Estimulación eléctrica transcraneal crónica y grabación Intracortical en ratas

Resumen

Este protocolo detallado describe la colocación del electrodo de estimulación transcraneal en el hueso temporal para investigar los efectos a corto y largo plazo de la estimulación eléctrica transcraneal en mover libremente las ratas.

Resumen

Estimulación eléctrica transcraneal (TES) es un enfoque potente y relativamente sencillo difusamente influenciar la actividad cerebral al azar o en forma activada por eventos cerrado. Aunque muchos estudios se centran en los posibles beneficios y efectos secundarios de TES en cerebros sanos y patológicos, todavía hay muchas preguntas abiertas fundamentales sobre el mecanismo de acción de la estimulación. Por lo tanto, existe una clara necesidad de un método reproducible y robusto para probar la aguda y los efectos crónicos de TES en roedores. TES pueden combinarse con técnicas conductuales, electrofisiológicas e imagen regulares para investigar redes neuronales in vivo. La implantación de electrodos de estimulación transcraneal no impone restricciones adicionales en el diseño experimental mientras que ofrece una herramienta versátil y flexible para manipular la actividad cerebral. Aquí proporcionamos un protocolo detallado, paso a paso para fabricar y de implante de electrodos de estimulación transcranial para influir en la actividad cerebral de manera temporal restringida durante meses.

Introducción

Estimulación eléctrica transcraneal (TES) es un enfoque metodológico valioso para influir en la actividad cerebral de manera temporal limitada. Dependiendo del tamaño y la colocación de los electrodos de estimulación, puede afectar a volúmenes grandes del cerebro y arrastrar poblaciones neuronales difusamente^1,2,3. Estimulación por corriente directa transcraneal es ya médicamente aprobada para el tratamiento del trastorno depresivo mayor^4,5y muchos estudios enfocan mostrando los efectos cognitivos de la estimulación transcraneal en los seres humanos^{6 , 7}. Además, prometiendo resultados se informaron con respecto al potencial de TES en el control de las crisis epilépticas^8,9.

A pesar de la intensa investigación, todavía hay muchas preguntas abiertas sobre el mecanismo detallado de acción, efectos secundarios y el resultado a largo plazo de la aplicación de este método^10,11,12. Por lo tanto, es críticamente importante tener un protocolo robusto, reproducible para investigar los efectos de TES en modelos animales. Dado que muchos trastornos (p. ej., depresión, epilepsia y esquizofrenia) sólo pueden ser investigados exhaustivamente en animales despiertos, y la naturaleza de estas enfermedades generalmente requieren tratamiento a largo plazo, proporcionamos un protocolo para la crónica implantación de electrodos de transcranial en ratas. El método presentado aquí puede ser utilizado para estudios de comportamiento o puede combinarse con la implantación de electrodos de grabación (es decir, los cables, sondas de silicona, juxtacellular electrodos) o con windows craneales crónicos para los experimentos electrofisiológicos y proyección de imagen estudia, respectivamente. Dependiendo del diseño experimental, el tiempo de los estímulos puede ser aleatorio o evento desencadena señales conductuales específicos, o las características electrofisiológicas del cerebro particular Estados (convulsiones, las oscilaciones de la theta)^{8, 11 , 13}.

Es importante mencionar que a diferencia del enfoque humano utilizado actualmente, que utiliza una encarnación de electrodos colocados sobre la piel, a continuación os mostramos un método que emplea la derecha implantación subcutánea sobre la superficie del hueso temporal, desde ratas apenas tolerar cualquier cosa sobre su piel que es fácilmente accesible utilizando sus patas.

Conformidad con los principios de reemplazo, reducción y refinamiento, debido a la naturaleza crónica de la implantación, este método ayuda a reducir el número de animales, ya que cada animal puede ser reclutado en diferentes condiciones experimentales durante meses, permitiendo el uso menos animales para probar varias hipótesis.

En el presente estudio proporcionar un protocolo detallado, paso a paso del electrodo de estimulación transcraneal fabricación (figura 1A-B) y demostrar la implantación crónica de electrodos de estos sobre los huesos temporales de seis meses de edad hombre rata Long-Evans.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos son conforme a las directivas del Consejo Europeo de comunidades (86/609 ECC) y han sido aprobados por el Comité de ética para la investigación Animal a Albert Szent-Györgyi médicos y centro farmacéutico de la Universidad de Szeged (XIV/218/2016).

1. fabricación de los electrodos de estimulación

1. Para hacer una estimulación electrodo, cortar seis piezas largas de 10 cm de cables de conexión de miniatura, quitar 2 cm de revestimiento en un extremo y 1 cm en el otro extremo.
2. Tuerza dos cables y soldarlos en el lado pelado más corto.
3. Adquirir una franja de tres envases cinta de cualquier circuito integrado con el caso de SOT-353.
4. Coser los cables retorcidos por los tres agujeros del paquete. El segmento ya pelado de los cables debe estar en las cavidades del paquete. Coloque los cables de modo que el extremo del aislamiento está en línea con el borde de los agujeros.
5. Poner el cemento dental en los agujeros para fijar los cables.
   PRECAUCIÓN: El cemento dental debe ser lo suficientemente denso para evitar fugas en la cavidad del paquete.
6. Una vez que el cemento solidificado (mínimo 10 minutos), el paquete del tirón y poner una capa delgada de pegamento en el agujero para formar un sello hermético hacia el cemento poroso. Evitar pegar los cables pelados.
7. Trence los cables en el lado pelado corto y soldarlos (figura 1A).
8. Agarrar el segmento ya pelado de los cables con la punta de unas pinzas finas alrededor del rodillo y Envuélvalas en las cavidades (figura 1B). Cortar el cable sobrante, si es necesario.

2. fabricación de los electrodos de la grabación

1. Para hacer una grabación vio electrodo trío (figura 1-D), cortar un trozo largo de un cm de tubo de acero inoxidable usando alta velocidad rotatoria. Quitar la aleta de los extremos del tubo con una aguja afilada y asegúrese de que el tubo está limpio de escombros y totalmente permeable.
   Nota: No utilice alicates, como distorsionan el tubo.
2. Un pin de separador de tablero chapado en oro con una longitud mínima de 3 cm para formar un soporte J-forma de la curva. Corte la pata más larga de la forma de 'J' y la soldadura juntos para recuperar la forma original para hacer un empalme desmontable entre la parte larga lineal, que se llevará a cabo por el dispositivo estereotáctica, y la forma de 'U', que sostenga el electrodo y servir como un punto de anclaje . Unir el tubo y la pierna más corta del soporte 'J'. Pegue algunas barras largas de 1 cm adicional, si es necesario, para la estabilidad.
3. Cortar 3 trozos de cables de electrodo largo de 2,5 cm con acero inoxidable, tijeras ultrafinos. Asegúrese de que es un corte claro y agudo, y el aislamiento está intacto en la superficie circular del alambre electrodo. También asegúrese de que la punta del corte no es doblada debido a la fuerza aplicada. Doble 1 o 2 mm en un extremo de cada uno de los cables en diferentes ángulos (p. ej., un recto de izquierda, uno de 45 ° y un ángulo recto) para hacerlos distinguibles.
4. Llenar el tubo con los cables, elegir un adecuado espaciamiento de los electrodos para el experimento (por ejemplo, para cortical local campo potencial (LFP) y registro de densidad (CSD) de fuente actual, el saliente recomendado de las puntas de los cables de la apertura del tubo: 4.5 mm, 4,1 mm y 3,7 mm, respectivamente). Tenga en cuenta que cable corresponde a qué profundidad para mantener un orden de los canales adecuados.
5. Una vez los cables alinean derecha al lado del otro y son paralelos con el tubo, para fijar los cables de electrodo y coloque una gota de pegamento líquido en ambos extremos del tubo con una aguja afilada. Asegúrese de que el pegamento está fluyendo en el tubo debido al efecto capilar, pero no hacia los sitios de grabación en los extremos salientes.
6. Preparar una placa de interfaz de electrodo con un micro-conector adecuado compatible con el sistema de grabación para ser utilizada.
7. Introducir los extremos sin grabación, doblados de los cables en los agujeros de la placa de interfaz de electrodo correspondiente al canal de grabación que desee. Cuando todos los cables están en posición, empuje los pasadores de oro en los hoyos con las pinzas.
   Nota: Pernos de oro pueden fijarse en su lugar con cemento dental, pero en la mayoría de los casos, es bastante estable incluso sin este paso de seguridad.

3. anestesia

1. Coloque el animal en una cámara de inducción de la anestesia sellada y rellena con 4-5% de isoflurano en aire médico de 2 L/min.
2. Cuando la rata está reclinada, retire el animal de la cámara y colocarlo en un marco estereotáxicas con un pedazo de nariz de adecuada ventilación.
3. Establecer el nivel de isoflurano al 2%, aunque la tasa de flujo de aire debe seguir siendo el mismo. Compruebe el nivel de anestesia. Si hay una ausencia del reflejo de retirada de la pata en respuesta a pellizcos, continuar, de lo contrario incrementar la profundidad de la anestesia.
4. Vigilar y mantener la temperatura corporal de la rata a 37 ± 0,5 ° C con un sistema de monitoreo homeotérmicos. Aplique una gota del ungüento de parafina en los ojos para evitar la desecación de la córnea. Repita este procedimiento durante la cirugía varias veces, si es necesario.
5. Inyectar por vía subcutánea 0,3 mg/kg de atropina para evitar la formación de moco en las vías respiratorias. Repetir este proceso cada cuatro horas en caso de cirugías más. Controlar respiración y ajuste el vaporizador, si es necesario.

4. implantación de la estimulación y electrodos de grabación

Nota: Autoclave todo lo necesario quirúrgico instrumentos y seguir atentamente las normas generales de asepsia y antisepsia durante todo el procedimiento. Evite tocar áreas no estériles fuera del área quirúrgica. Sumerja los electrodos en el alcohol etílico (70%) durante 30 minutos antes de la implantación.

1. Eliminar la mayor parte del pelo del cuero cabelludo con un cortapelos. Aplicar la crema depilatoria en el cuero cabelludo, extenderlo uniformemente sobre la superficie y espere unos minutos. Use una espátula para eliminar suavemente la crema y el resto del cabello. Enjuague la piel con agua, luego con desinfectante.
2. Inyectar la lidocaína 1-2% (no exceder una dosis total de 7 mg/kg) por vía subcutánea para adormecer la piel. Aplicar una sola gota de ungüento veterinario para los ojos (por ejemplo, parafina).
3. Hacer un fondo y una incisión sagital de largo (~ 2 cm) en la línea media con un bisturí, desde la frente hasta el cuello. Disecar los tejidos incluyendo el periostio del cráneo, luego con un cincel o diente pinzas limpiar el área entre los cristae de los dos huesos temporales. Mantenga el cráneo expuesto por retraer la piel disecada con cuatro bulldogs.
4. Suavemente Coloque Pinzas finas entre el borde escarpado del hueso temporal y los músculos y separarlos. Hacer movimientos de jigging para exponer como gran parte de la gran superficie del hueso temporal como sea posible, preferentemente desde el borde del hueso occipital en el plano de las suturas coronal, sin dañar los músculos.
5. Coloque retractores bitemporally para mantener los huesos temporales expuestos.
6. Enjuague la superficie del cráneo con 1-2 mL de 3% H₂O_2, luego lo lave con 1-2 mL de agua.
7. Seque cuidadosamente la superficie de los huesos temporales, absorber la humedad con palos oculares. Compruebe si los electrodos de estimulación se adapta sobre la superficie del cráneo vertical limpio (el borde superior del electrodo de estimulación debe estar en línea con el borde de la cresta del hueso temporal). Vuelva a ajustar los bulldogs y los retractores o forma de los electrodos de estimulación con tijeras, si es necesario.
8. Llenar las cavidades de la estimulación de los electrodos con electroconductor gel y colocar una capa delgada de pegamento en el borde de los electrodos.
9. Coloque el electrodo de estimulación sobre la superficie seca del hueso temporal con un movimiento preciso y sosténgala firmemente en lugar por un minuto con una pinza fina. Asegúrese de que ninguna humedad esté en contacto con el pegamento. Recoja con bastones oculares, si es necesario.
   PRECAUCIÓN: en caso de que cualquier inestabilidad del electrodo se vive, quítelo. Después de limpiar el hueso, repita este paso con un nuevo electrodo de estimulación.
10. Poner cemento dental sobre los bordes del electrodo de estimulación, mientras que la humedad que se escapa de los tejidos se secó continuamente con palos oculares. Cubrir el electrodo de estimulación todo con cemento.
11. Después de que el cemento está completamente endurecido, repita estos pasos en el lado contralateral.
12. Algunas perforaciones en todo el cráneo para el anclaje de tornillos. Inserte los tornillos de miniatura en los agujeros y poner cemento dental sobre ellos. Uso taladro de un diámetro de ~ 10% en comparación con el diámetro del tornillo de cabeza.
13. Dependiendo de la finalidad de los experimentos, soldar un conector a los extremos de los cables, colocar en la superficie y cubierta con cemento, o continuar la implantación de los electrodos de la grabación y las fibras ópticas o preparar una ventana craneal sobre el cráneo. En este último caso, la soldadura de los conectores y anclarlas a la construcción solamente en el final. En caso de necesidad de grabaciones simultáneas a largo plazo del TES y LFP, implante a los tríos de electrodos antes mencionados en lugar de los solos alambres.
    Nota: Esta configuración permite la eliminación del común modo estimulación artefactos⁸. Para los detalles de implantación de electrodos de grabación, ver anteriores protocolos^14,15.
14. Lavar los tejidos expuestos abundantemente con desinfectante. Inyectar la lidocaína 1-2% (no exceder una dosis total de 7 mg/kg) por vía subcutánea.
15. Desbridar los bordes de la herida y cierre con suturas interrumpidas simples alrededor del conector/implante. Desinfectar la herida con povidona yodada.
16. Inyectar carprofene de 5 mg/kg por vía subcutánea. Repetir este proceso si es necesario.
    Nota: Otros analgésicos pueden utilizarse emparejar los requisitos establecidos por la junta local permiso ético.
17. Suspender la anestesia, suelte la visera del yelmo y earbars y poner el animal en una jaula de recuperación postoperatoria para recuperar la conciencia.
18. Asegúrese de que el animal esté bajo supervisión estrecha durante las primeras horas postoperatorio. Continuar monitorear periódicamente la zona del implante.
    Nota: El animal no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Casa el animal individualmente hasta la recuperación completa del procedimiento.

Resultados

La implantación de electrodos de estimulación crónica (figura 1B) puede combinarse con la implantación adicional de grabación de electrodos (figura 1-D). Tales ajustes son adecuados para formar demanda sistemas de registro y estimulación para interferir con las actividades específicas del cerebro. Aquí presentamos resultados representativos de una epilepsia de circuito cerrado sistema de detección e inte...

Discusión

El paso más crítico de este protocolo es el pegado del paquete de electrodos en la superficie del hueso. En caso de cierre incorrecto, se forma un espacio entre los electrodos y el hueso, y tejido cicatricial secundario puede crecer en este espacio, que disminuye la calidad de la estimulación. La superficie del hueso debe estar completamente seca durante los pasos de que se pega en el paquete, y en el caso de experimentar inestabilidad de los electrodos, debe ser eliminado y reemplazado con un nuevo paquete para obten...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanoacrylate liquid	Henkel	Loctite 401
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 454
Wire for stimulation electrodes	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire
Board spacer	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
Connector	E-tec Interconnect	P2510I-02
Tape packaging for stimulation electrodes	Nexperia	74HC1G00GW	Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used
Grip Cement Industrial Grade	Caulk Dentsply	675571 (powder) 675572 (solvent)
Electroconductive gel	Rextra	ECG Gel
Recording electrode wire	California Fine Wire Co.	.002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire
Ultrafine scissors	Hammacher Instrumente	Stainless HSB 544-09
Stainless steel tube	Vita Needle Company	29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug
High speed rotary saw	Dremel	Model # 395
Rotary saw holder	Dremel	Model # 220
Rotary saw cut-off wheel	Dremel	Model # 409
Ocular sticks	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta Ocular Sticks
Wet disinfectant	Egis	Betadine
Dry disinfectant	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
Drilling machine	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
Anchoring screws	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS