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요약

합성, 정화, 및 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관의 루 테 늄 기반 억제제의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. Permeabilized 포유류 세포에서 효능을 평가 하는 절차를 설명 했다.

초록

우리는 합성과 정화는 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물, [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)]5 +의 선발. 이 화합물의 최적화 된 합성 1 m에서 [Ru (NH3)5Cl] Cl2 에서 NH4오 그린 솔루션 저조한 닫힌된 컨테이너에서 시작 됩니다. 정화는 양이온 교환 크로마토그래피와 함께 수행 됩니다. 이 화합물과 특징은 순수에 대 한 UV와 IR 분광학에 의해 확인. 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 속성 permeabilized HeLa 세포에 형광 분광학에 의해 평가 됩니다.

서문

미토 콘 드리 아 칼슘은 에너지 생산 및 apoptosis를 포함 하 여 정상적인 세포 기능에 중요 한 프로세스의 수에 대 한 키 레 귤 레이 터 이다. 1 , 2 , 3 미토 콘 드리 아 칼슘 uniporter (MCU), 내부 미토 콘 드리 아 막에 상주 하는 이온 운송업 자 단백질은 미토 콘 드리 아로 칼슘 이온의 유입을 통제 한다. 4 , 5 , 6 화학 억제제는 MCU의 기능이 수송 단백질과 미토 콘 드리 아 칼슘의 세포 역할을 공부 하 고 노력을 계속 하는 데 유용한 도구는. 복합 [(HCO2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, 24 µ M.7 보고 Kd 값 MCU에 대 한 유일한 알려진된 선택적 억제제 중 하나입니다. ,8,,910 이 복잡 한 상업적인 정립에서의 루 테 늄 빨강 (RuRed)는 triruthenium 디-μ-oxo 발견 일반적인 불순은 다리의 공식 [(NH3) hexacation 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(μ O) Ru (NH3)5)]6 +, 또한 칼슘 통풍 관 억제 물으로 사용 되었습니다. Ru360를 상업적으로 사용할 수 있지만 그것은 매우 비용이 많이 드는입니다. 또한, 합성 및 Ru360의 절연 어려운 정화 절차와 모호한 특성 방법에 의해 도전입니다.

우리는 최근 Ru360 아날로그, [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5액세스 절차 보고 있다. 11 이 화합물 높은 선호도, Ru360와 유사한 MCU 억제. 이 프로토콜에서 [Ru (NH3)5Cl] Cl2개시는 화합물의 우리의 가장 효과적인 합성을 설명 합니다. 강하게 산 성 양이온 교환 수 지를 사용 하 여 제품의 정화는이 절차에 대 한 일반적인 함정 함께 상세한입니다. 우리는 또한 특성화 및 복합 순도의 평가 대 한 방법을 제시 하 고 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 차단에 그 효능을 테스트 하는 간단한 방법의 윤곽을 그리 다.

프로토콜

참고: 농축된 산 및 기초가이 합성에 사용 됩니다. 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하 여 엔지니어링 컨트롤 (증기 두건) 및 안전 안경, 장갑, 랩 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발 등 개인 보호 장비 (PPE)의 사용을 포함 한 반응을 수행할 때.

1.의 준비 [(오 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5

[Ru (NH 3) 5 Cl] Cl의
  1. 합성 2 12
      RuCl 3 · n H 2 O의
    1. 분해 1.00 g (40% 무게에 의해 Ru, 4.1 mmol) H 2 o. 쿨 얼음 목욕에서 0 ° C에 어두운 갈색 솔루션의 5 ml에서. Dropwise 방식에서 80% 히드라 진 하이드 레이트 솔루션의 11 mL (0.23 mol)를 추가 합니다. 초기 반응 갈색 솔루션의 결과로 진화 가스와 활발 한 것입니다. 16 h;에 대 한 실 온에서 저 결과 솔루션을 보자 최종 솔루션은 어두운 무엇이 될
      주의: 히드라 진은 심하게 독성과 발암 성. 또한, 무수이 시 약이 폭발 합니다. 항상 그렇듯이, 처리할 때 적절 한 보호구 및 연기 후드를 사용 합니다. 이러한 솔루션 건조에 집중 하지 마십시오.
    2. 가 솔루션 2로 pH를 조정에 집중 된 HCl의 약 5-10 mL을 추가. 이 시점에서, 솔루션 것입니다 노란색 갈색 색상에서.
    3. 1-2 시간 교 반 하면서 105 ° C에서이 솔루션을 열. 노란 고체 솔루션에서 침전 한다. 더 이상 침전 가시 형태, 열에서 제거.
    4. 하도록을 실내 온도에 냉각 후 0 ° C 얼음 욕조에 10 분 수집 진공 여과 및 세척 5 mL로 하 여 노란색 고체에 대 한 반응 혼합물의 에탄올과 에테르 diethyl.
    5. 완전히 15-25 mL의 뜨거운 물에 원유 제품을 분해. 얼음 목욕에서 그것을 배치 하 여 집중 HCl 솔루션 필터 플라스 크에 10 mL을 진정. 창백한 노란색 순수한 고체의 강 수를 유도 하기 위해 냉장된 HCl 솔루션으로 노란색 솔루션을 필터링 합니다. 이 침전을 필터링 하 고 각 0.5 M HCl, 에탄올 및 에테르 5 mL로 씻어.
    6. 특성과 복합 사용 하 여 적외선의 분광학 3226 c m -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1, 801 c m -1에서 기지개 주파수 식별에 의해 순도 확인 합니다. 2069 cm -1에 일반적인 작은 불순 [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3에 할당 됩니다.
  2. [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5의 합성
    1. 100mg (0.34 mmol)을 녹 [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 50 ml의 1 M NH 4 200 mL 무거운 벽 라운드 바닥 압력 용기에 오. 느슨하게 캡 스 토퍼와 플라스 크 6 h. 제거 열에서 75 ° C에서 반응 혼합물이 열 하 고 어두운 녹색 솔루션을 4 일 동안 실내 온도에 저 어.
      주의! 압력 형성에 밀폐 용기 결과 난방. 적절 한 압력 안전 유리를 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 이 반응에 대 한 선박을 씰링의 목적은 가스 NH 3의 손실을 최소화 하기 위해입니다. 따라서, 느슨하게 초과 압력의 릴리스에 대 한 수 있도록 스 토퍼를 배치.
  3. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정화
    1. 25 mL 비 커에 5 g 양이온 교환 수 지를 일시 중단 (예: Dowex 50WX2 200-400 메쉬 (H + 형식) 10 ml 0.1 M HCl.
    2. 50 mL 용 저수지와 부착 (직경 10 m m, 높이 15 cm) 10 mL 열에이 슬러리를 로드 합니다. eluate 무색이 될 때까지 약 20-30 mL의 0.1 M HCl로 수 지를 세척.
    3. 단계 1.2.1에서에서 고립 된 녹색 반응 솔루션을 반환 합니다. 이 솔루션에 추가 2, 어느 시점에서 솔루션 색상이 갈색으로 변경 pH 조정에 집중 된 HCl.
    4. 부드럽게 수 지 위에 pipetting 단계 1.3.2에서에서 준비한 양이온 교환 수 지 열이 acidified 솔루션을 로드 합니다. 완전히 배수, 및 솔루션을 로드 계속 eluate 하자. 이 프로세스를 반복 하 여 전체 솔루션 추가 되었습니다. 수 지의 상단은 어두운 갈색/검은색 될 것입니다. 수 지에에서 약간 줄어듭니다.
    5. 사용 수 지의 상단을 충당 하기 위해 유리 구슬. 이 새로운 솔루션은 추가 될 때 방해 되 고에서 수 지를 방지 합니다.
    6. 20 mL의 1 M HCl와 열을 elute.
    7. Elute 1.5 m HCl 농도 증가 된 열 (≈ 50 mL). 노란 솔루션 열 내려와 시작 합니다. 2 m HCl 농도 증가 하 고 계속 방출는 eluate 무색이 될 때까지 또는 아주 창백한 녹색 황색. 150-200 mL의 총 볼륨이이 과정에 필요한 것.
    8. 2.5 m (20-50 mL) HCl 농도 증가. 분수에 시험관으로는 eluate를 수집 합니다. 3m HCl 늘립니다. 제품 열에서 녹색 갈색 솔루션으로 elute 것입니다. 레드 브라운 분수 또한 열에서와 서 시작할 수 있습니다. 이 분수는 산화 루 테 늄 빨강 불순물, 녹색 갈색 분수와 수영장 하지 마십시오.
  4. 특성화 및 검증 [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5의 순수성의
    1. 에서 분수의 모든 테스트 1.3.8 단계입니다. UV-마주의 분광학에 의해 이 작업을 수행 하려면 3 M NH3 2 mL에 주어진된 분수의 100 µ L을 추가 하 고 자외선에 대 한 분광학에 의해 분석. 분수 순수한 제품을 포함 하는 큰 흡 광도 밴드 있을 것 이다 360 nm와 600 덜 강렬한 흡 광도 nm. 480 또는 533 nm에서 흡 광도 산화 루 테 늄 빨강 및 루 테 늄 빨강 불순물, 각각.
    2. 수영장 분수 순수한 제품을 포함 하 고 회전 증발에 의해 건조에 대 한 해결책을 증발. 제품 그린 브라운 단색으로 고립 될 것입니다. 수확량은 일반적으로 5-15 mg (수율 10-20%)의 순서. 단일-결정, x 선 회절에 대 한 적합 한 화합물의 수성 해결책에 에탄올의 증기 확산에 의해 얻어질 수 있다.
    3. 확인 순도, pH 7.4 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 솔루션에 대 한 UV 분광학 화합물 분석. 순도 360의 농도의 비율을 복용 하 여 사정 될지도 모른다 nm와 600 nm 봉우리. 이 비율은 이다 순수한 화합물에 대 한 31. 불순 한 화합물에 대 한 비율이 작은 것.
    4. IR 분광학에 의해는 고체에 샘플을 분석합니다. 진단 밴드 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 c m -1, 815 cm -1에 있습니다. 일반적인 불순물 밴드 1762 c m -1와 1400 c m -1에서 볼 수 있습니다, 뉴 햄프셔의 특성 4 cl. 루 테 늄 빨강 1404 cm -1, 1300 c m -1, 1037 cm -1 800 cm -1에 악대에 의해 확인 될 수 있다.
  5. 형광 분광학에 의해 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제의 평가
    주의! 다음 절차는 포유류 세포를 사용합니다. 작업 생물 안전 수준 2 (BSL2) 연구에 대 한 인증 된 적절 한 층 류 두건에서 실행 되어야 한다.
    ​ 참고: [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5 참조 됩니다 [러]로이 단원의
    1. 버퍼링 확인 포함 하는 포도 당 생리 식 염 수 (BGSS)로 분석 결과 미디어입니다. BGSS 110 m KCl m, 1 mM KH 2 포 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 5mm 나트륨 호박, 30 µ M 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-구성 된 솔루션은 N, N N ', N '-tetraacetic 산 (EGTA). EGTA는 제외 하 고 모든 것을 결합, pH 7.4에 조정. EGTA를 추가 하 고 pH 7.4에 조정. 분석 결과 미디어의 50 mL에 대 한 추가 1 mg/mL 포도 당의 0.5 mL.
    2. Dulbecco에 500 cm 2 접시에 문화 HeLa 세포 ' s 수정이 글 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 5% CO 2 시드 100 mm 페 트리 접시에에서 성장 하는 37 ° C. 증폭 HeLa 세포에서 습도 인큐베이터에서 500 cm 2 페 트리 접시에 그들을. 큰 접시에 총 미디어 볼륨은 115 mL. 각 큰 접시 약 18 백만 셀, 두 형광 분광학 실험을 위해 이젠 그만 얻을 것입니다.
      1. 성장 셀 90-95%를 도달할 때까지 confluency. 미디어를 제거 하 고 15 mL pH 7.4 PBS 가진 세포를 씻어. PBS에서 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 15 mL를 추가 하 고 셀을 분리를 10 분 동안 품 어. 아래 팔 콘 튜브 라운드 14 mL 셀 전송
    3. 거꾸로 현미경으로 trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 셀의 총 수와 1.8 mL 볼륨 당 7.5 백만 세포에 도달 하는 데 필요한 미디어의 볼륨 계산 중간. 원심 5310 × g. Decant는 상쾌한 10 분에 대 한 셀을 BGSS의 계산 된 볼륨을 추가 합니다. 부드럽게 세포를 resuspend.
      1. 가 분석이 결과 대 한 순수한 물에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 1 m m H 2 O 및 H 2 o [Ru]. 재고 솔루션, 10 m m CaCl 2 칼슘 그린-5N에서에서 40 m m digitonin의 재고 솔루션을 준비, 1-3 m m 범위 수.
        ​ 참고: 칼슘 그린-5N은 빛에 민감한. 어둠 속에 저장 하 고 빛의 노출을 최소화.
    4. 506 nm와 532에서 방출 읽기에 흥분 하는 fluorimeter를 설치 37에서 제어 베트 홀더 nm ° C. 준비 볶음 바와 휠, 1.8 mL 세포 현 탁 액 위에, 1.8 µ L digitonin 솔루션, 3.6 1.5.2에서 아크릴 베트 & # 181. L 칼슘 그린-5N (솔루션), 그리고 9 µ L [러] (1 m m 재고 솔루션, 5 µ M 최종 농도)에 대 한. 세포는 fluorimeter에 15 분 동안 품 어.
      1. 원시 흡수 대신 여기/방출 비율으로 데이터를 읽을. 광원에서 동요와 관련 된 오류를 최소화 하는이 연습.
      2. 셀의 응답에 CaCl 2의 추가의 효과 측정 하는 [루]의 부재에서 첫 샘플 분석 수행.
      3. 1.5.4에 설명 된 설정으로 fluorimeter에 시작 분석. 약 2 분 안정 방출 기준을 설정 하 고 CaCl 2 (10 µ M 최종 농도)의 1.8 µ L를 추가 합니다. 방출 강도 CaCl 2의 추가 시 즉시 증가 하 고 칼슘 이온 입력은 미토 콘 드리 아 분의 과정을 통해 다음 부패 합니다. 감퇴가 완료 될 때까지 기다립니다 (≈ 5 분). [러] 치료 하지 않을 셀의 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 응답을 확인 하려면 추가 칼슘 boluses 추가.
    5. 다른 멧에 포함 된 5 µ M [Ru] 반복 실험 1.5.4.3에서 위에서 설명한 대로. 억제제, 존재 방출 강도 증가, 그러나 부패 하지 것 이다. 이 관측 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관을 차단 하는 것을 의미 한다..

결과

이 메서드는 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] Cl2, 시작의 합성에 설명 합니다는 잘 알려진 ruthenium(III) 시작 소재입니다. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 IR 분광학, 3200 c m-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1, 798 cm-1 (

토론

미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] 합성된 Cl2, 잘 알려진 ruthenium(III) 수 있습니다. 이 절차에 설명 된 대로 자료를 시작 합니다. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 의 합성은 쉽게 작은 어려움으로 달성 됩니다. 히드라 진에 RuCl3 16 h 교 반 후 수 화, 솔루션?...

공개

저자 공개할 게 없다

감사의 말

이 연구는 코넬 대학에 의해 지원 되었다. 이 작품은 코넬 센터의 시설에 대 한 재료 연구 공유, NSF MRSEC 프로그램 (그랜트 DMR-1120296)을 통해 지원 되는 사용 했다. S.R.N.는 NSF 대학원 연구 장학금 (그랜트 DGE-1650441) / 닥터 데이브 Holowka를 통해 칼슘 실험 지원을 인정합니다. 모든 의견, 결과, 결론 또는 권고가이 자료에서 표현은 저자 (들)의 고 반드시 국립 과학 재단의 의견을 반영 하지 않습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Ruthenium Trichloride hydratePressure Chemical3750
Concentrated hydrochloric acidJ.T. Baker9535
Concentrated ammonium hydroxideMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Calcium Green 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Sodium SuccinateAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlucoseAldrichG5000
200 Round bottom flaskChemGlassCG-1506-14
Glass stopperChemGlassCG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirsCustom - similar to Chemglass columnsSimilar to CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Round bottom Falcon tubesFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 petri dishesCorning431110
Trypan blueThermoFisher Scientific15250061
HemacytometerAldrichZ359629
Acrylic CuvettesVWR 58017-875
UV-Vis spectrometerAgilent Model Cary 8454 
SpectrofluorimeterSLM Model 8100C
IR spectrometerBruker Hyprion FTIR with ATR attachment
CentrifugeALC Model PM140R
Inverted light microscopeVWR 89404-462

참고문헌

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