador en un ángulo de 45° y liberar el implante. Retirar la aguja y pasar el sitio de inyección con una bola de algodón previamente empapada en etanol al 70%.
7. Lugar la bolsa de desove en el depósito para que el pescado esté totalmente sumergido en agua 15-20 cm por debajo de la superficie del agua. Adecuada aireación (sobre 5 ppm disuelto oxígeno) y buena calidad del agua son importantes para la ovulación de los huevos de alta calidad.
8. Predecir el momento de la ovulación basado en la temperatura del agua mediante la relación de grados-hora (h)³⁵. Tiempo de respuesta de grado h = tiempo entre la inyección de hormonas y la ovulación (h) * temperatura (° C) del agua. Por ejemplo, para un tiempo de respuesta de h grado de 900-1000, una mujer espera a desovar a las 36-40 h de tiempo de la inyección de la hormona a 25 ° C. Generalmente, el primer cheque de huevos se realiza en aproximadamente 36 h después de la inyección de hormona y luego en intervalos de 4 h.
9. Para verificar la ovulación, levante suavemente la bolsa reproductora por encima de la superficie del agua mientras que usted está buscando los huevos que se fijan dentro de la bolsa de desove. Ver al menos 10 huevos indica que esta mujer está ovulando y lista para pelar de la mano.

2. preparación del esperma

Nota: Espermatozoides se pueden preparar unos h antes de la ovulación esperada.

1. Eutanasia a los machos por un percusión golpe en la cabeza sin anestesia, ya que la anestesia tenga un efecto negativo sobre la motilidad del esperma.
2. Recoger los testículos en un platillo pequeño, quitar cualquier tejido y lavar con 50 mL de solución salina 0.9% para eliminar sangre, si es necesario. Testículos bien desarrollados son de color blancos con muchas proyecciones viliformes ( figura 2).
3. Determinar el peso de los testículos.
4. Para preparar la solución de esperma para la fertilización del huevo, transferir los testículos al centro de una malla de 100 cm² 100 μm usando fórceps. Doblar la malla con los testículos dentro, aplastar los testículos y los espermatozoides del filtro en un tubo de recogida de 50 mL. Esto puede hacerse aplicando presión a los testículos dentro de la malla contra el borde del tubo de colección mediante el pulgar. Usar solución salina 0.9% lavar los espermatozoides de la malla en el tubo de la colección. Solución salina se puede Agregar hasta 10 mL/g de los testículos.
5. Determinar la concentración de los espermatozoides, comprobar la motilidad y viabilidad.
   Nota: La concentración se puede determinar contando los espermatozoides en un volumen conocido de diluido de semen usando un hemocitómetro. Por otra parte, la densidad de esperma puede estimarse mediante la evaluación de la densidad óptica de semen usando un espectrofotómetro. En este método, la absorción en la longitud de onda de 505 nm es comparada con un gráfico de control que ha sido previamente preparado para la absorción de diferentes concentraciones de espermatozoides³⁶. La motilidad del esperma se puede comprobar al microscopio como el tiempo de activación de los espermatozoides hasta el cese de esperma movimiento (llamado duración de motilidad)³⁷. La viabilidad de los espermatozoides puede determinarse por la coloración de la esperma con tintes selectivos como el trypan azul, que se mancha espermatozoides no viables solamente, mientras que esperma viable seguirá siendo sin mancha. Sin embargo, para estos procedimientos de microinyección, esto no es necesario si los testículos están bien desarrollados.
6. Almacenar esperma en solución salina al 0.9% de paso 2.5 a 4 ° C y usar dentro de 24 h después de la preparación.

3. recolección y fertilización del huevo

1. Aplicar una capa muy fina de manteca a un diámetro de 20 cm limpio y seco desove pan vegetal.
2. Lugar de la mujer en la solución anestésica que contiene 100 ppm de sulfonato de metano tricaine tamponada con bicarbonato de sodio (pH de la solución final debe ser 7.0) hasta que el pescado esté totalmente anestesiado³⁸.
   PRECAUCIÓN: Metanosulfonato sulfonato de metano puede ser irritante si se inhala, ingiere o absorbe a través de la piel.
3. Con cuidado, quitar los peces de la bolsa de desove y sumergirla en solución salina 0.9% lavar fuera de la solución anestésica. Seque el pescado completamente con una toalla limpia, evitando la remoción de la capa de moco en la superficie del cuerpo del pescado.
4. Aplique grasa vegetal en el área alrededor de la rejilla de ventilación, incluyendo las aletas pélvicas, para evitar la fijación de los huevos durante el desmontaje de la mano.
5. Mano tira de los huevos en el desove engrasado aplicando presión suave en los ovarios. Buenos huevos deben fluir libremente, color amarillo dorado y tiene mínimo o ningún grumos o coágulos de sangre (figura 2). Evite el contacto entre huevos y el agua antes de la fertilización, como el agua puede estimular el cierre del micrópilo.
6. Para fertilizar los huevos para microinyección, transferencia de 200-300 huevos a un desove enmantecado. Etiquetas de plástico engrasado de la planta pueden utilizarse como una cuchara para transferir huevos en el desove enmantecado. Añadir 1-2 mL de la solución de esperma (del paso 2.5) a los huevos y mezclar suavemente. La proporción de los espermatozoides hacia el huevo debe ser aproximadamente 11.000 de la esperma/del huevo.
7. Añadir agua a los huevos para activar el esperma y los huevos. Añada suficiente agua para cubrir un poco los huevos. Agitar suavemente los huevos para 30 s. fertilización debe ocurrir en 1 a 2 min. Es importante fertilizar los huevos que están dispuestos en una sola capa. Huevos de bagre se adhieren entre sí dificultando la microinject varias capas de embriones.
8. Añadir más agua dulce a los huevos fecundados y los huevos a endurecer durante 10 – 15 minutos.
9. Cubrir la bandeja de desove que contiene los huevos no fertilizados por una toalla mojada para evitar que se sequen y fertilizar durante unas horas. La fertilización puede hacerse de manera escalonada, por ejemplo, un lote de 200-300 huevos pueden ser fecundados cada 30 – 60 min para asegurar un suministro continuo de embriones en la etapa de una célula para microinyección y control no embriones. Evitar el contacto entre la toalla mojada y los huevos, los huevos pueden adherirse a la toalla mojada lo que hace difícil quitarlos. En este protocolo, óvulos fecundados dentro de 2-3 h después de decapar eficientemente fueron microinyectados y tenía éxito similar como huevos fertilizados inmediatamente después de la extracción.

4. aguja de tracción y de carga

1. Tirar un vidrio de borosilicato de 1,0 mm OD capilar en 2 agujas (figura 3). Almacenar las agujas en una caja de papel con un trozo de esponja en el cual se hicieron varias incisiones. Para evitar romper la aguja, el diámetro de la esponja debe ser menor que la longitud del vástago de la aguja.
2. Rompiendo un pedazo pequeño de la región más fina de la aguja utilizando un objeto punzante para abrir la punta de la aguja. Alternativamente, abra la aguja pellizcando fuera de la región más delgada de la punta con pinzas bajo el microscopio.
3. Preparar la solución de la inyección mediante la mezcla de gRNA(s) con la proteína Cas9. Otros tipos de ARN o proteína también pueden ser inyectados con el mismo procedimiento. En este protocolo, gRNAs fueron diseñados para actuar dos del bagre el inmunes genes relacionados, toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene y preparados según Shah et al. con el uso de una alta fidelidad Taq polimerasa^32,39. Los objetivos de la genómicos para gRNAs eran 5' GGA GGT GAA GCA GGA de CGA CGT 3' gen TICAM 1 (figura 4) y GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' 5' para el exón 1 del gen RBL con protospacer motivo adyacente (PAM) de la secuencia subrayada (figura 6).
   1. Objetivos guía RNA de ráfaga contra el genoma de bagre de canal en secuencia y seleccionar aquellos con no potenciales sitios de fuera de objetivo.
   2. Agregar rojo de fenol al color de la proteína de gRNA/Cas9 mezclar un tercio del volumen total.
   3. Ajustar la concentración final de proteína de gRNA/Cas9 mezcla con agua libre de nucleasa para que cada embrión se inyecta con 50 nL con gRNA ng aproximadamente 2,5 y 7,5 ng Cas9 proteína. Incubar la mezcla por 10 min en hielo antes de usarlo.
4. Con un microloader, carga 5-10 μl de la mezcla de gRNA/Cas9 en la aguja de inyección insertando la microloader en el vástago de la aguja y expulsar la mezcla lentamente mientras retrae la punta de microloader (figura 3). Evite atrapar burbujas de aire dentro.
5. Conecte la aguja en el soporte de Micropipetas y asegurar una conexión firme y luego fije el soporte a las amalgamas dentales. Garantizar la libre circulación estable. Aplique presión para microinyección abriendo el cilindro de nitrógeno y ajustar el regulador de presión.
   Nota: El volumen de inyección puede verse afectado por la presión, el diámetro de la abertura de la aguja y la duración de la inyección. Para determinar el volumen a inyectar, inyectar una gota de aceite mineral a un hemocitómetro. Si es necesario, puede ajustarse la presión, la duración de la inyección y el diámetro de la aguja para aumentar o disminuir el volumen de la inyección. Inyectar varias veces el aceite mineral para volumen constante.

5. microinyección de embriones de bagre

1. Aplicar una capa muy fina de manteca a un plato de Petri limpia 100 mm vegetal.
2. Usando una etiqueta de plástico engrasado de la planta, transferencia de 50-100 huevos de la sartén de la fertilización a la caja Petri y cúbralos con la solución de Holtfreter (tabla de materiales). Alinee los huevos uno contra otro en una sola capa. Esta alineación debe mantener los huevos en su lugar durante el proceso de microinyección.
3. Coloque la placa de Petri con los huevos sobre la platina del microscopio y sosténgala con una mano. Baje la aguja con la otra mano (figura 3) hasta que perfora el corión y la yema en un único movimiento suave. La punta de la aguja debe ser lo más cerca posible al blastodisc antes de entregar el material de inyección.
   1. Presione el pedal para entregar el material de inyección en la yema de huevo. Si el blastodisc no es claramente visible, el material de inyección puede transmitirse en diferentes lugares de la yema. Para ello, se inserta la aguja hasta el final de la yema, y luego presionando el pedal y retirar la aguja se realizan simultáneamente para difundir el material de inyección a través de diferentes áreas de la yema. Hasta 50 nanolitros se puede inyectar en la yema de bagre de canal embriones, sin embargo, la cantidad de proteína de gRNA/Cas9 debe optimizarse para que cada gen lograr los mejores resultados para mutación tasa y embrión de supervivencia³².
4. Retraer la aguja suavemente para no dañar el huevo. Mueva la caja Petri para inyectar otro huevo con el mismo procedimiento. Evitar el movimiento de la caja Petri durante el proceso de inyección ya que puede dañar el huevo o romper la aguja. Retirar los huevos que están roto o dañados debido a la microinyección. La inyección puede iniciarse a los 15-20 min después de la fertilización y continuar siempre y cuando los embriones están todavía en la etapa de una célula (hasta unos 60-90 min después de la fertilización).
5. Coloque los embriones inyectados en solución de Holtfreter con 10 ppm de doxiciclina y continua aireación suave para 6 – 7 días hasta la eclosión de⁴⁰. Cambiar la solución diariamente y eliminar embriones muertos.

6. mutación detección

1. Al azar, recoger varios embriones inyectados en la fertilización post de 72 h, quitar la yema de huevo y extracto de ADN genómico. Son embriones de 3 – 5 no como control.
   Nota: El ADN genómico puede extraerse de embriones después del retiro de cáscaras de huevo y yema de huevo el material con digestión proteinasa K y etanol precipitación³².
2. Amplifican un segmento de ADN que flanquean los objetivos genómicos para el gRNA de cada gen, donde se espera que las mutaciones ocurren con una alta fidelidad de la polimerasa de Taq³². Para TICAM 1, los cebadores 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (adelante) y 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (atrás) fueron utilizados para amplificar un 750 bp mientras que para RBL, los cebadores 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (adelante) y 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (atrás) se utiliza para amplificar un segmento 375 de bp del gen RBL.
   1. Utilice la siguiente reacción de PCR: hasta 20 μl de agua de grado de polimerización en cadena; 1 x alta fidelidad tampón de reacción de enzima Taq con MgCl₂, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 μm de cada uno de la cartilla de adelante y atrás del mismo grupo, 100-300 ng de ADN genómico y 1,25 unidades de mezcla de enzimas Taq de alta fidelidad. Realizar ciclismo condiciones PCR: desnaturalización inicial a 94 ° C por 3 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C por 30 s, recocido a 60 ° C por 55 s para TICAM y 40 s de RBL, extensión a 72 ° C por 1 min/kb; y extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.
3. Detectar los embriones mutantes utilizando un método de detección de mutación como secuenciación de productos PCR purificados, ensayo de detección de mutación de topógrafo, análisis de movilidad del heterodúplex, pérdida del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción, o cualquier otro método de detección de mutación que es apropiado para el objetivo. En este protocolo, detectar embriones mutantes mediante el ensayo de detección de mutación de topógrafo para TICAM 1 y pérdida de enzima de restricción que SAPI cortar sitio así como la secuenciación de productos PCR purificados para el gen RBL.
4. Para identificar alelos del mutante, clonar los productos PCR y secuencia vectores de colonias individuales. Los alelos del mutante presentados en la figura 4 y figura 6 vinieron de embriones inyectados. Productos PCR de seis microinyectados y embriones control 3 para cada gen se agruparon en dos tubos separados, uno de los embriones microinyectados y el otro para embriones control, rápidamente clonados y 86 vectores TICAM 1 y 48 vectores de gen RBL secuenciados, incluyendo 8 secuencia de reacciones de 3 embriones no de control para cada gen.
5. Para identificar diferentes alelos del mutante, comparar las secuencias de los embriones mutantes para la secuencia de tipo salvaje usando cualquier herramienta de alineación de secuencia de DNA como ráfaga o T-café.

Resultados

Para demostrar la eficacia del Protocolo de microinyección, fueron microinyectados gRNAs diseñados para atacar el bagre de canal toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene.

TICAM 1
Secuencia de la DNA de vectores de las colonias individuales de productos PCR combinados, clonados revelaron las mutaciones indel inducida...

Discusión

Se presentó un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal para lograr el golpe de gracia del gene. Inyección de proteína CRISPR/Cas9 en la yema de huevo es mucho más sencilla, ahorra tiempo y no requiere formación amplia en comparación con microinjecting el blastodisc del embrión de una célula, que es la técnica común para la mayoría de la transferencia de genes y gene edición con pescado ^{30 , 42}. el protocolo actual demos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reproboost implant	Center of Marine Biotechnology		Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	0.5%, sterile filtered
Stereo microscope	Olympus	213709	For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MPPI-3	For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MM33	For holding and controlling the movement of the injection needle.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 720	For pulling microinjection needles
Cas9 protein	PNA Bio Inc.	CP01	Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System	Roche Diagnostics, USA		For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries	Fisher Scientific		1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish	VWR	25384-302	For holding the embryos during the microinjection.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.
Holtfreter`s solution	Home Made		59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)	Letco Medical	690904	Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.