التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Summary

ويصف هذا البروتوكول مفصلاً transcranial التحفيز الكهربائي موضع العظم الصدغي للتحقيق في الآثار القصيرة الأجل والطويلة الأجل للتحفيز الكهربائي transcranial في الانتقال بحرية الفئران.

Abstract

Transcranial التحفيز الكهربائي (الامتحانات) نهج قوية وبسيطة نسبيا تصطبغ تؤثر على نشاط الدماغ أما عشوائياً أو بطريقة تشغيل الحدث حلقة مغلقة. على الرغم من أن العديد من الدراسات تركز على الفوائد المحتملة والآثار الجانبية للامتحانات في أدمغة صحية ومرضية، إلا أنه لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة الأساسية بشأن إليه العمل للحفز. ولذلك، هناك واضحة تحتاج لأسلوب قوي واستنساخه لاختبار حدة والآثار المزمنة لقسم التدريب والامتحانات في القوارض. يمكن الجمع بين قسم التدريب والامتحانات مع التقنيات السلوكية، والكهربية، والتصوير العادية للتحقيق في الشبكات العصبية في الجسم الحي. غرس أقطاب transcranial التحفيز لا يفرض قيودا إضافية على التصميم التجريبي بينما يوفر أداة متعددة الاستخدامات، ومرونة التعامل مع نشاط الدماغ. هنا نقدم بروتوكول تفصيلاً، خطوة بخطوة لاختلاق وزرع أقطاب transcranial التحفيز للتأثير على نشاط الدماغ بطريقة مقيدة وقتيا لأشهر.

Introduction

Transcranial التحفيز الكهربائي (الامتحانات) أسلوب منهجي قيماً للتأثير على نشاط الدماغ بطريقة مقيدة وقتيا. اعتماداً على حجم وموضع من أقطاب التحفيز، قسم التدريب والامتحانات يمكن أن تؤثر على كميات كبيرة من الدماغ وانترين السكان العصبية تصطبغ^1،،من²³. Transcranial التحفيز التيار المباشر هو وافق الفعل طبيا لعلاج اضطراب الاكتئاب الرئيسي^4،5، والعديد من الدراسات تركز على إظهار آثار transcranial التحفيز المعرفي في البشر^{6 , 7}-علاوة على ذلك، واعدة وأبلغ النتائج فيما يتعلق بإمكانيات قسم التدريب والامتحانات في السيطرة على نوبات الصرع^،من⁸⁹.

وعلى الرغم من الأبحاث المكثفة، لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة بشأن إليه مفصلة للعمل، والآثار الجانبية المحتملة، ونتائج طويلة الأجل لتطبيق هذا الأسلوب^10،،من¹¹¹². ولذلك، من المهم وضع بروتوكول قوية، واستنساخه للتحقيق في آثار الامتحانات في نماذج حيوانية. نظراً لأن الكثير من الاضطرابات (مثلاًوالاكتئاب والصرع وانفصام الشخصية) يمكن التحقيق على نطاق واسع إلا في الحيوانات مستيقظا، وطبيعة هذه الظروف الطبية عادة ما تتطلب علاجاً طويل الأمد، ونحن تقديم بروتوكول المزمن غرس أقطاب transcranial في الفئران. الطريقة المعروضة هنا يمكن استخدامها في الدراسات السلوكية أو يمكن دمجها مع غرس أقطاب التسجيل (أي، أسلاك، تحقيقات السيليكون، أقطاب جوكستاسيلولار) أو مع windows الجمجمة المزمن للتجارب الكهربية والتصوير الدراسات، على التوالي. استناداً إلى تصميم تجريبي، يمكن أن يكون توقيت المحفزات العشوائية أو تشغيل الحدث منبهات سلوكية محددة، أو بصمات الكهربية للدماغ خاصة الدول (المضبوطات، الذبذبات ثيتا)^{8، 11 , 13}.

من المهم أن نذكر أنه على النقيض من النهج البشرية المستخدمة حاليا، الذي يستخدم تجسيدا لأقطاب توضع على الجلد، هنا نعرض أسلوب الذي يستخدم حق غرس تحت الجلد على سطح العظم الصدغي، منذ الفئران بالكاد تتسامح مع أي شيء يوضع على الجلد الذي يمكن الوصول إليه بسهولة باستخدام الكفوف.

وتمشيا مع مبادئ الاستبدال، والحد، والصقل، وبسبب الطبيعة المزمنة لغرس، يساعد هذا الأسلوب لتقليل عدد الحيوانات، حيث يمكن توظيف كل الحيوانات في ظروف تجريبية مختلفة لأشهر، مما يسمح استخدام عدد أقل من الحيوانات لاختبار فرضيات مختلفة.

في هذه الدراسة، ونحن توفير بروتوكول transcranial التحفيز الكهربائي التصنيع (الشكل 1A-ب) تفصيلاً، خطوة بخطوة وإثبات المزمنة غرس هذه الأقطاب على عظام الصدغي البالغ من العمر ستة أشهر ذكر لونغ-إيفانز الفئران.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقا لتوجيهات "مجلس الجماعات الأوروبية" (ECC 86/609) وأقرتها "اللجنة الأخلاقية" "البحوث الحيوانية" في ألبرت سزنت-Györgyi الطبية والصيدلية مركز جامعة سيغيد (الرابع عشر/218/2016).

1-تصنيع أقطاب التحفيز

1. لجعل التحفيز واحد إزالة القطب، قطع ست قطع طويلة 10 سم من أسلاك ربط الهاتفي مصغرة، 2 سم من الكسوة في نهاية واحدة، و 1 سم في الطرف الآخر.
2. تطور اثنين من الكابلات معا وجندي منهم إلى جانب مقشرة أقصر.
3. يكتسب قطاع التغليف الشريط ثلاثة من أي الدوائر المتكاملة مع حالة سوت-353.
4. غرزة الأسلاك الملتوية من خلال ثلاثة ثقوب للحزمة. ينبغي أن يكون الجزء مقشرة أطول من الأسلاك في التجاويف للحزمة. وضع الكابلات بحيث في نهاية المادة العازلة تمشيا مع حافة الثقوب.
5. وضع الأسمنت الأسنان على الثقوب لإصلاح الأسلاك.
   تنبيه: يجب أن يكون الأسمنت الأسنان الكثيفة ما يكفي لتجنب تسرب في التجويف الحزمة.
6. بمجرد الأسمنت طدت (الحد الأدنى 10 دقيقة)، انعكاس الحزمة ووضع طبقة رقيقة من superglue في حفرة لتشكيل ختم محكم نحو الأسمنت المليئة بالثغرات. تجنب الالتصاق الأسلاك مقشرة.
7. تطور الكابلات معا على الجانب مقشرة أقصر وجندي منهم (الشكل 1A).
8. الاستيلاء على الجزء مقشرة أطول من الأسلاك بطرف الملقط غرامة ولفه حول لهم، والتفاف عليها في التجاويف (الشكل 1B). قطع كبل الزائدة، إذا لزم الأمر.

2-تصنيع أقطاب تسجيل

1. جعل تسجيل واحد شهد الكهربائي الثلاثي (الشكل 1-د)، قطع قطعة طويلة سم واحد من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ تستخدم الدوارة فائقة السرعة. إزالة fin من طرفي الأنبوب بإبرة حادة، وضمان أن الأنبوب نفاذية تماما ونظيفة من الحطام.
   ملاحظة: لا تستخدم كماشة، حيث أنها سوف تشوه الأنبوب.
2. ثني pin مباعدة مجلس مطلية بالذهب يبلغ طولها 3 سم شكل حامل ي-شكل الحد أدنى. قطع ساقه أطول من الشكل 'ي'، ولحام معا نعود بالشكل الأصلي لجعل مشتركة قابلة للفصل بين الجزء طويل الخطي، الذي سيعقد بالجهاز ستيريوتاكسيك، والشكل 'ش'، والتي سوف تعقد مسرى، والعمل كنقطة اتصال بترسيخ . الصق الأنبوب والساق أقصر من صاحب 'ي' معا. الصق بعض أشرطة طويلة 1 سم إضافية، إذا لزم الأمر، لتحقيق الاستقرار.
3. قطع 3 قطع من الأسلاك الكهربائي طويلة 2.5 سم مع الفولاذ المقاوم للصدأ، أظهرت المقص. تأكد من أن قطع واضحة وحادة، والعزل غير سليمة على السطح الدائري للسلك الكهربائي. تأكد أيضا من أن تلميح قطع عازمة ليس بسبب القوة المطبقة. منحنى 1 أو 2 ملم في نهاية واحدة من كل من الأسلاك في زوايا مختلفة (مثلواحد على التوالي اليسرى، واحد 45 ° وزاوية واحدة) لجعلها مميزة.
4. ملء الأنبوب بالأسلاك، واختيار تباعد مناسب من أقطاب للتجربة (مثلاً، الميدانية المحلية القشرية المحتملة (طابعات الحجم الكبير) والمصدر الحالي الكثافة (CSD) التسجيل، نتوء الموصى به من نصائح الأسلاك من افتتاح الأنبوب: 4.5 مم، 4.1، و 3.7 ملم، على التوالي). ملاحظة الأسلاك التي تناظر فيها عمق للحفاظ على نظام قناة مناسبة.
5. مجرد محاذاة إلى اليمين بجوار بعضها البعض الأسلاك ومتوازية مع الأنبوب، لإصلاح الأسلاك الكهربائي، ضع قطره واحدة من السائل superglue في كلا طرفي الأنبوب بإبرة حادة. تأكد من أن تتدفق الغراء الأنبوب نظراً لتأثير الشعرية، ولكن ليس نحو مواقع التسجيل في نهايات بارزة.
6. تعد هيئة واجهة قطب مع ميكروكونيكتور الصحيحة متوافقة مع نظام التسجيل لاستخدامها.
7. إدخال نهايات الأسلاك غير المسجلة، وبنت في الثقوب المجلس واجهة القطب المقابل للقناة التسجيل المطلوب. عندما تكون جميع الأسلاك في الموقف، ودفع دبابيس ذهبية في الثقوب بالملقط.
   ملاحظة: دبابيس الذهب قد تكون ثابتة في مكانها باستخدام أسمنت الأسنان، ولكن في معظم الحالات، أنها مستقرة بدرجة كافية حتى بدون هذه الخطوة السلامة.

3-التخدير

1. وضع الحيوان في دائرة تحريض تخدير مختومة وملء مع 4-5% إيسوفلوراني في الهواء الطبي 2 لتر في الدقيقة.
2. عند الجرذان راقد، إزالة الحيوان من الدائرة ووضعه في إطار ستيريوتاكسيك مع قطعة آنف تهوية مناسبة.
3. تعيين مستوى isoflurane إلى 2 في المائة، على الرغم من أن معدل تدفق الهواء ينبغي أن تظل كما هي. التحقق من مستوى للتخدير. إذا كان هناك غياب منعكس سحب مخلب ردا على معسر، تستمر، وإلا يزيد عمق التخدير.
4. مراقبة والحفاظ على درجة حرارة الجسم في الفئران في 37 ± 0.5 درجة مئوية مع نظام رصد هوميوثيرميك. تطبيق معالجة تجميعية مرهم البارافين في العينين لمنع جفاف القرنية. كرر هذا الإجراء خلال عملية جراحية عدة مرات، إذا لزم الأمر.
5. تحت الجلد حقن الأتروبين 0.3 مغ/كغ لتجنب تكوين المخاط في الخطوط الجوية. كرر هذا الإجراء كل أربع ساعات في حالة العمليات الجراحية أطول. مراقبة التنفس وضبط المبخر، إذا لزم الأمر.

4-غرس التحفيز وتسجيل كهربائي

ملاحظة: اﻷوتوكﻻف كل ما يلزم الجراحية الصكوك واتباع القواعد العامة أسيبسيس والملاءمة بعناية أثناء الإجراء بأكمله. تجنب لمس المناطق نونستيريلي خارج منطقة العمليات الجراحية. تزج الأقطاب في الكحول الاثيلي (70 في المائة) لمدة 30 دقيقة قبل غرس.

1. إزالة معظم الشعر من فروة الرأس مع ماكينة قص شعر. تطبيق كريم مزيل الشعر في فروة الرأس، وتنتشر بشكل متساو على السطح، وانتظر بضع دقائق. استخدام ملعقة لإزالة بلطف الكريم والشعر المتبقية. يشطف الجلد بالماء، ثم بمطهر.
2. حقن ليدوكائين 1-2% (لا تتجاوز جرعة إجمالية من 7 مغ/كغ) تحت الجلد لتخدير الجلد. تطبيق قطره واحدة من الطبيب البيطري مرهم للعيون (مثلاً، البارافين).
3. جعل دقيق وشق السهمي طويلة (~ 2 سم) في خط الوسط مع مشرط، من الجبين في الرقبة. تشريح الأنسجة بما في ذلك السمحاق من الجمجمة، ثم استخدام الملقط ازميل أو الأسنان تنظيف المنطقة الواقعة بين cristae العظام الصدغي اثنين. الاحتفاظ بالجمجمة كشفها بواسطة تراجعه تشريح الجلد باستخدام لدغ الأربعة.
4. بلطف ضع ملاقط غرامة بين حافة حادة من العظم الصدغي والعضلات وتفصل بينهما. جعل حركات التسوية لفضح كجزء كبير من سطح كبير من العظم الصدغي ممكن، ويفضل أن تكون من حافة عظم قذالي إلى طائرة خيوط coronal، دون إلحاق الضرر بالعضلات.
5. ضع بيتيمبورالي الكامشات للحفاظ على عظام الصدغي مكشوف.
6. شطف سطح الجمجمة مع 1-2 مل 3 ٪ ح₂س_2، ثم يغسل مع 1-2 مل من الماء.
7. أيردري سطح العظام الصدغي بعناية فائقة، والتخلص من الرطوبة بالعصي العين. اختبار ما إذا كان يصلح أقطاب التحفيز على سطح الجمجمة العمودي تنظيفها (يجب أن تكون الحافة العليا للتحفيز الكهربائي تمشيا مع حافة كريستا العظم الصدغي). إعادة ضبط لدغ والكامشات أو تشكيل أقطاب التحفيز مع مقص، إذا لزم الأمر.
8. ملء التجاويف لتحفيز كهربائي مع اليكتروكوندوكتيفي هلام ووضع طبقة رقيقة من الغراء على حافة أقطاب كهربائية.
9. ضع مسرى التحفيز على السطح الجاف للعظم الصدغي مع حركة دقيقة واحدة، وأنه عقد بقوة في المكان لمدة دقيقة واحدة مع ملاقط غرامة. تأكد من أن لا رطوبة على اتصال بالغراء. باتاكا بالعصي العين، إذا لزم الأمر.
   تنبيه: في حالة عدم الاستقرار أي القطب هو من ذوي الخبرة، إزالته. بعد تنظيف العظام، كرر هذه الخطوة مع قطب تحفيز جديدة.
10. وضع الأسمنت الأسنان على حواف مسرى التحفيز، بينما هو جفت الرطوبة تسرب الأنسجة بالعصي العين باستمرار. تغطية مسرى التحفيز كله مع الأسمنت.
11. وبعد تصلب تماما الأسمنت، كرر هذه الخطوات على الجانب كونترالاتيرال.
12. بعض الحفر في جميع أنحاء الجمجمة لترسيخ مسامير. محرك مسامير مصغرة في الثقوب ووضع الأسمنت الأسنان أكثر منهم. استخدام حفر قطرها أصغر ~ 10% الرأس مقارنة بقطر المسمار.
13. تبعاً للغرض من هذه التجارب، لحام موصل إلى نهايات الكابلات، ووضعه على السطح، وتغطي بالأسمنت، أو مواصلة غرس أقطاب تسجيل والألياف الضوئية أو تعد نافذة الجمجمة على الجمجمة. في هذه الحالة الأخيرة، لحام الموصلات وترسيخها للبناء إلا في النهاية. في حالة الحاجة للمدى الطويل المتزامنة تسجيلات قسم التدريب والامتحانات وطابعات الحجم الكبير، زرع توائم القطب المذكور بدلاً من الأسلاك واحد.
    ملاحظة: يسمح هذا الإعداد لإزالة مشترك وضع التحفيز المشغولات الحرفية⁸. للاطلاع على تفاصيل تسجيل زرع قطب كهربائي، راجع البروتوكولات السابقة^14،15.
14. تغسل الأنسجة المعرضة تماما بمطهر. حقن ليدوكائين 1-2% (لا تتجاوز جرعة إجمالية من 7 مغ/كغ) تحت الجلد.
15. ديبريدي حواف الجرح وإغلاقها مع خيوط توقف بسيطة حول الموصل/عملية الزرع. تطهير الجرح مع بوفيدون.
16. حقن 5 ملغ/كغ كاربروفيني تحت الجلد. كرر هذه العملية إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مسكنات أخرى مطابقة المتطلبات التي حددها المجلس إذن الأخلاقية المحلية.
17. تعليق التخدير والإفراج عن إيربارس ونوسيبيسي، ووضع الحيوان في قفص التعافي بعد العملية الجراحية يستعيد وعيه.
18. التأكد من أن الحيوان تحت إشراف وثيق خلال الساعات الأولى بعد العملية الجراحية. مواصلة رصد منطقة الزرع بشكل دوري.
    ملاحظة: هذا الحيوان لا ينبغي أن تترك غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. بيت الحيوان على حدة حتى الشفاء التام من الإجراء.

النتائج

يمكن أن يقترن غرس أقطاب التحفيز المزمن (الشكل 1B) غرس إضافية لتسجيل كهربائي (الشكل 1-د). هذه الإعدادات مناسبة لتشكيل الطلب على تسجيل ونظم التحفيز للتدخل في أنشطة محددة في الدماغ. نقدم هنا نتائج تمثيلية كشف الصرع مغلقة ونظام التدخل، ?...

Discussion

أن الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو الالتصاق من الحزمة الكهربائي على سطح العظم. في حالة إغلاق غير لائق، تتشكل فجوة بين الأقطاب والعظام، وندبا الثانوية يمكن أن تنمو لتصبح هذه الفجوة، مما يقلل من الجودة للتحفيز. يجب أن يكون سطح العظام جافة تماما خلال خطوات الشائكة على الحزمة، وفي حا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanoacrylate liquid	Henkel	Loctite 401
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 454
Wire for stimulation electrodes	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire
Board spacer	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
Connector	E-tec Interconnect	P2510I-02
Tape packaging for stimulation electrodes	Nexperia	74HC1G00GW	Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used
Grip Cement Industrial Grade	Caulk Dentsply	675571 (powder) 675572 (solvent)
Electroconductive gel	Rextra	ECG Gel
Recording electrode wire	California Fine Wire Co.	.002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire
Ultrafine scissors	Hammacher Instrumente	Stainless HSB 544-09
Stainless steel tube	Vita Needle Company	29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug
High speed rotary saw	Dremel	Model # 395
Rotary saw holder	Dremel	Model # 220
Rotary saw cut-off wheel	Dremel	Model # 409
Ocular sticks	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta Ocular Sticks
Wet disinfectant	Egis	Betadine
Dry disinfectant	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
Drilling machine	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
Anchoring screws	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS