טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה הוא לבודד את וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) ה-DNA של תאים נגועים לצורך הזיהוי הקשורים ויראלי החלבונים על ידי מסה ספקטרומטר. למרות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם הגנום הנגיפי משחק תפקידים עיקריים בקביעת התוצאה של זיהום, ניתוח מקיף של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לא היה אפשרי בעבר. כאן נדגים שיטה המאפשרת את טיהור ישירה של HSV-1 הגנום של תאים נגועים. שכפול ה-DNA הנגיפי מסומן באופן סלקטיבי עם נוקלאוטידים ששונה מכילים קבוצה פונקציונלית של אלקין. דנ א שכותרתו אז במיוחד ובלתי הפיך מתויג באמצעות החזקה קוולנטיות של ביוטין אזיד דרך נחושת (I)-מזורז אזיד-אלקין cycloaddition או לחץ על התגובה. מתויג ביוטין DNA מטוהר על חרוזים מצופים streptavidin, חלבונים הקשורים eluted, המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. שיטה זו מאפשרת מיקוד סלקטיבי ובידוד של מזלגות שכפול HSV-1 או כל הגנום של סביבות ביולוגיות מורכבות. יתר על כן, עיבוד של גישה זו יאפשר החקירה של היבטים שונים של זיהום herpesviral, כמו גם הבחינה של הגנום של וירוסים אחרים, ה-DNA.

Introduction

וירוסים יש קיבולת מוגבלת כדי לבצע פונקציות חיוניות, ולכן תלויות בגורמים המארח כדי להקל על היבטים קריטיים זיהום כולל ביטוי גנים ויראליים, שכפול, תיקון, רקומבינציה תחבורה. הפעילות של גורמים אלה מארח הם לעיתים קרובות בתוספת לשווק מקודד חלבונים. בנוסף, וירוסים עליך להימנע וזיהוי הפרעות על-ידי תגובות הסלולר זיהום ויראלי. לכן, וירוס מחשב מארח אינטראקציות להכתיב את התוצאה של זיהום. חשיבות עליונה היא ההבנה כמה וירוסים לשנות את הסביבה הסלולר, במטרה להתאים את מכונות הסלולר כדי להקל על התהליכים ויראלי. עניין מיוחד הוא זיהוי גורמים ותהליכים אשר פועלים על הגנום הנגיפי במהלך מחזור זיהומיות.

וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) הוא שכפול תקועים וירוס DNA מדביק חלק ניכר של האוכלוסייה האנושית. בתוך שעה הראשונה של זיהום, הגנום הנגיפי נכנס לגרעין, איפה מדורגת מסודרת של ביטוי גנים ויראליים מתפתח בתיאום עם שכפול נגיפי DNA (vDNA)¹. בגרעין, הגנום הם כפופים לכללים epigenetic, לעבור רקומבינציה ותיקון, ארוזים לתוך capsids, כך virions הראשון רומא מיוצרים תוך פחות מ-6 שעות. הערכה מקיפה של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לאורך כל הקורס של זיהום תניח את הקרקע כדי לחקור את הפרטים מולקולרית של תהליכים פועלים על הגנום הנגיפי, יספק תובנות אילו גורמים נגיפיים וסלולריות מעורבים בשלבים שונים של זיהום.

שיטות קודמות לחקירה של המארח גורמים מעורבים זיהום ויראלי לכלול טיהור זיקה של חלבונים נגיפיים לניתוח של החלבונים הקשורים^{2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9}. מבחני אלה סייעו לצורך הזיהוי של הגורמים המעורבים הסלולר מארח תגובות אנטי ויראליים, כמו גם השינוי כרומטין ויראלי, ביטוי גנים, ותיקון דנ א. עם זאת, קשה לאמת אם האינטראקציות תלויים השיוך vDNA ולאחר פרוטאומיקס רק לספק תובנות האינטראקציות המתרחשות כפונקציה של גורם ויראלי ספציפי. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) נעשה שימוש כדי לזהות איפה לאגד חלבונים נגיפיים וסלולריות ספציפיים הגנום הנגיפי^{10,11,12,13,14 , 15} ופלורסנט היברידיזציה (דגים) בשילוב עם immunocytochemistry אפשרה את הפריט החזותי של גורמים הסלולר colocalize עם vDNA^{16,17,18, 19 , 20}. מבחני אלה מאפשרים יכולות ניתוח. עם זאת, מגבלות כוללים את הצורך של נוגדנים ספציפיים מאוד רגישות מוגבלת, הצורך הקודם תובנה וירוס מחשב מארח אינטראקציות. לכן פיתחנו שיטת עבודה המבוססת על iPOND (בידוד של חלבונים על ה-DNA nascent)²¹ , aniPOND (iPOND יליד מואצת)²² כדי לתייג באופן סלקטיבי ולטהר vDNA מן נגוע תאים לצורך זיהוי מוטים אפידמיולוגיה חלבונים הקשורים באמצעות ספקטרומטר מסה. iPOND היה אינסטרומנטלי החקירה של דינמיקה מזלג שכפול הסלולר.

לטיהור סלקטיבי של הגנום הנגיפי של תאים נגועים, שכפול vDNA נקראת עם ethynyl ששינה נוקלאוזידים, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו) או 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (איור 1), ואחריו קוולנטיות ההטיה כדי ביוטין אזיד באמצעות לחץ על כימיה כדי להקל על צעד בודד טיהור של הגנום הנגיפי וחלבונים הקשורים על חרוזים מצופים streptavidin (איור 2B). חשוב לציין, זיהומים מבוצעות בתאי נייח, אשר לא עוסקים הסלולר שכפול ה-DNA כדי לאפשר תיוג ספציפית של vDNA. יתר על כן, זיהום HSV-1 גורם מחזור מעצר התא, ומעכב הסלולר DNA שכפול^23,24. הוירוס יכול להיות prelabeled לפני זיהום לניתוח של חלבונים הקשורים נכנסות הגנום הנגיפי (איור 1 א') או תווית במהלך שכפול ה-DNA על הניתוח של חלבונים הקשורים לאחרונה מסונתז vDNA (איור 1B) ²⁵. יתר על כן, ניתוח צ'ייס הדופק יכול לשמש כדי לחקור את הטבע של חלבונים הקשורים שכפול ויראלי מזלגות (איור 1C)²⁶. בנוסף, vDNA ethynyl-השתנה יכול מצומדת covalently כדי fluorophore לחקירה המרחבי של חלבון דינמיקה (2A איור , איור 3). הדמיה מאפשר פריט חזותי ישיר של vDNA היא גישה ללא תשלום עבור האימות של אינטראקציות חלבון vDNA, ניתן להתאים לאתר הגנום הנגיפי במהלך זיהום. אנו צופים כי הגישות האלה יכול להיות עוד יותר שונה ללמוד בכל היבט של זיהום herpesviral, לרבות השהיית הפעלה מחדש, וכדי ללמוד וירוסים אחרים, ה-DNA. יתר על כן, תיוג עם 5-ethynyl uridine (EU) עלולה לאפשר לניתוח של הגנום נגיפי RNA.

Protocol

1. תרבית תאים, זיהום נגיפי ו- EdC תיוג ( איור 1)

בפרוטוקול הבא כרוך בעבודה עם וירוסים. נא עיין המוסד שלך ' s ביולוגית פרוטוקולים בדבר לטפל וירוסים ותוכנות אחרות ביולוגיים. פרוטוקול זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של אוניברסיטת פיטסבורג.

1. Trypsinize confluent 150 ס"מ ² תרביות רקמה בקבוקון MRC-5 תאים ולהעביר את התאים צלחת תרביות רקמה ² ס מ 600 המכיל 100 מ ל DMEM בתוספת 10% FBS. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO ₂ 3-4 ימים להגיע לשלב confluency, נייח. תבשיל ² ס מ 600 confluent מכיל ~ 7 x 10 ⁷ תאים. להכין לוח 1 עבור כל תנאי וצלחת 1 עבור כל פקד שלילי המתאים.
   הערה: תאים חייב להגיע לשלב נייח לעכב הסלולר שכפול ה-DNA כדי להבטיח את vDNA רק עם התווית וטיהרו בצעדים העוקבים.
   הערה: כל מדגם מחייבת ללא תשלום ללא תווית שלילית שליטה מוכנה תוך שימוש באותם תנאים זיהום ונקודת הזמן ללא התוספת של EdC.
   הערה: A את גירסת ניסוי זה צריך להתבצע במשולב עבור תיוג של DNA. תאית על ידי הדמיה באמצעות צמיחת תאים דומים, זיהום, EdC תיוג תנאים, ולבחון נקודות זמן (ראה שלב 2).
2. לדלל 7 x 10 ⁸ PFU HSV-1 ב- 7 mL קר Tris-Buffered מלוחים (TBS). להסיר את מדיום הגידול ולאחסן ב 37 º C. כדי להדביק, להוסיף את הוירוס מדולל 7-mL MRC-5 תאים ורוק לשעה בטמפרטורת החדר. בעקבות ספיחה, להסיר inoculum, לשטוף עם טמפרטורת החדר 50 מ ל TBS ולהחליף מדיום הגידול המקורי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5% ₂. שלב זה צריך להתבצע עבור כל תנאי הניסוי והבקרה שלילי.
   הערה: תיוג EdC מוגברת יכולה להיות מושגת באמצעות מוטציות HSV-1 פגום עבור הביטוי dUTPase ויראלי (ג'ין UL50) ו/או glycosylase אורציל (UL2 ג'ין). DUTPase HSV-1 יש ירידה לפרטים המצע נמוך והוא יכול להקטין את ההפעלה של מספר nucleoside תחליפי ^{25 , 27}-
3. הגנום הנגיפי תווית עם EdC. בצע את ההוראות כדי להדביק תווית הגנום נכנסות (1.3.1.), שכפול הגנום (1.3.2.), או מזלגות שכפול ויראלי (1.3.3.).
   הערה: צעד אחד בלבד 1.3.1, 1.3.2 או 1.3.3 צריכה להתבצע בהתאם האם הגנום נכנסות, הגנום משוכפלת או מזלגות שכפול הן כדי להיות מנותח בשלבים הבאים, בהתאמה.
   הערה: EdU או f-עארה אדו. הרבה מכדי EdC. הרעילות של תחליפי nucleoside צריך להיות במעקב, ממוזער.
   1. שימוש prelabeled מניות לבצע זיהום ב- 1.2 שלב ולהמשיך לשלב 2 או 3 בתוך 4 שעות לפרסם זיהום. מדד מחירי הבתים (. של) לחקור את unreplicated vDNA ( איור 1 א').
      הערה: להכין וירוס prelabeled מניות באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל ²⁵. וירוס מניות חייבים להיות מועברים דרך העמודה G-25 כדי להסיר כל EdC שיורית.
   2. תווית שכפול vDNA על-ידי הוספת 5-25 מיקרומטר EdC למדיום התרבות התא של התאים הנגועים עבור 2-4 h ( איור 1B). לפני הוספת, לדלל EdC ב 1 מ"ל של מדיום הגידול.
   3. לה תווית מזלגות שכפול ויראלי, לאחר תחילתה של שכפול vDNA (≥ מדד מחירי הבתים של 4), הדופק תווית שכפול vDNA עם 5-25 מיקרומטר EdC למשך 5-20 דקות. לרדוף אחרי, לשטוף 3 x עם צ'ייס בינוני המכיל 25-100 מיקרומטר 2´deoxycytidine (deoxyC), ואז דגירה במעמד בינוני צ'ייס עבור נוספים 20-40 דקות ( איור 1C).
      הערה: דופק וצ'ייס בינוני צריך equilibrated ל- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO ₂ לפני השימוש.
      הערה: לניסויים צ'ייס הדופק, חשוב לקחת בחשבון את כמות הזמן שלוקח נוקלאוזידים הזן את התא, להיות phosphorylated לפני שהם שניתן לשלבן שכפול ה-DNA. זה חייב להיקבע מדעית.
      הערה: כדי לקבוע את הרזולוציה של הדופק צ'ייס ניסויים, לחשב את קצב שכפול ויראלי בתנאים ניסיוני המשמש. זה יכול להיקבע על ידי PCR כמותי של הגנום הנגיפי במהלך הקורס ²⁶ זמן צמיחה צעד בודד.
      הערה: הדמיה הגנום הנגיפי המשך לשלב 2 והמשך לטיהור של הגנום הנגיפי לשלב 3-

2. הדמיה של EdC שכותרתו דנ א ( איור 2 א)

הערה: מומלץ לבצע הדמיה במשולב עם שיטת טיהור גנום ויראלי כדי לוודא כי הדנ א הסלולר לא מתויג בניסויים. הדמיה יכול לשמש גם כדי להמחיש את טיב vDNA שכותרתו וכדי לאמת נתונים פרוטאומיקס. דוגמאות הסלולר, נגיפי DNA מכתים דפוסי מוצגות באיור 3.

1. לבצע זיהומים ו EdC תיוג כפי שמצוין בשלב 1 חוץ באמצעות מדע פשוט התנאים על coverslips בקערה תרביות רקמה 12-ובכן המכיל 1 מ"ל של מדיום הגידול.
Paraformaldehyde
2. לתקן תאים עם 1 מ"ל 3.7% ב- 1 x PBS למשך 15 דקות ב- RT. לאחר קיבוע, שטיפה תאים 2 x עם 1 מ ל BSA 3% ב- PBS.
   התראה: Paraformaldehyde עלולה לגרום לפציעה חמורה או קבועה. בצע את אמצעי זהירות.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה ואת coverslips שניתן לאחסן ב 4 ° C בכביסה השני עד 3 ימים.
3. Permeabilize תאים עם 1 מ"ל permeabilization מאגר [ראה טבלה של חומרים] למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר תוך נדנדה.
4. לשטוף עם 1 מ"ל של BSA 3% ולאחר מכן בלוק עם 1 מ ל BSA 3% ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך נדנדה.
5. להוסיף 1 מ"ל של התגובה לחץ קוקטייל [ראה טבלה של חומרים] כדי coverslips כדי covalently נזווג אלקסה עבור חיל הים 488 אזיד כדי EdC הנקרא DNA. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך נדנדה. האחות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.
6. DNA הסלולר הכתם עם 1 מ"ל של 1:2,000 לדילול Hoechst ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך נדנדה. האחות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.
Immunofluorescence עקיפה
7. הכתם עם נוגדנים והמשניים בהתאם לתקן תקנות ²⁵.
   הערה: עם תוויות vDNA colocalizes ICP8, ICP4 או UL42 ו מתויג הסלולר DNA colocalizes עם צביעת הכסט.
8. לעלות coverslips על גבי שקופיות על התמונה תאים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
   הערה: שקופיות שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.

3. טיהור של vDNA וחלבונים הקשורים

הערה: מספר היבטים של פרוטוקול זה הותאמו מ ליונג. et al. ²²
הערה: כל מאגרי, ריאגנטים צריך להיות מקורר על הקרח לפני השימוש, כל הצעדים צריכה להתבצע על קרח אלא אם צוין אחרת.

1. הקציר גרעינים.
   הערה: לפני ניתוקה של גרעינים, פורמלדהיד יכול לשמש crosslink חלבונים ל- DNA. שטיפת בתנאים המחמירים יותר יכול לשמש לאחר מכן במהלך טיהור DNA על חרוזים מצופים streptavidin. עבור crosslinking ותנאי שטיפת לראות. Sirbu et al. ²¹.
   1. להחליף את מדיום הגידול עם 20 מ ל מאגר החילוץ גרעינים (נב), תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C עם נדנדה מפעם לפעם. הגרעינים יהפכו לגלויים במיקרוסקופ.
   2. גרעינים מגרדים מהצלחת באמצעות תא במגרדת העברת צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,500 ב 4 ° C הצניפה גרעינים, למחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: Trypan צביעת התכלת יכול לשמש כדי לאמת את ניתוקה של גרעינים מתאי.
   3. בעדינות מכך בגדר גרעינית ב 10 מ"ל PBS, העברת צינור חרוטי 15-mL, ו הצניפה מאת צריך שתוציאו 10 דקות ב 2,500 g x-4 ° C. לחלוטין להסיר PBS.
      הערה: גרעינים שיכול להיות קפוא, ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. כדי לעשות זאת, resuspend בעדינות בגדר גרעיני 500 µL קפוא מאגר, דגירה הצינור באמבט קרח אתנול/יבש. חנות קפוא גרעינים ב-80 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, להפשיר גרעינים בטמפרטורת החדר, העבר במהירות קרח, להוסיף 10 מ"ל PBS, רוק בעדינות כדי לערבב, גלולה על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,500 ב 4 ° C, ו להסיר לחלוטין PBS. הקפאת גרעינים עלול להניב תשואה מופחת.
2. Covalently תרכיב ביוטין-אזיד כדי EdC הנקרא vDNA.
   1. Resuspend בגדר גרעיני בתגובה לחץ 10 מ"ל לערבב [ראה טבלה של חומרים] על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים עם pipet 10 מ ל-
      הערה: חשוב כי ריאגנטים הכלולים המיקס תגובת לחץ נוספים לפי הסדר שצוין.
   2. לסובב עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. תוך כדי סיבוב להתכונן ולהירגע מאגרי B1, B2, B3 [ראה טבלה של חומרים].
   3. צנפה גרעינים על ידי צריך שתוציאו 10 דקות ב 2,500 g x-4 ° C. לחלוטין להסיר לחץ על תערובת התגובה ולשטוף בגדר מאת resuspending ב- 10 מ"ל PBS ובעדינות צריך שתוציאו 10 דקות ב g x 2,500 ב-4 מעלות צלזיוס
   4. Resuspend בעדינות את צניפה גרעינית ב 1 מ"ל PBS ואת העברת צינור microfuge 1.5 mL באמצעות טיפ פיפטה גדולה. גלולה גרעינים על ידי צריך שתוציאו 10 דקות-2,500-ג'י ב- 4 ° C. לחלוטין להסיר PBS והקפאת פלאש בחנקן נוזלי.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה, ניתן לאחסן גרעינים קפוא ב-80 מעלות צלזיוס להקפיא הפשרת מסייע עם פירוק העוקבים אז מומלץ כי הגרעינים להיות פלאש קפוא גם כאשר הליך שלב 3.3 באותו יום.
3. Lyse גרעינים, קטע הדנ א.
   1. להפשיר גרעינים על קרח, resuspend ב 500 µL B1 מאגר על-ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה על קרח במשך 45 דקות
   2. Sonicate דגימות 6 פעמים ב-30 s כל ב 40% משרעת באמצעות בדיקה microtip 3 מ מ. במקום דוגמאות על הקרח ב-30 s בין פולסים. לאחר sonication, דגימות אמור להופיע ברור, לא מעוננים.
      הערה: Sonication התנאים צריכים להיות אופטימיזציה עבור sonicators בודדים. לקבלת הוראות מפורטות על איך לייעל את התנאים sonication להפנות ליונג. et al. ²².
   3. גלולה שאריות תאים על-ידי צריך שתוציאו ב 14,000 g x 10 דקות ב 4 º C. גודל צניפה צריך להקטין באופן משמעותי. לסנן את תגובת שיקוע דרך 100 מיקרומטר תא מסננת ולשמר את הזרימה.
   4. µL 500 להוסיף מאגר B2 כדי µL מסוננים תגובת שיקוע. 900 של דוגמה זו תשמש בשלב 3.4.2.
   5. לקחת את aliquot של כל תנאי עבור בידוד של דנ א (50 µL או כרך 1/20) ולהוסיף 50 µL 2 x מרחביות-ביקרבונט פתרון [ראה טבלה של חומרים]. להמשיך פרוטוקול בידוד של דנ א (שלב 3.6).
   6. לקחת את aliquot של כל תנאי עבור קלט חלבון (50 µL או כרך 1/20) ולאחר להוסיף 50 µL 2 x מאגר מדגם Laemmli, להקפיא במצב חנקן נוזלי ולאחסן ב- 80 ° C. שימוש בשלב 3.5.6.
4. Biotinylated איגוד ה-DNA כדי streptavidin מצופה חרוזים.
   1. Streptavidin T1 להכין beads מגנטי על-ידי העברת µL 300 של חרוז slurry צינור microfuge 1.5 mL. להכין את שפופרת אחת של חרוזי לדגימה. שטיפת חרוזים 3 x 1 מ ל מאגר B2 vortexing כדי resuspend, החלת מגנט כדי להפריד את החרוזים ועל כ רפה בעברית המאגר לשטוף.
      הערה: אופטימיזציה מחייב תוצאה תנאי התשואה מוגדל ואיגוד רקע מינימלי. השפעול נקבע כי beads מגנטי Streptavidin T1 יש יכולת איגוד גדול יותר באופן משמעותי מאשר חרוזים agarose, כמו גם חרוזים Streptavidin אחרים, ופחות רקע מחייב מאשר Streptavidin C1 חרוזים ( איור 4A ).
   2. הוסף 900 µL מדגם מהשלב 3.3.4. ואליה לסובב את החרוזים רחץ לילה ב-4 מעלות צלזיוס
      הערה: האם לא מערבולת חרוזים ברגע מדגם מתווסף להם.
      הערה: אם כמות משמעותית של דנ א או חלבון מבודדים בפקד תווית שלילית, שלב זה אפשר לצמצם מ לילה 4 h כדי להפחית את הרקע איגוד.
5. Elute vDNA, חלבונים הקשורים וקונטה חרוזים.
   הערה: מומלץ להשתמש במסנן טיפים עבור השלבים הנותרים.
   1. דגימות מקום בארון צינור microfuge מגנטי, הסר תגובת שיקוע, בעדינות resuspend ב 1 מ"ל מאגר B2, סובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.
   2. חזור על שלב 3.5.1 שלוש פעמים.
   3. במקומו את הדגימות לתוך מתלה צינור microfuge מגנטי, להסיר את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend ב 1 מ"ל מאגר B3, וסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.
   4. העברת 100 µL חרוז התערובת (1/10 ^בתאנון נפח) עד צינור בידוד ה-DNA מאוגד. להחיל את הצינור הזה על המגנט, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend חרוזים ב 100 µL 1 x מרחביות-ביקרבונט פתרון והמשך בפרוטוקול בידוד ה-DNA (שלב 3.6).
   5. להחיל את הצינור המכיל את התערובת חרוז הנותרים 900 µL מ שלב 3.5.3. למגנט, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend חרוזים ב- 50 µL 2 x Laemmli מאגר הדגימה כדי elute חלבון לבין מכלולי חלבון-דנ א.
   6. לרתיחה דגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, מערבולת, לסובב, microfuge, ובמהירות להחיל מגנט. Eluate להעביר צינור חדש, הקפאת פלאש, חנות ב-80 מעלות צלזיוס
      הערה: שימוש מנעולים כובע כדי להבטיח כי צינורות לא צצים פתיחת תוך הרתחה.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, דוגמאות שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
   7. ניתוח דגימות חלבון כחול Coomassie מכתים, סופג המערבי או ספקטרומטר מסה מאת נהלי ²⁵. התוצאות נציג מוצגים באיור 4, איור 5.
      הערה: כדי לקבוע אם התשואה חלבון מספיקה ספקטרומטר מסה, 7.5 µL של כל מדגם משמש לצורך ניתוח כחול Coomassie מכתים ומקושרת µL 7.5 עבור סופג המערבי של גנום ויראלי נציג חלבון (ICP4, ICP8 או UL42). באותו אמצעי אחסון של lysates מ שלב 3.3.6. פועלים לצד לפקד עבור רמות החלבון קלט. המדגם הנותרים (35 µL) מכן נותחו על ידי מסה ספקטרומטר כפי שתואר לעיל ²⁵.
6. בידוד ה-DNA
   1. דגירה בדגימות מצעדי 3.3.5. ואת 3.5.4. ב 65 מעלות צלזיוס במשך 4-16 ה' הסר לדגום beads מגנטי, במידת הצורך.
   2. לחלץ דוגמיות עם µL 150 פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (PCI) ולהעביר את פאזה מימית צינור חדש.
   3. לחלץ את PCI הנותרים עם 100 µL טריס-EDTA (TE) ולהוסיף את פאזה מימית צינור חדש.
   4. לחלץ דוגמיות עם אלכוהול כלורופורם: isoamyl µL 200 (24:1).
   5. לטהר את פאזה מימית באמצעות ערכת טיהור PCR על פי היצרן ' פרוטוקול s.
      הערה: מחוון ה-pH ב PB מאגר יהפוך סגול כאשר הוסיף את הדגימה. להוסיף 10 & #181; L-3 מ'-NaOAc-pH 5.0 כדי להקטין את רמת ה-pH של המדגם-
   6. DNA לקבוע ריכוז באמצעות fluorometer.
      הערה: פרוטוקול זה בדרך כלל מניבה 100-400 ng חרוז מכורך DNA. אין דנ א צריך לזהות את eluate של הפקד שלילי שבו EdC לא נוספה ב- 1.3 צעד.
   7. דנ א יכול להיות מאוחסן איגוד ה-DNA נמוך צינור על 4 או - 20 ° C, ניתן להשתמש עבור ה-PCR בזמן אמת או ניתוח רצפי התפוקה גבוהה.

תוצאות

השימוש לחץ כימיה לטיהור של ה-DNA של תאים בוצעה לראשונה על ידי שיטת iPOND²¹. מטרת iPOND היא לטהר מזלגות שכפול הסלולר לצורך זיהוי חלבונים הקשורים. אנחנו הסתגלו טכניקה זו ללמוד אינטראקציות חלבון vDNA במיוחד במהלך זיהום. מניפולציה של הגישה לתייג הגנום הנגיפי עם EdC (

Discussion

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים אשר, אם לא עקבו בזהירות, עלולה לגרום התשואה חלבון מופחתת באופן משמעותי או זיהום עם תאי ה-DNA. . זה קריטי כי נייח תאים משמשים לניסויים כל כדי להבטיח כי DNA הסלולר לא מתויג, מטוהרים זה יכול להיות מאושרות על ידי העדר polymerases DNA הסלולר במדגם חלבון כי HSV-1 לא לנצל את הסלולר DNA פ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock			Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column)	GE Healthcare	17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
Nuclear Extraction Buffer (NEB)			Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper	Bellco glass	7731-22000	Autoclave before use
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide	Invitrogen	B10184	Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year
Click Reaction Mix			Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001	Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
Freezing buffer			Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1			Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2			Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3			Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli sample buffer			Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
Cap locks for 1.5 mL tube	Fisher Scientific	NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
12-well tissue culture dish	Corning	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclave before use
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	Prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
Mouse anti-ICP8 primary antibody	Abcam	ab20194	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)	Abcam	ab19311	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody	Life Technologies	a11005	Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x SDS-bicarb solution			2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol			Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol			Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks			65 °C and 95 °C