JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد وضع بروتوكول للتوليف وتنقية، وتوصيف مثبط على أساس الروثينيوم لامتصاص الكالسيوم المتقدرية. ويتجلى إجراء تقييم فعاليته في خلايا الثدييات بيرميبيليزيد.

Abstract

ونحن بالتفصيل التوليف وتنقية مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية،] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [5 +. التوليف الأمثل من هذا المركب تبدأ من [رو (NH3)5Cl] Cl2 في 1 م NH4يا في حاوية مغلقة، مما أسفر عن حل أخضر. ويتم إنجاز تنقية مع الفصل اللوني لتبادل الأيونات الموجبة. يتميز هذا المركب والتحقق من أن تكون نقية بالتحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء. خصائص امتصاص الكالسيوم المتقدرية المثبطة يقيمها fluorescence التحليل الطيفي في خلايا هيلا بيرميبيليزيد.

Introduction

الكالسيوم المتقدرية هو منظم رئيسي لعدد من العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة لوظيفة الخلية العادية، بما في ذلك إنتاج الطاقة والمبرمج. 1 , 2 , 3 أونيبورتير الكالسيوم المتقدرية (MCU)، بروتين الناقل أيون موجودة على غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وينظم تدفق أيونات الكالسيوم في الميتوكوندريا. 4 , 5 , 6 الكيميائية مثبطات MCU أدوات قيمة لمواصلة الجهود الرامية إلى دراسة وظائف وأدوار الخلوية هذا النقل البروتين والكالسيوم المتقدرية. مجمع] (NH3) (HCO2)4رو رو (μ س) (NH3)4(س2CH) [3 +، Ru360، واحد من مثبطات انتقائية المعروفة فقط ل MCU مع قيمةد ك المبلغ عنها من 24 ميكرومتر.7 8، ،،من910 هذا المجمع شوائب مشتركة الموجودة في المستحضرات التجارية من الروثينيوم الأحمر (روريد)، اثنا دي-μ-أوكسو سد هيكساكاتيون الصيغة (NH]3) 5 رو (μ س) رو (NH3)4(μ س) رو (NH3)5)]6 +، التي استخدمت أيضا كمثبط امتصاص كالسيوم. على الرغم من أن Ru360 المتاحة تجارياً، أنها مكلفة للغاية. وعلاوة على ذلك، طعن التوليف وعزل Ru360 تنقية صعوبة إجراءات وأساليب توصيف غامضة.

ونحن قد أبلغت مؤخرا بإجراءات بديلة الوصول إلى Ru360 التماثلية، [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 يمنع هذا المركب MCU مع تقارب عالية، مماثلة ل Ru360. في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف لدينا توليف الأكثر فعالية لهذا المركب، الذي يبدأ من [رو (NH3)5Cl] Cl2. هو مفصل تنقية المنتج باستخدام راتنج تبادل الأيونات الموجبة الحمضية بشدة، جنبا إلى جنب مع المخاطر الشائعة لهذا الإجراء. ونحن أيضا أساليب لتوصيف وتقييم درجة نقاء مجمع، وتحدد نهج بسيط لاختبار فعاليته في منع امتصاص الكالسيوم المتقدرية.

Protocol

ملاحظة

: تركيز الأحماض والقواعد المستخدمة في هذا التوليف. استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند القيام برد فعل بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان) ومعدات الحماية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) بما في ذلك سلامة النظارات والقفازات ومعطف مختبر، وكامل طول السراويل وأحذية أغلقت تو.

1. إعداد [(أوه 2) (NH 3) 4 رو (μ س) رو (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. توليف Cl [Cl 5 رو (NH 3)] 2 12
    1. ز حل 1.00 روكل 3 · ن ح 2 س (40% رو بالوزن، 4.1 mmol) في 5 مل ح 2 سين بارد الحل البنى الداكن إلى 0 درجة مئوية في حمام الثلج. إضافة مل 11 (0.23 mol) من حل هيدرات الهيدرازين 80% بطريقة دروبويسي. رد الفعل الأولى ستكون قوية مع تطور الغاز، أسفر عن حل براون. واسمحوا أن الحل الناجم عن ذلك ضجة في درجة حرارة الغرفة ح 16؛ أن الحل النهائي سيكون احمرت الظلام
      تنبيه: الهيدرازين حادة السمية والمسببة للسرطان. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر اللامائى أشكال هذا الكاشف المتفجرات. كما هو الحال دائماً، استخدم أغطية معدات الوقاية الشخصية والأبخرة المناسبة عند التعامل. لم تركز هذه الحلول إلى جفاف.
    2. لهذا الحل، قم بإضافة ما يقرب من 5-10 مل HCl مركزة لضبط درجة الحموضة إلى 2. عند هذه النقطة، سيكون الحل بني أصفر اللون.
    3. الحرارة هذا الحل عند 105 درجة مئوية بينما التحريك ح 1-2. مادة صلبة صفراء سوف يعجل بالخروج من الحل. عندما يعجل لا أكثر وضوحاً أشكال، إزالة من الحرارة.
    4. السماح برد فعل الخليط يبرد لدرجة حرارة الغرفة، ومن ثم ضع في حمام الثلج 0 درجة مئوية لجمع 10 دقيقة صلبة صفراء بفراغ الترشيح والغسيل مع مل 5 كل من الإيثانول وثنائي إثيل الاثير.
      5. تماما حل
    5. النفط الخام المنتج في 15-25 مل ماء الساخن. تشيل 10 مل حل HCl تتركز في قارورة تصفية بوضعه في حمام الثلج. تصفية الحل الأصفر إلى حل HCl مبردة للحث على هطول الأمطار صلبة نقية أصفر باهت. تصفية هذا متسرعا وتغسل مع 5 مل من 0.5 M HCl، الإيثانول والبروم ثنائي الفينيل-
      6. مطيافية الأشعة تحت الحمراء
    6. تميز باستخدام مجمع. تحقق من النقاء بتحديد الترددات وتمتد في سم 3226 -1 و 1604 سم -1 سم 1297 -1 سم 801 -1. يتم تعيينه الحدث الأصغر مشترك في سم 2069 -1 إلى [رو (NH 3) 5 ن 2] Cl 3-
  2. توليف من [(NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. حل 100 مغ (0.34 ملمول) [رو (NH 3) 5 Cl] Cl 2 في 50 مل من م 1 NH 4 يا في وعاء ضغط القاع المستديرة ثقيلة جدار 200 مل. كاب قارورة مع سداده فضفاضة وتسخين المخلوط رد الفعل عند 75 درجة مئوية ل h. 6 إزالة من الحرارة ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 أيام تسفر عن حل أخضر داكن.
      تحذير! تدفئة نتائج سفينة مختومة في تراكم ضغط. تأكد من استخدام الأواني الزجاجية الآمنة للضغط المناسب. لرد الفعل هذا، أن الغرض من ختم السفينة تقليل الخسائر في الغازية NH 3. ولذلك، ضع سداده فضفاضة للسماح بالإفراج عن الضغط الزائد.
  3. تنقية اللوني لتبادل الأيونات الموجبة
    1. في كوب 25 مل، تعليق ز 5 راتنج تبادل الأيونات الموجبة (مثلاً شبكة دو 50WX2 200-400 (نموذج ح +) في 10 مل م 0.1 HCl.
    2. تحميل هذا الملاط إلى عمود 10 مل (10 مم، الارتفاع 15 سم) الملصقة بخزان مذيب 50 مل. أغسل الراتنج مع ما يقرب من 20-30 مل من 0.1 M HCl، حتى النذرة عديم اللون.
    3. العودة إلى حل الرد الأخضر معزولة في خطوة 1.2.1. لهذا الحل، قم بإضافة HCl مركزة لضبط درجة الحموضة إلى 2، النقطة التي يتغير لون الحل إلى براون-
    4. تحميل هذا الحل المحمضة إلى العمود راتنج تبادل الأيونات الموجبة أعده في خطوة 1.3.2 بلطف بيبيتينج أنه على رأس الراتنج. واسمحوا النذرة تماما الصرف، ومتابعة تحميل الحل. كرر هذه العملية حتى تم إضافة الحل الكامل. وسيكون الأعلى من الراتنج بني داكن/أسود. الراتنج ستنخفض في حجم قليلاً.
    5. استخدام الزجاج الخرز لتغطية الجزء العلوي من الراتنج. هذه سيمنع الراتنج من يجري بالانزعاج عندما تتم إضافة حلول جديدة-
    6. الوت العمود مع 20 مل من 1 M HCl.
    7. الوت العمود مع زيادة تركيز HCl 1.5 متر (≈ 50 مل). حلاً أصفر ستبدأ بالخروج من العمود. زيادة تركيز HCl إلى 2 متر وتستمر التينج حتى النذرة عديم اللون أو أصفر أخضر شاحب جداً. إجمالي 150-200 مل ستكون مطلوبة من أجل هذه العملية.
    8. زيادة تركيز HCl إلى 2.5 م (20-50 مل). جمع النذرة كالكسور في أنابيب الاختبار. تزيد على 3 M HCl. وسوف الوت المنتج من العمود كحل الأخضر والبنى. قد تبدأ صغيراً أحمر اللون البنى أيضا يأتي الخروج من العمود. كما هذه الكسور الأحمر المؤكسد الروثينيوم من الشوائب، لا تجمع مع كسور الأخضر والبنى-
  4. توصيف والتحقق من نقاء] (NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2) [Cl 5
    1. اختبار كل من الكسور من الخطوة 1.3.8. طريق التحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية. لإنجاز هذه المهمة وإضافة 100 ميليلتر من جزء معين في 2 مل 3 M NH3 وتحليل جانب مطيافية الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة. الكسور التي تحتوي على منتجات نقية سيكون عصابة امتصاص كبير في 360 نيوتن متر وامتصاص أقل كثافة في 600 نانومتر. امتصاص في 480 أو 533 nm الإرشادية الروثينيوم المؤكسد أحمر وأحمر الروثينيوم من الشوائب، على التوالي.
    2. تجمع الكسور التي تحتوي على منتجات نقية وتتبخر الحل لجفاف بتبخر دوارة. وسوف يكون المنتج معزولة صلبة الأخضر والبنى. غلة عادة تتراوح بين 5-15 ملغ (10-20% العائد). يمكن الحصول على واحد--بلورات، مناسبة حيود الأشعة السينية، بنشر بخار الإيثانول في المحاليل المجمع.
      3. تحليل
    3. للتحقق من النقاء، المجمع بالتحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية في إيجاد حل لدرجة الحموضة 7.4 مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). يمكن تقييم نقاء بأخذ نسبة كثافة 360 نيوتن متر و 600 نانومتر القمم. وهذه النسبة هي 31 لمجمع نقية. للمركبات النجسة، ستكون النسبة أصغر.
    4. تحليل العينة في الحالة الصلبة واسطة مطيافية الأشعة تحت الحمراء. تكون الأشرطة التشخيص على 3234 سم -1 سم 3151 -1، سم 1618 -1، سم 1313 -1 وسم 815 -1. تعتبر مشتركة شوائب العصابات في 1762 سم -1 و 1400 سم -1, مميزة من NH 4 أحمر الروثينيوم ألغ يمكن تحديد الفرق في سم 1404 -1 و 800 سم -1 سم 1300 -1، سم 1037 -1-
  5. التقييم لتثبيط امتصاص الكالسيوم المتقدرية بالأسفار التحليل الطيفي
    تنبيه! الإجراءات التالية استخدام خلايا الثدييات. وينبغي أن يجري العمل في أغطية الاندفاق الصفحي المناسبة التي هي معتمدة للسلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) البحوث.
    ​ ملاحظة: [(NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 سوف يشار إليها باسم [رو] في هذا القسم
    1. جعل مخزنة المحتوية على السكر المحلول الملحي (بجس) كما تحليل وسائل الإعلام. بجس حل تضم 110 مم بوكل، مم 1 خ 2 ص 4، 1 مم مجكل 2، 20 مم 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس)، سوكسيناتي الصوديوم 5 مم، 30 ميكرون جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-ن، ن ، ن '، ن '-حمض tetraacetic (اجتا). الجمع بين كل شيء ما عدا اجتا، وضبط pH إلى 7.4. إضافة اجتا وتعدل pH إلى 7.4. 50 مل بمقايسة وسائط إضافة 0.5 مل السكر 1 ملغ/مل.
    2. خلايا "هيلا الثقافة" في 500 سم 2 أطباق بيتري في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO 2 في 37 ° "هيلا تضخيم جيم" الخلايا تنمو في 100 مم طبق بيتري ببذر لهم في طبق بتري 500 سم 2. أن حجم مجموع وسائل الإعلام في الطبق الكبير 115 مل. وسيؤدي كل طبق كبير حوالي 18 مليون الخلايا، ما يكفي للتحليل الطيفي fluorescence تجربتين.
      1. تنمو الخلايا حتى تصل إلى 90-95% كونفلوينسي. قم بإزالة الوسائط، وشطف الخلايا مع 15 مل الأس الهيدروجيني 7.4 برنامج تلفزيوني. إضافة 15 مل حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 10 دقائق لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى مل 14 جولة أسفل الصقر أنابيب
    3. عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير مع مجهر مقلوب، وحساب إجمالي عدد الخلايا وحجم الوسائط اللازمة للوصول إلى الخلايا 7.5 مليون في حجم 1.8 مل من المتوسطة. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 5310 × زاي صب المادة طافية وإضافة حجم المحسوبة من بجس. ريسوسبيند الخلايا بلطف.
      1. لهذا التحليل، إعداد حلول الأسهم من ديجيتونين 40 مم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، 1 مم الكالسيوم الأخضر-5N في ح 2 س، و 10 مم كاكل 2 في 2 ح سين [رو] الأسهم الحلول، أعدت في المياه النقية، ويمكن أن تتراوح بين 1-3 مم-
        ​ ملاحظة: الكالسيوم الأخضر-5N حساسة للضوء. تخزين في الظلام والتقليل من التعرض للضوء.
    4. الإعداد فلوريميتير إثارة في 506 نانومتر والقراءة الانبعاثات في 532 نانومتر مع صاحب ومبومو يسيطر على 37 ° جيم تحضير ومبومو اكريليك مع شريط ضجة أو عجلة، تعليق خلية 1.8 مل من 1.5.2 أعلاه، 1.8 ميليلتر ديجيتونين الحل، 3.6 & #181؛ الكالسيوم L الأخضر-5N (الحل)، وميليلتر 9 [رو] (للحل الأسهم 1 مم، 5 ميكرومتر التركيز النهائي). احتضان خلايا لمدة 15 دقيقة في فلوريميتير.
      1. قراءة البيانات كنسبة الإثارة/الانبعاثات بدلاً من استيعاب الخام. هذه الممارسة يقلل الأخطاء المرتبطة بالتقلبات في كثافة مصدر الضوء.
      2. القيام بتحليل العينة الأولى في الغياب [رو] لقياس تأثير إضافة كاكل 2 على استجابة الخلايا.
      3. التحليل تبدأ في فلوريميتير مع الإعدادات الموضحة في 1.5.4. الانتظار حوالي 2 دقيقة وضع خط أساس انبعاثات مستقرة، ثم قم بإضافة ميليلتر 1.8 كاكل 2 (10 ميكرون تركيز النهائي). كثافة الانبعاثات ستزيد فورا عند إضافة كاكل 2، وسوف تسوس على مدى دقائق ثم دخول أيونات الكالسيوم الميتوكوندريا. انتظر حتى ينتهي الانحلال (≈ 5 دقائق). إضافة بلعات الكالسيوم الإضافية لتحديد استجابة الخلايا لا تعامل مع [رو] امتصاص الكالسيوم المتقدرية.
    5. في ومبومو آخر يحتوي على 5 ميكرومتر [رو]، كرر التجربة كما هو موضح أعلاه في 1.5.4.3. حضور المانع، كثافة الانبعاثات تزيد، لكن ليس الاضمحلال. وهذه الملاحظة تعني حظر امتصاص الكالسيوم المتقدرية.

النتائج

يصف هذا الأسلوب توليفة من الكالسيوم المتقدرية امتصاص المانع] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 ابتداء من [رو (NH3)5Cl] Cl2، انطلاق المواد ruthenium(III) معروفة جيدا. [Cl5رو (NH3)] Cl2 يتميز بطيف الأشعة تحت الحمراء، مع ?...

Discussion

الكالسيوم المتقدرية امتصاص المانع] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 يمكن أن يكون المركب من [رو (NH3)5Cl] Cl2، ruthenium(III) معروفة جيدا ابتداء من المواد، كما هو موضح في هذا الإجراء. ويتحقق التوليف [رو (NH3)5Cl] Cl2 سهولة دون صعوبة تذكر...

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgements

وأيد هذا البحث جامعة كورنيل. هذا العمل باستخدام مركز كورنيل "المرافق المشتركة البحث المواد"، هي معتمدة من خلال برنامج مرسيك جبهة الخلاص الوطني (هيئة الهجرة واللاجئين منحة--1120296). وتسلم S.R.N. الدعم بزمالة بحثية الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني (منحة تأيين-1650441) والدكتور ديف Holowka للمساعدة مع هذه التجارب الكالسيوم. أي رأي، النتائج التي توصل إليها، والاستنتاجات أو التوصيات التي أعرب عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين (s)، ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر "المؤسسة الوطنية للعلوم".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ruthenium Trichloride hydratePressure Chemical3750
Concentrated hydrochloric acidJ.T. Baker9535
Concentrated ammonium hydroxideMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Calcium Green 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Sodium SuccinateAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlucoseAldrichG5000
200 Round bottom flaskChemGlassCG-1506-14
Glass stopperChemGlassCG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirsCustom - similar to Chemglass columnsSimilar to CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Round bottom Falcon tubesFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 petri dishesCorning431110
Trypan blueThermoFisher Scientific15250061
HemacytometerAldrichZ359629
Acrylic CuvettesVWR 58017-875
UV-Vis spectrometerAgilent Model Cary 8454 
SpectrofluorimeterSLM Model 8100C
IR spectrometerBruker Hyprion FTIR with ATR attachment
CentrifugeALC Model PM140R
Inverted light microscopeVWR 89404-462

References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128 Ru360

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved