تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) الحمض النووي من الخلايا المصابة لتحديد المرتبطة الفيروسية والبروتينات الخلوية بالكتلة قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن البروتينات التي تتفاعل مع الجينوم الفيروسي تضطلع بأدوار رئيسية في تحديد نتيجة العدوى، تحليلاً شاملا للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة لم يكن ممكناً سابقا. هنا نظهر أسلوب يتيح لتنقية مباشرة من هامبورغ-1 مورثات من الخلايا المصابة. تكرار الحمض النووي الفيروسي هو المسمى بشكل انتقائي مع تعديل النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعة وظيفية ألكاين. الحمض النووي المسمى هو ثم على وجه التحديد ولا رجعة فيه معلم عن طريق إلحاق التساهمية أزيد البيوتين عن طريق لنحاس (I)-حفز أزيد-ألكاين سيكلواديتيون أو انقر فوق رد. هو تنقية الحمض النووي معلم البيوتين في الخرز المغلفة ستريبتافيدين والبروتينات المرتبطة التيد وحددها الكتلي. يتيح هذا الأسلوب بالاستهداف الانتقائي والعزلة من هامبورغ-1 النسخ المتماثل شوك أو الجينوم كله من البيئات البيولوجية المعقدة. وعلاوة على ذلك، سوف تسمح التكيف مع هذا النهج للتحقيق في الجوانب المختلفة للإصابة هيربيسفيرال، فضلا عن فحص مورثات فيروسات الحمض النووي الأخرى.

Introduction

فيروسات لديها قدرة محدودة على الاضطلاع بالمهام الأساسية، وذلك يعتمد على عوامل المضيف لتسهيل الجوانب الحرجة للإصابة بما في ذلك التعبير المورثات الفيروسية والنسخ المتماثل، إصلاح، وممارسو والنقل. وكثيراً ما تزاد أنشطة هذه العوامل المضيفة بالبروتينات المرمزة فيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تجنب الفيروسات الكشف والتدخل بالاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية. ولذلك، تملي التفاعلات المضيف الفيروس نتيجة الإصابة. من الأهمية بمكان هو فهم كيفية تغير فيروسات البيئة الخلوية تكييف الآلية الخلوية لتسهيل عمليات الفيروسية. أهمية خاصة هو تحديد العوامل والعمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي طوال دورة المعدية.

فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) هو مزدوج تقطعت الحمض النووي الفيروس الذي يصيب نسبة كبيرة من السكان. خلال الساعة الأولى من الإصابة، يدخل الجينوم الفيروسي النواة، حيث تستتبعه تتالي أمر التعبير المورثات الفيروسية في التنسيق مع النسخ المتماثل (فدنا) من الحمض النووي الفيروسي¹. في النواة، جينومات تخضع لضوابط تنظيمية جينية والخضوع لإصلاح واقترانها، ويتم تعبئتها في كابسيدس، حيث يتم إنتاج فيريونس ذرية الأولى خلال أقل من ست ساعات. التقييم الشامل للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة طوال فترة الإصابة سترسي الأساس للتحقيق في تفاصيل العمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي، وسوف توفر نظرة ثاقبة العوامل الفيروسية والخلوية التي الجزيئية يشاركون في مراحل مختلفة من العدوى.

وتشمل الأساليب السابقة لتحقيق العوامل المضيفة المعنية في العدوى الفيروسية تقارب تنقية البروتينات الفيروسية لتحليل البروتينات الخلوية المرتبطة بها^2،3،،من^{45 , 6 , 7 , 8 , 9}-هذه الاختبارات كانت مفيدة للتعرف على العوامل الخلوية التي ينطوي عليها في الردود المضادة للفيروسات المضيفة، فضلا عن تعديل الكروماتين الفيروسية، والتعبير الجيني، وإصلاح الحمض النووي. ومع ذلك، من الصعب التأكد من ما إذا كانت التفاعلات تعتمد على الرابطة مع فدنا، والبروتيوميات فقط توفير نظرة ثاقبة التفاعلات التي تحدث كدالة لعامل فيروسية معينة. وقد استخدمت إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) لتحديد حيث ربط محددة من البروتينات الفيروسية والخلوية للجينوم الفيروسي^10،،من^1112،،من^{1314 , 15} والتهجين في الموقع نيون (الأسماك) جنبا إلى جنب مع إيمونوسيتوتشيميستري وقد مكن تصور العوامل الخلوية التي كولوكاليزي مع^، فدنا^16،،من^{1718 19 , 20}-تتيح هذه الاختبارات للتحليل المكاني والزماني. ومع ذلك، تشمل القيود الحاجة إلى أجسام مضادة محددة للغاية، وحساسية محدودة، والحاجة إلى ثاقبة الفيروس المضيف التفاعلات السابقة. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب يقوم على إيبوند (عزل البروتينات على الحمض النووي الوليدة)²¹ والمصابين أنيبوند (إيبوند الأصلية المعجل)²² للتسمية بشكل انتقائي وتنقية فدنا من الخلايا لتحديد غير منحازة للجينوم الفيروسي البروتينات المرتبطة بالطيف الكتلي. إيبوند كان مفيداً لتحقيق ديناميات شوكة الخلوية النسخ المتماثل.

لتنقية الانتقائي للجينوم الفيروسي من الخلايا المصابة، تكرار فدنا هو المسمى مع اثينيل تعديل نوكليوسدس، 5-اثينيل-2´-ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-اثينيل-2´-ديوكسيسيتيديني (EdC) (الشكل 1)، تليها التساهمية انقر اقتران لأزيد البيوتين عن طريق الكيمياء تيسيرا لتنقية خطوة واحدة من الجينوم الفيروسي والبروتينات المرتبطة بها على الخرز streptavidin المغلفة (الشكل 2). الأهم من ذلك، تنفذ العدوى في الخلايا الثابتة، التي لم تشارك في تكرار الحمض النووي الخلوي لتمكين العلامات المحددة من فدنا. وعلاوة على ذلك، هامبورغ-1 العدوى يؤدي دورة الخلية اعتقال ويحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي^23،24. الفيروسات يمكن بريلابيليد قبل الإصابة للتحليل البروتينات المرتبطة بالجينوم الفيروسية الواردة (الشكل 1A) أو المسمى أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي للتحليل البروتينات المرتبطة بالمركب حديثا فدنا (الشكل 1B) ²⁵-وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التحليل تشيس نبض التحقيق في طبيعة البروتينات المرتبطة بالنسخ المتماثل الفيروسية شوك (الشكل 1)²⁶. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تساهمي مترافق تعديل اثينيل فدنا إلى فلوروفوري للتحقيق المكاني لديناميات البروتين (الشكل 2A و الشكل 3). تصوير يسمح للتصور مباشرة من فدنا وهو نهج مجانية للتحقق التفاعلات فدنا بالبروتين، ويمكن تكييفها لتعقب الجينوم الفيروسي في جميع أنحاء العدوى. ونحن نتوقع أن هذه النهج يمكن تعديله أيضا لدراسة أي جانب من الإصابة هيربيسفيرال، بما في ذلك الكمون وتنشيطها، ودراسة أخرى فيروسات الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، وضع العلامات مع أردين 5-اثينيل (الاتحاد الأوروبي) قد تسمح لتحليل الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي.

Protocol

1-خلية ثقافة والعدوى الفيروسية، ووسم الصادرات ( الشكل 1)

البروتوكول التالي ينطوي على العمل مع الفيروسات. يرجى الرجوع إلى المؤسسة الخاصة بك ' s بروتوكولات السلامة البيولوجية فيما يتعلق بالمناولة الآمنة للفيروسات وغيرها من العناصر البيولوجية. هذا البروتوكول كان أقرها "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة بيتسبرغ.

1. تريبسينيزي المتلاقية 150 سم ² زراعة الأنسجة قارورة من الخلايا لجنة نهر الميكونج-5 ونقل الخلايا إلى ² سم 600 لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 100 مل دميم بالإضافة إلى 10% FBS. احتضان عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO ₂ لمدة 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة كونفلوينسي وثابتة. ويتضمن طبق ² سم 600 المتلاقية ~ 7 × 10 ⁷ الخلايا. إعداد لوحة 1 لكل شرط ولوحة 1 لكل عنصر تحكم السلبية المقابلة.
   ملاحظة: يجب أن تصل إلى الخلايا في المرحلة ثابتة تحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي لضمان أن فدنا الوحيد هو المسمى وتنقيته في الخطوات اللاحقة-
   ملاحظة: كل عينة يتطلب من المجاملة غير مسمى مراقبة سلبية أعدت باستخدام نفس ظروف الإصابة والنقطة الزمنية دون الإضافة لتنمية الصادرات-
   ملاحظة: بتقليص نسخة من هذه التجربة ينبغي أن يتم بالتوازي لاختبار لوسم الحمض الخلوي بالتصوير باستخدام نمو الخلايا القابلة للمقارنة، العدوى، تنمية الصادرات وسم الشروط، والوقت النقاط (راجع الخطوة 2)-
2. تمييع 7 × 10 ⁸ 1 HSV بفو في 7 مل تريسبوفيريد الباردة المالحة (تبس). إزالة النمو المتوسطة وتخزينها في 37 درجة مئوية. لتصيب، إضافة 7 مل الفيروس المخفف للخلايا 5 لجنة نهر الميكونج والصخور ح 1 في درجة حرارة الغرفة. الامتزاز التالي، إزالة العدوى وشطف مع درجة حرارة الغرفة 50 مل TBS واستبدال المتوسطة النمو الأصلي. احتضان عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO ₂. هذه الخطوة ينبغي أن يتم لكل حالة تجريبية والمراقبة السلبية.
   ملاحظة: العلامات زيادة الصادرات يمكن تحقيقه باستخدام HSV 1 طفرات المعيبة للتعبير عن دوتباسي الفيروسية (الجين UL50) و/أو glycosylase اليوراسيل (الجين UL2). هامبورغ-1 دوتباسي خصوصية الركازة منخفضة، ويمكن إنقاص تفعيل عدة ^{25 ،} النظير نوكليوزيد ²⁷-
3. تسمية الجينوم الفيروسي مع تنمية الصادرات. اتبع التوجيهات للتسمية الواردة الجينوم (1.3.1.)، تكرار الجينوم (1.3.2.)، أو النسخ المتماثل الفيروسية شوك (1.3.3.)-
   ملاحظة: الخطوة الوحيدة 1.3.1 أو 1.3.2 1.3.3 ينبغي أن يتم اعتماداً على ما إذا كانت جينومات واردة، جينومات منسوخة أو شوك النسخ المتماثل يتم تحليلها في الخطوات اللاحقة، على التوالي.
   ملاحظة: إيدو أو إيدو ارا و يمكن أن تكون بديلاً لتنمية الصادرات. وينبغي رصد سمية النظير نوكليوزيد والتقليل إلى أدنى حد. بريلابيليد
   1. استخدام الأرصدة الاضطلاع بالعدوى في الخطوة 1.2 والمتابعة إلى الخطوة 2 أو 3 ضمن ح 4 نشر العدوى (hpi) للتحقيق في فدنا unreplicated ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تعد الفيروسات بريلابيليد الأسهم باستخدام البروتوكول هو موضح سابقا ²⁵. يجب أن يتم تمرير مخزونات الفيروس عن طريق عمود G-25 لإزالة أي تنمية الصادرات المتبقية.
   تسمية
   2. فدنا النسخ المتماثل بإضافة 5-25 ميكرومتر تنمية الصادرات إلى مستنبت الخلية من الخلايا المصابة بالنسبة 2-4 ح ( الشكل 1B). قبل إضافة، تضعف المؤسسة في 1 مل متوسط نمو.
   3. إلى تسمية النسخ المتماثل الفيروسية شوك، بعد حدوث النسخ المتماثل فدنا (≥ 4 hpi)، تسمية نبض تكرار فدنا مع 5-25 ميكرومتر تنمية الصادرات لمدة 5-20 دقيقة. لمطاردة، شطف 3 x مع تشيس المتوسطة التي تحتوي على 25-100 ميكرومتر 2´deoxycytidine (ديوكسيك)، واحتضان ثم حضور المتوسطة تشيس لمدة 20-40 إضافية دقيقة ( الشكل 1).
      ملاحظة: يجب أن اكويليبراتيد المتوسطة النبض ومطاردة إلى 37 درجة مئوية و 5% CO ₂ قبل الاستخدام.
      ملاحظة: لإجراء التجارب على مطاردة نبض، من المهم النظر في مقدار الوقت الذي يستغرقه نوكليوسدس لدخول الخلية وتكون فوسفوريلاتيد قبل كان يمكن إدراجها في تكرار الحمض النووي. وهذا يجب أن يحدد تجريبيا.
      ملاحظة: لتحديد دقة نبض التجارب تشيس، حساب معدل النسخ المتماثل الفيروسية الظروف التجريبية المستخدمة. وهذا يمكن تحديده من خلال PCR الكمي للجينوم الفيروسي أثناء خطوة مفردة نمو وقت دورة ²⁶-
      ملاحظة: للتصوير الجينوم الفيروسي المتابعة إلى الخطوة 2 وتطهير الجينوم الفيروسي المضي قدما إلى الخطوة 3-

2. تصوير لتنمية الصادرات المسمى الحمض النووي ( الشكل 2A)

ملاحظة: أنه من المفيد إجراء تصوير بالترادف مع أسلوب تنقية الجينوم الفيروسي للتأكد من أنه لن يتم تسمية الحمض الخلوي في التجارب. يمكن أيضا استخدام التصوير لتصور طبيعة المسمى فدنا، والتحقق من صحة البيانات البروتيوميات. وترد أمثلة للحمض الخلوي الصبغي الخلوي والفيروسية تلطيخ أنماط في الشكل 3-

1. الاضطلاع بالعدوى، ووسم الصادرات كما هو مبين في الخطوة 1 باستثناء استخدام تقليص الشروط في كوفيرسليبس في طبق استنبات الأنسجة 12-جيدا يحتوي على 1 مل متوسط نمو.
بارافورمالدهيد
2. الخلايا الإصلاح مع 1 مل 3.7% في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 15 دقيقة في الرايت بعد التثبيت، خلايا شطف x 2 مع 1 مل 3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني.
   تحذير: يمكن أن يسبب بارافورمالدهيد إصابة خطيرة أو الدائمة. اتباع احتياطات السلامة-
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا ويمكن تخزين كوفيرسليبس في 4 درجات مئوية في الغسيل الثانية لمدة 3 أيام-
3. بيرميبيليزي الخلايا مع 1 مل بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت [انظر الجدول للمواد] لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز.
4. شطف مع 1 مل من جيش صرب البوسنة 3%، ومن ثم كتلة مع 1 مل 3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز.
5. إضافة 1 مل من رد فعل فوق كوكتيل [انظر الجدول للمواد] إلى كوفيرسليبس تساهمي متزاوجة أليكسا فلور 488 المسمى أزيد لتنمية الصادرات الحمض النووي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع هزاز. نضح وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
6. وصمة عار الحمض الخلوي مع 1 مل إضعاف 1:2,000 هويشت في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز. نضح وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
الفلورة غير المباشرة
7. وصمة عار مع الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي وفقا لمعيار البروتوكولات ²⁵-
   ملاحظة: فدنا المسمى كولوكاليزيس مع ICP8 أو ICP4، أو UL42، والمسمى الخلوية كولوكاليزيس الحمض النووي مع وصمة عار هويشت.
8. جبل كوفيرسليبس على الشرائح والصور الخلايا باستخدام مجهر الأسفار.
   ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.

3. تنقية فدنا و "البروتينات المرتبطة"

ملاحظة: عدة جوانب من هذا البروتوكول وقد تم تكييف من يونغ et al. ²²
ملاحظة: ينبغي مبردة كافة المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة على الجليد قبل الاستخدام وجميع الخطوات ينبغي أن تنفذ على الجليد، ما لم يبين خلاف ذلك.

1. حصاد الأنوية.
   ملاحظة: قبل عزلة نوى، يمكن استخدام فورمالدهايد للبروتينات التشعب للحمض النووي. ثم يمكن استخدامها يغسل شروطا أكثر صرامة خلال تنقية الحمض النووي على الخرز المغلفة ستريبتافيدين. للجمهورية التشيكيةراجع شروط أوسلينكينج ويغسل Sirbu et al. ²¹-
   1. استبدال المتوسطة النمو مع 20 مل المخزن المؤقت للاستخراج أنوية (NEB) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مع هزاز عرضية. الأنوية سوف تصبح مرئية في المجهر.
   2. نوى كشط من لوحة باستخدام مكشطة الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 درجات مئوية بيليه النوى، وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: تريبان تلطيخ الأزرق يمكن استخدامها للتحقق من عزل نواة من خلايا-
   3. برفق إزاحة بيليه النووية في برنامج تلفزيوني، نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل، 10 مل وبيليه من سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة برنامج تلفزيوني-
      ملاحظة: يمكن أن تجمد الأنوية والبروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً عند هذه النقطة. للقيام بذلك، ريسوسبيند برفق بيليه النووية في 500 ميليلتر تجميد المخزن المؤقت واحتضان الأنبوب في حمام جليد جاف إيثانول. تخزين نويات المجمدة في-80 درجة مئوية. قبل الاستخدام، إذابة النوى في درجة حرارة الغرفة، ونقل بسرعة إلى الجليد، وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، روك برفق للمزيج، بيليه بالطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 درجات مئوية، وإزالة برنامج تلفزيوني. تجميد الأنوية قد يؤدي انخفاض الغلة.
2. أزيد البيوتين تساهمي المتقارنة لتنمية الصادرات المسمى فدنا-
   1. ريسوسبيند بيليه النووية في 10 مل انقر فوق رد فعل مزيج [انظر الجدول للمواد] بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات مع بيبيت 10 مل.
      ملاحظة: من المهم أن يتم إضافة الكواشف المدرجة في مزيج فوق الرد بالترتيب الموضح.
   2. تدوير ح 1 في 4 درجات مئوية. بينما تناوب إعداد والبرد والمخازن المؤقتة B1، B2، و B3 [انظر الجدول للمواد].
   3. نوى بيليه من سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة انقر فوق خلط رد فعل ويغسل بيليه بلطف ريسوسبيندينج في 10 مل برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° C.
   4. بلطف ريسوسبيند بيليه النووية في 1 مل برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل استخدام تلميح ماصة كبيرة وتتحمل. بيليه الأنوية سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة برنامج تلفزيوني وفلاش التجميد في النيتروجين السائل-
      ملاحظة: يمكن مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة ويمكن تخزين نويات المجمدة في-80 درجة مئوية. تجميد ذوبان الجليد يساعد على تحلل اللاحقة مع ذلك فمن المستحسن أن تكون نواة فلاش مجمدة حتى عند الشروع في "الخطوة 3، 3" في نفس اليوم-
3. النوى، وتجزئة الحمض النووي- ذوبان الجليد الأنوية على الجليد
   1. وريسوسبيند في 500 ميليلتر B1 المخزن المؤقت قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تبني على الجليد ل 45 دقيقة
   2. عينات سنكيت 6 مرات لمدة 30 ثانية كل في السعة 40% باستخدام مسبار ميكروتيب 3 مم. وضع العينات في الثلج لمدة 30 ثانية بين النبضات. بعد سونيكاتيون، يجب أن تظهر عينات واضحة ولا غائم.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل الظروف سونيكاتيون سونيكاتورس الفردية. للحصول على إرشادات مفصلة حول كيفية تحسين ظروف sonication تشير إلى ليونغ et al. ²²-
   3. بيليه الحطام خلية من سينتريفوجينج في 14,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. وينبغي تقليص حجم بيليه. تصفية المادة طافية من خلال 100 ميكرومتر خلية مصفاة والإبقاء التدفق من خلال-
   4. إضافة 500 ميليلتر B2 المخزن المؤقت للمادة طافية المصفاة. 900 ميليلتر من هذه العينة التي ستستخدم في خطوة 3.4.2.
   5. أخذ قاسمة لكل شرط لعزل الحمض النووي (50 ميكروليتر أو حجم 1/20)، وإضافة 50 ميليلتر 2 × حل الحزب الديمقراطي الصربي bicarb [انظر الجدول للمواد]. المضي قدما في البروتوكول عزل الحمض النووي (3.6 خطوة)-
   6. تأخذ قاسمة لكل شرط لإدخال البروتين (50 ميكروليتر أو حجم 1/20) وإضافة 50 ميليلتر 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت، وتجميد في النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة استخدام جيم في خطوة 3.5.6.
4. بيوتينيلاتيد ربط الحمض النووي ل streptavidin المغلفة الخرز.
   1. الخرز إعداد T1 ستريبتافيدين المغناطيسي بنقل 300 ميليلتر من الملاط حبة إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. إعداد أنبوب واحد من الخرز كل عينة. أغسل حبات x 3 مع 1 مل B2 العازلة من فورتيكسينج ريسوسبيند، وتطبيق مغناطيس لفصل الخرز، ويسفط في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-
      ملاحظة: الأمثل ملزمة نتيجة الظروف في الغلة مكبر وخلفية الحد الأدنى الملزم. تبين تجريبيا أن الخرز المغناطيسي Streptavidin T1 لديها قدرة ملزمة أكبر بكثير من الخرز [اغروس]، فضلا عن الخرز ستريبتافيدين الأخرى، وأقل الخلفية ملزمة من الخرز C1 ستريبتافيدين ( الشكل 4A ).
   2. ميليلتر إضافة 900 من عينة من الخطوة 3.3.4. الخرز غسلها وتدوير بين عشية وضحاها في 4 ° C.
      ملاحظة: لا دوامة الخرز حالما تتم إضافة نموذج لهم.
      ملاحظة: إذا كان يتم عزل كميات كبيرة من الحمض النووي أو البروتين في مراقبة سلبية غير مسمى، هذه الخطوة يمكن تقليل من بين عشية وضحاها إلى ح 4 للحد من الربط الخلفية.
5. تغسل الخرز والوت فدنا والبروتينات المرتبطة.
   ملاحظة: من المستحسن استخدام تلميحات التصفية للخطوات المتبقية.
   1. مكان العينات إلى رف أنبوب مغناطيسي [ميكروفوج]، إزالة المادة طافية، ريسوسبيند برفق في 1 مل B2 المخزن المؤقت، استدارة عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
   2. ثلاث مرات تكرار الخطوة 3.5.1.
   3. وضع العينات في رف أنبوب مغناطيسي [ميكروفوج] وإزالة المادة طافية ولطف ريسوسبيند في 1 مل B3 المخزن المؤقت، وتدوير عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
   4. نقل 100 ميليلتر حبة خليط (حجم ^ال 1/10) إلى أنبوب جديد لعزل الحمض النووي منضم. ينطبق هذا الأنبوب بالمغناطيس وإزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخرز في 100 ميليلتر 1 × حل الحزب الديمقراطي الصربي-bicarb والمضي قدما في البروتوكول عزل الحمض النووي (3.6 خطوة)-
   5. تطبيق الأنبوب الذي يحتوي على خليط حبة ميليلتر 900 المتبقية من الخطوة 3.5.3. للمغناطيس، قم بإزالة المادة طافية، وريسوسبيند الخرز في 50 ميليلتر 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت الوت البروتين والحمض النووي-البروتين المجمعات.
   6. عينات يغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ودوامه، تدور في [ميكروفوج] بسرعة وتطبق المغناطيس. نقل النذرة بأنابيب جديدة، وتجميد فلاش، ومخزن في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدام غطاء تأمين لضمان أن لا البوب أنابيب فتح أثناء الغليان.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة، ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع.
   7. تحليل عينات البروتين بالأزرق أخذ تلطيخ النشاف الغربية أو الكتلي بإجراءات قياسية ²⁵. يتم إظهار النتائج الممثلة في الشكل 4 و الشكل 5-
      ملاحظة: لتحديد ما إذا كان العائد بروتين كافية الكتلي، ميليلتر 7.5 لكل عينة من يستخدمها لتحليل الأزرق أخذ تلطيخ والمرتبطة ميليلتر 7.5 النشاف الغربية الجينوم الفيروسي الممثل البروتين (ICP4، ICP8، أو UL42). نفس الحجم من ليساتيس من الخطوة 3.3.6. يتم تشغيل جنبا إلى جنب مع إلى مراقبة مستويات البروتين الإدخال. ثم يتم تحليل العينة المتبقية (35 ميليلتر) بوسائل قياس الطيف الكتلي كما هو موضح سابقا ²⁵-
6. عزل الحمض النووي
   1. احتضان العينات المأخوذة من الخطوات 3.3.5. و 3.5.4. عند 65 درجة مئوية ل 4-16 h. إزالة عينة من الخرز المغناطيسي، إذا لزم الأمر.
   2. استخراج عينات مع 150 ميليلتر الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول (PCI) ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
   3. استخراج PCI المتبقية مع 100 ميليلتر يدتا تريس (TE) وإضافة المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
   4. استخراج عينات مع 200 ميليلتر كلوروفورم: إيسواميل الكحول (24:1).
   5. تنقية المرحلة المائية باستخدام أدوات تنقية PCR وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
      ملاحظة: سوف تتحول مؤشر الرقم الهيدروجيني في المخزن المؤقت PB الأرجواني عندما تضاف إلى العينة. إضافة 10 آند #181؛ ل م 3 نواك pH 5.0 انخفاض الرقم الهيدروجيني للعينة.
   6. تركيز "الحمض النووي تحديد" باستخدام فلوروميتير.
      ملاحظة: هذا البروتوكول عادة ينتج 100-400 نانوغرام حبة زمنياً الحمض النووي. الحمض النووي لا ينبغي الكشف عنها في النذرة التحكم السلبية التي لم يتم إضافة تنمية الصادرات في "الخطوة 1-3"-
   7. الحمض النووي يمكن أن تكون مخزنة في ربط الحمض النووي منخفض الأنبوبة في 4 أو-20 درجة مئوية، ويمكن استخدامها لبكر في الوقت الحقيقي أو تحليل تسلسل إنتاجية عالية.

النتائج

وأنجز استخدام الكيمياء انقر لتنقية الحمض النووي من الخلايا أولاً ب أسلوب إيبوند²¹. وغرض إيبوند لتنقية شوك الخلوية النسخ المتماثل للتعرف على البروتينات المرتبطة بها. أننا قد تكيفت هذه التقنية لدراسة تفاعلات البروتين فدنا على وجه التحديد أثناء الإصابة. التلا?...

Discussion

ويشمل هذا البروتوكول العديد من الخطوات التي، إذا لم تتبع بدقة، يمكن أن يؤدي إنتاج البروتين انخفاضا كبيرا أو تلوث بالحمض الخلوي. من الأهمية بمكان أن يتم استخدام الخلايا ثابتة لجميع التجارب لضمان أن الحمض الخلوي لا المسمى وتنقيته. هذا يمكن تأكيد عدم وجود بولمرس الحمض الخلوي في العينة البرو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock			Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column)	GE Healthcare	17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
Nuclear Extraction Buffer (NEB)			Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper	Bellco glass	7731-22000	Autoclave before use
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide	Invitrogen	B10184	Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year
Click Reaction Mix			Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001	Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
Freezing buffer			Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1			Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2			Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3			Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli sample buffer			Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
Cap locks for 1.5 mL tube	Fisher Scientific	NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
12-well tissue culture dish	Corning	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclave before use
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	Prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
Mouse anti-ICP8 primary antibody	Abcam	ab20194	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)	Abcam	ab19311	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody	Life Technologies	a11005	Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x SDS-bicarb solution			2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol			Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol			Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks			65 °C and 95 °C