تصور "ديناميات ليجنيفيكيشن" في النباتات مع "انقر فوق الكيمياء": "وسم المزدوج" هو النعيم!

Summary

وقد وضعت النعيم، بروتوكول وضع العلامات مزدوجة لدراسة ديناميات ليجنيفيكيشن،. استخدام مونوليجنول الاصطناعية الصحفيين ومجموعة متسلسلة من سباك وكواك بيورثوجونال انقر فوق ردود الفعل، وهذه المنهجية يمهد الطريق إلى التحليل المتعمق للعوامل التي تنظم في نشوء حيوي من ليجنينس في بﻻنتا.

Abstract

اللجنين هو أحد البوليمرات البيولوجية الأكثر شيوعاً على هذا الكوكب وعنصرا رئيسيا من الكتلة الحيوية الليجنوسليولوزيه. هذا البوليمر الفينولية تلعب دوراً حيويا في الهيكلية والحمائية في التنمية وفي الحياة من النباتات العليا. على الرغم من أن الآليات المعقدة التي تنظم ليجنيفيكيشن العمليات في فيفو بشدة تأثير تثمين الصناعية للعديد من المنتجات المشتقة من النباتات، المجتمع العلمي لا يزال أمامها طريق طويل للذهاب إلى فك لهم. في سير عمل ثلاث خطوات بسيطة، تمكن بروتوكول وضع العلامات المزدوجة المقدمة في هذه الوثيقة الدراسات بيويماجينج من ليجنيفيينج بنشاط مناطق الأنسجة النباتية. الخطوة الأولى تتمثل في إدراج الأيضية لاثنين من المستقلين الصحفيين الكيميائية، الأمهات البديلات مونوليجنولس الأصلية اثنين التي تؤدي إلى اللجنين وحدات ح وز. بعد دمج في تزايد البوليمرات اللجنين، ثم يسمى كل مراسل على وجه التحديد مع تحقيقاتها الفلورسنت عبر مجموعة متسلسلة من سباك/كواك بيورثوجونال انقر فوق ردود الفعل. جنبا إلى جنب مع أوتوفلوريسسينسي اللجنين، هذا النهج يؤدي إلى توليد خرائط التعريب ألوان من خشبين داخل جدران الخلايا النباتية بالأسفار [كنفوكل] مجهرية ويوفر معلومات مكانية دقيقة على وجود أو عدم وجود نشط ليجنيفيكيشن إليه بمقياس الأنسجة النباتية وخلايا وطبقات مختلفة من جدار الخلية.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين، برزت استراتيجية مراسل الكيميائية كمنهجية خطوتين قوية للتحقيق في ديناميات ووظائف الجزيئات الحيوية المشفرة غير وراثيا. ^{1 , 2 , 3} في هذه الاستراتيجية تناظرية اصطناعية من بيوموليكولي للفائدة مع تعديل صغير – مراسل الكيميائية – يتم أولاً استقلاب بالحي، ومن ثم تحقيق الكيميائي (مثلاً.، فلوروفوري للأسفار تصوير مجهرية [كنفوكل]) يرتبط تساهميا المراسل إدراجها عن طريق الكيمياء انقر فوق بيورثوجونال. أن التحقيق يجب أن تستجيب بسرعة وعلى وجه التحديد مع التعديل الكيميائي أدخلت حين خاملة لأي من الجزيئات الحيوية الموجودة في نظام المعيشة. من نواح عديدة، وهذا الأسلوب يتغلب على القيود المفروضة على تقنيات بيوكونجوجيشن المشتركة من خلال استخدام ليجيشنز الكيمياء انقر محددة للغاية وبالتالي توفير الفرصة لتعقب نواتج الأيض أو بيوماكروموليكوليس التي كانت سابقا غير قابل للوصول في المعيشة نظم^4،،من⁵⁶.

وعلى الرغم من شعبية هذا الأسلوب قوية في الخلايا البكتيرية والحيوانية سريعة النمو، تقارير تصف استخدامه في علم الأحياء النباتية القليلة من المدهش والآن بين^7،،من^{8109،، 11،12}. كنا اهتماما خاصا بتطبيق هذه الاستراتيجية في المصانع لدراسة تكوين اللجنين، أحد البوليمرات البيولوجية الأكثر شيوعاً على هذا الكوكب وعنصرا رئيسيا من الكتلة الحيوية الليجنوسليولوزيه. ^{13 , 14} اللجنين هو بوليمر الفينولية التي تلعب دوراً حيويا في الهيكلية والحمائية في التنمية وفي الحياة من النباتات العليا.

وهو عموما يتألف من ثلاثة 4-هيدروكسيفينيلبروبانويد مويتيس: ح (فهيدروكسيفينيل), G (جاياسيل) ووحدات S (سيرينجيل) على التوالي المستمدة من ثلاثة 'مونوليجنولس' (فكوماريل، كونيفيريل، وسينابيل الكحول) التي وتوليفها عبر ممر فينيلبروبانويد في السيتوبلازم للخلية (الشكل 1). تتأكسد بعد تصديرها إلى جدار الخلية، مونوليجنولس إلى الجذور التي بيروكسيداسيس أو لاككاسيس بعد ذلك أنها تمر بتفاعلات كيميائية بحتة اقتران الراديكالية بلمرة للبوليمرات اللجنين، وصف عملية ليجنيفيكيشن. ^{15 , 16} على الرغم من أن ليجنينس تأثيراً قويا تثمين الصناعية كثير المشتقة من النباتات المنتجات، والمجتمع العلمي لا يزال أمامها طريق طويل للذهاب إلى فك الآليات المعقدة التي تنظم ليجنيفيكيشن.

رقم 1: عملية ليجنيفيكيشن في الخلايا النباتية- مونوليجنولس بيوسينثيسيزيد من فينيلألانين في سيتوسول. تتأكسد بعد تصديرها إلى جدار الخلية، مونوليجنولس إلى الجذور التي بيروكسيداسيس أو لاككاسيس بعد ذلك أنها تمر بتفاعلات كيميائية بحتة اقتران الراديكالية بلمرة للبوليمرات اللجنين، وصف عملية ليجنيفيكيشن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

على الرغم من تقارير عن استخدام ردود الفعل بيورثوجونال لتحليل جليكان العديدة،^2،،من³¹⁷ بهم تطبيق الأمثلة على أنواع أخرى من الجزيئات الحيوية أقل. كان رائدا استخدام الكيمياء بيورثوجونال لأغراض بيويماجينج اللجنين إلا في الآونة الأخيرة من قبل توبيماتسو et al. ⁸ في نبات التمويل لتوفير معلومات حول إدماج كونيفيريل الأمهات البديلات الكحول إلى البوليمر اللجنين حيث أنها تشكل وحدات ز،^،من⁸⁹ مما يدل على إثبات المبدأ الذي مراسل الكيميائية استراتيجيات قابلة للتطبيق في هذا السياق. استخدام كواك كانت تتجلى أيضا في استخدام مشتق الكحول كونيفيريل مختلفة قليلة في الشهر في وقت لاحق بوكوفسكي وآخرون. ⁹ ولكن اللجنين يحتوي أيضا على وحدات ح وق وفهم أعمق لعملية ليجنيفيكيشن يتطلب المزيد من المعرفة عن كيفية إدراج كل من مونوليجنولس في البوليمر وما هي العوامل التي يمكن التحكم في تشكيلها. التطورات الجديدة في هذا الميدان يعتمدون حاليا على تطوير منهجيات فعالة لتعقب الصحفيين الكيميائية متعددة في نفس الوقت في الأنظمة الحية. على الرغم من أن بعض المواد في جليكانس قد أرست الأساس في السنوات الأخيرة^{18،19،20،،}من²¹²²، وصف النهج المزدوج يظل تحديا رئيسيا في كيمياء بيورثوجونال. إذا كان بروتوكول انقر فوق تسمية مفردة استنساخه من الصعب تطوير، ثم مزدوج وسم النهج التي تتطلب التحسين في ترادف اثنين بعضها بعضا بيورثوجونال متوافق مع ردود الفعل على اثنين من الصحفيين الكيميائية منفصلة أصعب. تستخدم الأمثلة القليلة التي كانت رائدة في هذا الجانب مزيجاً من سلالة تشجيع أزيد-ألكاين سيكلواديشن (سباك) والطلب الإلكترونية العكسية الكين-تيترازيني ديلز-الدر (دا_{للاستثمارات}) ردود الفعل لدراسة جليكانس في الخلايا الحيوانية. ومع ذلك، كنا نظن أن بيورثوجوناليتي من رد فعل داينف قد لا يمكن ضمانها في هذا التطبيق نظراً للسمات الهيكلية من اللجنين (التي تتألف من مونومرات الغنية بالإلكترونات المستبدلة سيناميل-نوع التي يمكن أن تتفاعل مع إلكترون-الفقراء دينيس مثل المجسات تيترازيني المستخدمة في التفاعلات داينف)، وأن هذا قد يولد وسم غير محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب رد فعل_{للاستثمارات} دا مقابض الكيميائية التي يصعب صناعيا بالوصول، فضلا عن كونها ضخمة ومحبتين مما زاد من إمكانية أن معدل التأسيس والنقل و/أو الترجمة للمادة الكيميائية مراسل في فيفو قد تتأثر. كما رأينا أن الجانب الأخير بصفة خاصة في حالة اتباع نهج انقر فوق كيمياء لدراسة ليجنيفيكيشن، اخترنا اتجاه مختلف وتطويرها باستخدام "بيورثوجونال ربط التصوير المتسلسل استراتيجية" (النعيم) مزيج من سيكلواديشن أزيد-ألكاين سترينبروموتيد (سباك) والنحاس حفزت أزيد-ألكاين "سيكلواديشن" (كواك) المجراة في. ²³

ردود الفعل هذه اثنين هي في الواقع فوق بيورثوجونال الرئيسية اثنين من ردود الفعل التي استخدمت حتى الآن، وأخص في الأمثلة القليلة من اللجنين التصوير التي نشرت مؤخرا. ^{8 , 9} استراتيجيتنا التوسيم المزدوج يمكن استخدام moiety أزيد شأن مراسل مونوليجنول واحد والكاين طرفية الأخرى، اثنين من مقابض الكيميائية ط) أونريكتيفي نحو الهياكل ذات الصلة بيولوجيا والثاني) جداً صغيرة الحجم (الشكل 2 ). كنتيجة لذلك، يتم تصغير أثر هذه التعديلات الاصطناعية في الخصائص الفيزيائية بيوموليكولي قيد الدراسة وبالتالي تقليل الاختلافات الممكنة بين ركائز مونوليجنول الطبيعية وغير الطبيعية من حيث النقل و معدلات ميتابوليزيشن أثناء الخطوة إدراج الأيضية. على الرغم من أن الجمع بين سباك وكواك تبدو بديهية جداً للوهلة الأولى، أنها معرفتنا فقط المثال الثاني وسم المزدوج باستخدام هذه الاستراتيجية والتطبيق الأول على هياكل خلاف جليكانس. ^{12 , 23}

رقم 2: بليس وسم استراتيجية مزدوجة- الكيميائية الصحفيين ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه هي النظير المعلمة مونوليجنولس ح وز الأم. أولاً إدماجها في البوليمرات اللجنين المتزايد لجدر الخلايا عن طريق تغذية خارجية (الخطوة 1). سيكلوكتيني-وأزيد-فونكتيوناليزيد المسابير الفلورسنت ثم هي متصلة تسلسلياً للصحفيين مدمجة من بيورثوجونال انقر فوق الكيمياء: رد فعل سباك (الخطوة 2) محددة للغاية لوحدات ح_{من الألف إلى الياء} وتبعتها (رد فعل كواك الخطوة 3) التي محددة لوحدات ز_كيه (الخطوة 3)، مما يتيح التعريب محددة لكل الصحفيين بشكل مستقل في نفس العينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

نحن أولاً المصممة والتحقق من صحة مراسل حمونوليجنول معلم أزيد_{من الألف إلى الياء} (مركب الكحول-كوماريل ف) والسلائف من وحدات اللجنين ح، وثم وضعت استراتيجية التوسيم المزدوج النعيم الذي يتم استخدامه بالتزامن مع وذكرت سابقا معلم ألكاين ز_كيه،⁹ (مركب الكحول كونيفيريل) والسلائف من اللجنين ز وحدات. في هذا البروتوكول استنساخه طورت واختبرت في الكتان، ويتحقق من أنواع النباتية هامة اقتصاديا، إدراج الأيضية المزدوج ح_{من الألف إلى الياء} و ز_كيه في اللجنين أولاً قبل متسلسلة سباك/كواك وضع العلامات. هنا، هي وحدات_{من الألف إلى الياء} حالمعلمة أولاً المسمى على وجه التحديد عن طريق ربط سباك من فلوروفوري فونكتيوناليزيد سيكلوكتيني، تليها كواك بوساطة ربط التحقيق الفلورسنت الثانية على المعلمة ز_كيه الوحدات. هذا الأسلوب تم استخدامه للتحقيق في ديناميات العمليات ليجنيفيكيشن داخل جدران الخلايا النباتية ويمكن تطبيقها في فيفو لوقف المقاطع العرضية، تعيش ينبع فضلا عن شتلة من الأنواع النباتية المختلفة.

Protocol

ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا السائلة والصلبة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الوسائط مسبقاً كما هو موضح في الجدول 1 تكميلية.

1-مصنع الثقافة

1. الثقافة لنباتات الكتان شهرا 2
   1. زرع بذور الكتان (Linum usitatissimum L.) في الأواني البلاستيكية باستخدام السماد بوتينغ.
   2. ينمو الكتان في دوائر النمو عند 22 درجة مئوية مع كبيرة من ح 16/8 ح/نهاراً.
   3. تجهيز النباتات مع دعم عمودي بعد شهر 1 وتنمو حتى أنهم 2 شهرا.
2. ثقافة 2 منذ أسابيع شتلات الكتان
   1. التفاف 12 بذور الكتان في قطعة قماش الجبن وإصلاحها مع شريط المطاطي جعل حزمة.
      ملاحظة: إجراء الخطوات التالية تحت ظروف معقمة تحت غطاء دخان الاندفاق الصفحي.
   2. ضع حزمة البذور في زجاجة زجاج 250 مل يعقم سابقا.
   3. إضافة مل 70% 70 EtOH في الزجاجة ولطف يقلب لمدة 1 دقيقة.
   4. بعناية إزالة EtOH والصفق بينما تترك الباقة في الزجاجة.
   5. إضافة 100 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 2% ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق.
   6. إزالة الحل تحت كلوريت الصوديوم بواسطة والصفق بينما تترك الباقة في الزجاجة.
   7. كرر الخطوات 1.2.5-1.2.6.
   8. إضافة 100 مل الماء المعقم عالي النقاوة ويقلب لمدة 1 دقيقة.
   9. كرر الخطوة 1.2.8 3 مرات، على زيادة وقت الشطف كل شطف (5، 10 و 15 دقيقة).
   10. الحارة الصلبة ½ MS المتوسطة ومن أجل ذلك في مربع ثقافة النباتية عقيمة إلى ارتفاع 2 سم وندعه يبرد حتى التجميد.
   11. دقة وضع كل البذور على الصلبة المتوسطة استخدام الملقط العقيمة.
   12. قم بإغلاق مربع العقيمة.
   13. تحويل المربع إلى دائرة نمو عند 22 درجة مئوية مع كبيرة من ح 16/8 ح/نهاراً وتنمو بذور الكتان لمدة أسبوعين.

2-التمثيل الغذائي إدراج الصحفيين الكيميائية

ملاحظة: يتم عرض ثلاثة نماذج تجريبية أدناه: وسم ط) الأيض الجذعية المقاطع العرضية وينبع ثانيا) كله والشتلات النباتية الثالث). ويرد كل بروتوكول لتكرار البيولوجية واحدة وكميات يمكن تكييفها وفقا لعدد replicates البيولوجية المطلوبة. وتعد الحلول مونوليجنول من حلول الأسهم التي يتم إجراؤها على النحو المبين في الجدول 2 قبل التجربة. ويمكن تخزين الحلول الأسهم عدة أشهر في-20 درجة مئوية. ح_{من الألف إلى الياء}: ز_كيه أو نسب H:G ويمكن تعديلها لتناسب جميع تصاميم تجريبية مصنوعة خصيصا.

1. إدراج مراسل الكيميائية في المقاطع العرضية الجذعية الكتان شهرا 2
   1. إعداد 300 ميليلتر مراسل كيميائية محلول يحتوي على 10 ميكرون من ز_كيه و 10 ميكرون من ح_{من الألف إلى الياء} في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
   2. دوامة ح_{من الألف إلى الياء}/ز_كيه الحل وأنه نقل إلى بئر واحدة من صفيحة 48-جيدا مع ميكروبيبيتي.
   3. إعداد 300 ميليلتر مراقبة سلبية محلول يحتوي على 10 ميكرون من ز و 10 ميكرون من ح في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
   4. دوامة ح/ز الحل وأنه نقل إلى بئر ثانية من نفس لوحة 48-جيدا.
   5. قطع ساق نبات الكتان 2 شهرا في 10 سم فوق سطح التربة باستخدام شفرة حلاقة جديدة.
   6. دقة إعداد 50 المقاطع العرضية مستعرضة مرفوعة من الساق باستخدام شفرة حلاقة (حوالي 150-250 ميكرون سميكة).
   7. فورا مكان في المقاطع العرضية في السائلة المتوسطة ½ MS العقيمة في زجاج مشاهدة.
   8. افحص بصريا وحدد المقاطع العرضية كلها سليمة وتوزيعها عشوائياً 10 منهم في شغلها جيدا مع ح_{من الألف إلى الياء}/ز_كيه الحل.
   9. كرر الخطوة 2.1.8 لشغلها جيدا مع ح/ز الحل (كالمراقبة السلبية).
   10. كرر الخطوة 2.1.8 ثالث مليئة أيضا 300 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد (كخلفية عنصر التحكم لضبط خط الأساس fluorescence أثناء معالجة البيانات اللاحقة من الصور مجهرية [كنفوكل]).
   11. احتضان اللوحة في ضوء مستمر في دائرة نمو عند 20 درجة مئوية ح 20.
   12. إزالة الحل مونوليجنول في كل بئر ميكروبيبيتي.
   13. إضافة 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لكل بئر ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق وإزالة هذا الشطف الحل مع ميكروبيبيتي. كرر 4 مرات وانتقل إلى بليس وسم فورا (المادة 3).
2. مراسل الكيميائية إدماج 2 شهرا الكتان كله ينبع
   1. تحضير محلول مراسل كيميائية 5 مل يحتوي على 10 ميكرون من ز_كيه و 10 ميكرون من ح_{من الألف إلى الياء} في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
   2. دوامة ح_{من الألف إلى الياء}/حلز_كيه ونقل ذلك إلى اختبار زجاج 20 سم عالية أنبوب مع ماصة.
   3. تحضير محلول مراقبة سلبية 5 مل يحتوي على 10 ميكرون من ز و 10 ميكرون من ح في السائل معقمة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   4. دوامة ح/ز الحل ونقل ذلك إلى اختبار زجاج 20 سم عالية أنبوب.
   5. إعداد أنبوب اختبار زجاج ثالثة التي تحتوي على 5 مل متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد (كخلفية عنصر التحكم لضبط خط الأساس fluorescence أثناء معالجة البيانات اللاحقة من الصور مجهرية [كنفوكل]).
   6. قطع ساق نبات الكتان 2 شهرا في 10 سم فوق سطح التربة باستخدام شفرة حلاقة جديدة. تجاهل جذر النظام والجزء السفلي من الساق، والمضي قدما إلى الخطوة التالية مع الجزء العلوي من الساق النباتية.
   7. تزج قاعدة جذع قطع كامل في أنبوب يحتوي على ح_{من الألف إلى الياء}/ز_كيه الحل. ضع الجذعية في الحضانة وحلها فورا بعد إزالة جذر النظام بغية منعها من التجفيف.
      ملاحظة: إذا كان الأسلوب يطبق على النباتات الأصغر/كبار السن و/أو الأنواع الأخرى، يجب تعديل حجم مونوليجنول الحلول وفقا للحجم عمر النبات والقطر في الساق.
   8. إرفاق الجذعية لدعم عمودي للحفاظ على التوالي.
   9. ختم أنبوب الزجاج مع بارافيلم لتجنب تبخر المحلول.
   10. كرر الخطوات 2.2.6-2.2.9 للحصول على نموذج المراقبة السلبية مع ح/ز الحل.
   11. كرر الخطوات 2.2.6-2.2.9 لنموذج عنصر تحكم خلفية الأسفار التي تحتوي على متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   12. احتضان كل الجذعية ح 20 في ضوء استمرار استخدام ضوء نيون.
   13. بعد 20 ساعة إدراج الأيضية، إزالة الجذعية المحتضنة في ح_{من الألف إلى الياء}/حلز_كيه وشطفه مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   14. قطع وتجاهل الجزء السفلي 1 سم الساق باستخدام شفرة حلاقة، ثم قم بإعداد اسطوانة ارتفاع 1 سم من قاعدة جذع المتبقية.
   15. إعداد المقاطع 20 عرضية مرفوعة العرضية (حوالي 150-250 ميكرون سميكة) من هذه الاسطوانة ووضعها مباشرة في مشاهدة زجاج مليئة بمتوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد بعناية.
   16. وضع 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد في بئر واحدة للوحة 48-جيدا.
   17. افحص بصريا وحدد المقاطع العرضية كلها سليمة وتوزيعها عشوائياً 10 منهم في البئر مليئة بحل مرض التصلب العصبي المتعدد ½.
   18. كرر الخطوات 2.2.13-2.2.17 للمراقبة السلبية الجذعية المحتضنة مع الحل ح/ز .
   19. كرر الخطوات 2.2.13-2.2.17 لوقف التحكم الخلفية الفلورية المحتضنة مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   20. بعناية إزالة الحل في كل بئر ميكروبيبيتي.
   21. إضافة 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لكل بئر ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق وإزالة هذا الشطف الحل مع ميكروبيبيتي. كرر 4 مرات وانتقل إلى بليس وسم فورا (المادة 3).
3. مراسل الكيميائية إدماج 2 منذ أسابيع الكتان الشتلات
   ملاحظة: الخطوات التالية جميعها تنفذ تحت ظروف معقمة.
   1. تحضير محلول مراسل كيميائية 2 مل يحتوي على 10 ميكرون من ز_كيه و 10 ميكرون من ح_{من الألف إلى الياء} في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
   2. دوامة ح_{من الألف إلى الياء}/حلز_كيه ونقل ذلك إلى اختبار 20 سم ارتفاع زجاج أنبوب مع ماصة.
   3. تحضير محلول مراقبة سلبية 2 مل يحتوي على 10 ميكرون من ز و 10 ميكرون من ح في السائل معقمة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   4. دوامة ح/ز الحل ونقل ذلك إلى اختبار 20 سم ارتفاع زجاج الأنبوبة.
   5. إعداد أنبوب اختبار زجاج 20 سم عالية ثالث الذي يحتوي على 2 مل متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد (كخلفية عنصر التحكم لضبط خط الأساس fluorescence أثناء معالجة البيانات اللاحقة من الصور مجهرية [كنفوكل]).
   6. دقة إزالة شتلات كتان منذ 2 أسابيع من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الصلبة باستخدام زوج طويل من ملاقط (الفرع 1.2. أعلاه).
   7. نقل بلطف الشتلات للأنبوب الذي يحتوي على ح_{من الألف إلى الياء}/حلز_كيه ، وضمان أن جذوره مغمورة في الحل.
   8. أغلق أنبوب زجاج مع غطاء بلاستيكي لتجنب التبخر.
   9. كرر الخطوات 2.3.6-2.3.8 لأنبوب مراقبة سلبية مع H/G الحل.
   10. كرر الخطوات 2.3.6-2.3.8 لأنبوب التحكم الخلفية الأسفار التي تحتوي على متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   11. احتضان كل الشتلات في ضوء مستمر في دائرة نمو ح 20 في 20 درجة مئوية.
   12. دقة إزالة الشتلات المحتضنة في ح_{من الألف إلى الياء}/حلز_كيه وشطفه مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   13. دقة إعداد المقاطع العرضية يدوي 20 (أبروكسيماتيفيلي 150-250 ميكرون سميكة) هيبوكوتيل.
   14. وضع 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد في بئر واحدة للوحة 48-جيدا.
   15. افحص بصريا وحدد المقاطع العرضية كلها سليمة وتوزيعها عشوائياً 10 منهم في البئر مليئة بحل مرض التصلب العصبي المتعدد ½.
   16. كرر الخطوات 2.3.12-2.3.15 للشتلة المراقبة السلبية المحتضنة مع الحل ح/ز .
   17. كرر الخطوات 2.3.12-2.3.15 للشتلة التحكم الخلفية الفلورية المحتضنة مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
   18. بعناية إزالة الحل في كل بئر ميكروبيبيتي.
   19. إضافة 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لكل بئر ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق وإزالة هذا الشطف الحل مع ميكروبيبيتي. كرر 4 مرات وانتقل إلى بليس وسم فورا (المادة 3).

3-الأسفار مزدوج وسم عينات النبات المقطع العرضي سباك وكواك

ملاحظة: بليس وسم البروتوكول مطابق لجميع النماذج التجريبية 3 (القسم 2).

1. تروج لها سلالة وسم أزيد-ألكاين سيكلواديشن (سباك)
   1. إعداد 1 مل محلول سباك يحتوي على 5 ميكرومتر شماعة دبكو₄-5/6-كاربوكسيرهوداميني 110 في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة. دوامة الحل والاحتفاظ بها في الظلام.
   2. بعد الغسيل النهائي إزالة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الخطوات البروتوكول إدراج الأيضية [2.1.13 أو 2.2.21 أو 2.3.19 حسب التصميم التجريبي الذي تم اختياره]، وإضافة 300 ميليلتر من الحل سباك الواحدة جيدا مع ميكروبيبيتي.
   3. درع لوحة 48-جيدا من الضوء التي تغطي برقائق الألومنيوم أو بوضعه في مربع.
   4. يحرك بلطف اللوحة على شاكر ميكانيكية ح 1 في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
2. حفزت النحاس وسم أزيد-ألكاين "سيكلواديشن" (كواك)
   1. تغسل كل جيدا 4 مرات كما هو موضح في الخطوة 2.1.13 مع الإبقاء اللوحة في الظلام.
   2. إعداد 1 مل محلول كواك يحتوي على 2.5 مم اسكوربات الصوديوم و 0.5 مم CuSO₄ ميكرومتر 5 5-طمره-شماعة₃-أزيد في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة. دوامة الحل والاحتفاظ بها في الظلام.
      ملاحظة: هذا الحل كواك يجب أن يكون طازج قبل الاستخدام ولا يمكن تخزين أكثر من بضعة أيام في 4 درجات مئوية.
   3. إزالة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد في كل بئر ومباشرة إضافة 300 ميليلتر من الحل كواك الواحدة وكذلك استخدام ميكروبيبيتي.
   4. يحرك بلطف اللوحة على شاكر ميكانيكية ح 1 في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
   5. إزالة الحل كواك باستخدام ميكروبيبيتي.
   6. استخدام ميكروبيبيتي، أضف ميليلتر 500 مللي ثانية ½، ضجة في الظلام لمدة 10 دقائق ثم إزالة هذا الحل الغسيل. كرر مرتين.
   7. إضافة 500 ميليلتر لحل ميوه والماء 7:3، وآثاره في الظلام ح 1 ثم إزالة الحل
      تنبيه: الميثانول سامة بتماس الجلد أو استنشاق، وتم تعيينه كمسرطن. يتطلب الانتفاع أغطية الأبخرة الكيميائية والقفازات.
   8. إضافة 500 ميليلتر من ½ مرض التصلب العصبي المتعدد، وآثاره في الظلام لمدة 10 دقائق ثم إزالة الحل. كرر 4 مرات.

4-تركيب العينات في المجهر الشرائح

1. 5 مكان قطرات من المتوسطة المتصاعدة على شريحة الميكروسكوب زجاجية.
2. إيداع بعناية كل ح_{من الألف إلى الياء}/ز_كيهمعلم شريحة على الشريحة.
3. تطبيق طلاء الأظافر على طرفي نقيض هما من الشريحة.
4. وتشمل الشريحة مع ساترة. كن حذراً لتجنب فقاعات الهواء.
5. قم بإزالة تركيب الزائدة المتوسطة باستخدام منشفة ورقية.
6. ختم العينة مع طلاء الأظافر على جميع الأطراف 4. واسمحوا مسمار الورنيش الجاف في درجة حرارة الغرفة (حوالي 30 دقيقة).
7. كرر الخطوات من 4.1-4.6 للمقاطع العرضية ح/ز مراقبة سلبية.
8. كرر الخطوات من 4.1-4.6 للتحكم الخلفية الفلورية المقاطع العرضية.
9. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى المراقبة تحت مجهر [كنفوكل].
   ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح استعدادا لعدة أسابيع إلى عدة أشهر حسب نوعية الإعداد. إذا كان هناك ملاحظة أخرى جديدة بعد التخزين، وضمان أن العينات لم جفت.

5-صورة اكتساب Fluorescence مجهرية [كنفوكل]

1. قم بتشغيل جميع الوحدات اللازمة لنظام الفحص المجهري [كنفوكل] بالترتيب الصحيح وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
2. حدد الهدف المنشود مع الفتحة العددية القصوى وتكييفها مع أطوال موجية الإثارة والانبعاثات (مثلاً، obj. 60 س، N.A. 1.2. قناة أوتوفلوريسسينسي: λ_تحويله 405 نانومتر، λ_م 450 نانومتر 25؛ قناة ح_{من الألف إلى الياء} سباك: λ_ت 488 نانومتر، λ_م 525 نانومتر 25؛ قناة ز_كيه كواك: λ_تحويله 561 nm, λ_م 595 nm 25؛ وضع تسلسلي).
3. حدد المعلمات المطلوبة لتوليد الصور في البرنامج (12 أو 16-بت المطلوبة، حجم بكسل تتكيف مع معيار نايكست).
4. ضع الشريحة ح_{من الألف إلى الياء}/G_كيه في مرحلة مجهر ووضع العينة تحت عدسة الهدف.
5. مراقبة والعثور على المنطقة المرغوبة من الأنسجة النباتية.
6. الحصول على صور ذات جودة عالية [كنفوكل] لمضاعفة المسمى/G_{من الألف إلى الياء}ح عينة_كيه .
   1. حدد الطائرة الفلورسنت الأكثر في محور ع.
   2. ضبط المكاسب، طاقة الليزر والإزاحة لتحقيق توزيع الإشارات الأمثل على طول نطاق مستوى رمادي كاملة لكل قناة (أوتوفلوريسسينسي، ح_{من الألف إلى الياء} و ز_كيه). ويجب تطبيق نفس المعلمات لجميع المقتنيات التالية.
   3. بدء الحصول على الصورة المحددة وقم بحفظ الملف. كرر لكل مجال ذي صلة عينة.
      ملاحظة: إعادة البناء Z-مكدس ثلاثي الأبعاد كما يمكن اكتساب إذا لزم الأمر.
7. استخدام نفس الإعدادات، الحصول على الصور من ليس تمييز عينة فقط المحتضنة في ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد مستوى أوتوفلوريسسينسي (الأسفار خلفية عنصر التحكم كما هو موضح في القسم 2).
8. استخدام نفس الإعدادات، الحصول على صور لعينات مراقبة سلبية المحتضنة مع مونوليجنولس الأصلية H/G لتحديد التصاق fluorophore غير محدد بالعينة.
9. تطبيق معالجة البيانات للصور المكتسبة بطرح الخلفية إشارات أوتوفلوريسسينسي في كل من ح/ز مراقبة سلبية الصور والصور _{من الألف إلى الياء}ح/G_كيه .

النتائج

باستخدام بروتوكول النعيم المقدمة التي تنطوي على النظير مونوليجنول الاصطناعية وبيورثوجونال فوق الكيمياء، فإنه من الممكن تصور ديناميات عملية ليجنيفيكيشن في النباتات الحية. خلافا للتقنيات المتبعة اللجنين أهداف التصور (مثل histochemical تلطيخ أو إيمونولوكاليزيشن أو أوتوفلوريسسينسي)، وهذا 'انقر نقراً مزدوجاً فوق' البروتوكول حصرا اللجنين أنتجت حيثياته أثناء إدراج الأيضية خطوة ويفرق من اللجنين الموجودة مسبقاً من العينة مع تصوير الخلوية ثلاثية القنوات بالأسفار [كنفوكل] مجهرية (الشكل 3). ح _{من الألف إلى الياء}-وحدات يتم الكشف عنها باستخدام موجات الإثارة والانبعاثات من شماعة دبكو₄-5/6-أدرجت كاربوكسيرهوداميني 110 الذي هو على وجه التحديد بالنقر فوق على مهام أزيد من جزيئات_{من الألف إلى الياء} حأثناء الخطوة سباك (λex 501 نانومتر/λ_م 526 نانومتر، قناة الأخضر)، بينما ز_كيه-وبالمثل يتم الكشف عن الوحدات عند أطوال موجية مميزة المسبار أزيديفلوور 545 الذي هو على وجه التحديد بالنقر فوق على العلامات ألكاين الطرفية مدمجة من ز _كيه أثناء الخطوة كواك (λex 546 نانومتر/λ_م 565 نانومتر، الأحمر قناة)؛ القناة الثالثة يناظر اللجنين الموجودة من قبل، التي يتم الكشف عنها باستخدام به أوتوفلوريسسينسي المتأصلة في 405 نانومتر (القناة الزرقاء). هذا النهج يؤدي إلى توليد خرائط التعريب ألوان من خشبين داخل جدران الخلايا النباتية التي توفر معلومات مكانية دقيقة عن وجود أو عدم وجود إليه نشطة ليجنيفيكيشن بين أنسجة مختلفة من جهاز (الشكل 3 ألف )، بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الأنسجة ذاتها (الشكل 3-ج) وفي طبقات مختلفة من الجدار من نفس الخلية (الشكل 3D). وبعبارة أخرى، هذه المنهجية يسمح لنا بإبراز وتعريب المواقع 'النشط' ليجنيفيكيشن (ح_{من الألف إلى الياء} وقنوات_كيه ز) على وجه التحديد بالتفريق لهم من مناطق حيث شكلت اللجنين في سابق مرحلة التنمية النباتية (قناة أوتوفلوريسسينسي). وباﻹضافة إلى ذلك، يتعزز حساسية التقنية هائلة بالمقارنة مع أوتوفلوريسسينسي، ويمكن أن تكون كميات أصغر بكثير من اللجنين المركبة حديثا الكشف عن (الشكل 3B).

الشكل 3: التصوير من الصحفيين مونوليجنول أدرجت المواد الكيميائية في "ينبع الكتان". (أ) نصف مقطع مستعرضة المصنوعة من جذع الكتان، صورة أعيد بناؤها. (ب) عن قرب من الطبقات الأولى التفريق بين الخشب. غادر الفريق: أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق، 405 nm)، الفريق الأوسط: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق) والأسفار ح_{من الألف إلى الياء} (526 الخضراء، شمال البحر الأبيض المتوسط) القنوات، اللوحة اليمنى: دمج اللجنين أوتوفلوريسسينسي (أزرق) وز_كيه الفلورية (أحمر، 565 نانومتر) القنوات. يشير السهم إلى الجدار خلية مسماة أول من كامبيوم توضح زيادة حساسية بليس مقارنة مع أوتوفلوريسسينسي. (ج) التالي في خلية مختلفة الأنواع من الخشب الثانوي و (د) عن قرب على خلايا الخشب الثانوية التي توضح الاختلافات التوسيم في طبقات مختلفة من نفس الخلية جدار. غادر الفريق: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق) والأسفار ح_{من الألف إلى الياء} (526 الخضراء، شمال البحر الأبيض المتوسط) القنوات، الفريق الأوسط: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق) والأسفار ز_كيه (565 أحمر، شمال البحر الأبيض المتوسط) القنوات، حق لوحة: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق)، ح_{من الألف إلى الياء} (الأخضر) وقنوات fluorescence ز_كيه (أحمر). ويرد التعريب المشارك ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه باللون الأصفر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

استراتيجيات مراسل الكيميائية مثل الأسلوب بليس المعروضة هنا أو إجراءات تسمية واحدة نشرتها سابقا توبيماتسو et al. ⁸ وبالتالي السماح لدراسة أكثر دقة من أساليب موجوداً مسبقاً مثل المناعية-أو تلطيخ histochemical حين يجري بسيطة للغاية لتنفيذ. على سبيل المثال، يوضح الشكل 4 أن كثافة إشارة ح_{من الألف إلى الياء}/ز_كيه التأسيس في الألياف تراتشيدس/سفن (قدم) من الخشب الثانوي الكتان مرتفع جداً في جدران الخلايا القليلة الأولى من كامبيوم ولكن ينخفض تدريجيا في الخلايا القديمة. هذا التشكيل الجانبي هو معاكس أوتوفلوريسسينسي ويشير إلى أن ليجنيفيكيشن الأقصى سريعاً للغاية التوصل إلى في طبقات الخلية الأولى قدم اثنين أو ثلاثة من كامبيوم. وفي المقابل، رأي (ص) الخلايا تظهر على مواصلة ليجنيفيكيشن لكثير من مراحل لاحقة لتنميتها ح_{من الألف إلى الياء}/ز_كيه التأسيس ثابت أكثر بكثير في الجدران لكافة الخلايا من كامبيوم للب. ليس من المستغرب أن أنواع الخلايا متر و R عرض ديناميات ليجنيفيكيشن يتناقض، نظراً لأنواع الخلايا هذه الأدوار البيولوجية المختلفة مع الاختلافات المرتبطة بها في برامجها الإنمائية. FTs هي أنابيب ممدود في الواقع أن تنضج ويموت سريعاً، وترك الخلايا الفارغة الميت مع جدران سميكة ليجنيفيد التي تلعب أدواراً أساسية في دعم الميكانيكية والنقل الرأسي للمياه والمعادن، بينما خلايا الصفوف الضيقة للبحث والتطوير التي يؤلف الخشب أشعة على قيد الحياة في دولته ناضجة والوظيفية دون وجود جدران سميكة ليجنيفيد.

الشكل 4: إدراج مراسل مونوليجنول خلية على حدة في الخشب الكتان. عرض برايت-حقل [كنفوكل] مجهرية (A) من جزء من شريحة مرفوعة من جذع كتان. وردي (رأي حمة الخلايا, R) والأصفر (ألياف تراتشيد الخلايا، قدم) تشير الأسهم إلى متجهات تمتد من منطقة كامبيل تجاه لب ومسحها ضوئياً أوتوفلوريسسينسي اللجنين في 405 نانومتر (ب)، والأسفار ح_{من الألف إلى الياء} في 526 nm (ج) وز _كيه fluorescence في 565 نانومتر (د). (ه) عرض من الخشب الثانوي. غادر الفريق: دمج أوتوفلوريسسينسي (الأزرق)، اللجنين ح_{من الألف إلى الياء} (الأخضر)، ومجموعة_كيه قنوات الفلورية (أحمر). ويرد التعريب المشارك ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه باللون الأصفر. اللوحة اليسرى: التوضيح التخطيطي هيكل الخشب الثانوي في الساق الكتان. الخامس، والسفينة؛ متر، تراتشيد الألياف؛ R، رأي لحمه الخلية. وقد تم تعديل هذا الرقم من الأسد et al. ²³ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام اثنين من الصحفيين الكيميائية المميزة المطابقة لوحدات ح وز مع اثنين من ردود فعل بيورثوجونال في البروتوكول بليس المزيد من النتائج الكمية الحصول عليها. متعدد وسم استراتيجيات مثل بليس يمكن أن توفر أفكاراً إضافية في السيطرة على مونوليجنول نسب إدماج في ظروف مختلفة ويمكن أن تسهم في فك رموز عملية ليجنيفيكيشن بعيد المنال. إذا كانت النسب النسبية من مونوليجنولس ح، ز وق في ليجنينس في الواقع المتغير جداً وفقا للأنواع أو الأنسجة أو العمر أو الظروف البيئية للمصنع، لا تزال لا تماما مفهومة الآليات المعقدة التي تنظم هذا التشكيل. التكنولوجيا التوسيم المزدوج يمثل وسيلة قوية للتحقيق في بعض المعلمات التي تنظم تكوين اللجنين. على سبيل المثال، متفاوتة ح_{من الألف إلى الياء}: زنسبة_كيه مع بليس سمح لنا أن ندلل على أن تكوين اللجنين في أنسجة الخشب الثانوي مباشرة يتوقف على توافر مونوليجنول داخل جدران الخلية، بدلاً من التركيز على خصوصية البيروكسيديز/لاككاسي (الشكل 5).

الشكل 5: تأثير تفرخ أبواب الجذعية الكتان بنسب مئوية مختلفة من ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه. ح_{من الألف إلى الياء}: يتم إعطاء نسب % ز_كيهفوق كل عمود من الأرقام. أعلى: دمج القنوات ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه . أسفل: رسوم بيانية تبين fluorescence متوسط كثافة ح_{من الألف إلى الياء} و ز_كيه لنسب مختلفة في المائة. يتم التعبير عن القيم بمتوسط كثافة fluorescence يعني في مستويات الرمادي ± مقياس التنمية المستدامة. بار = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من الأسد et al. ²³ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويزرع الكتان لما الحائيه (BF) التي يتم استخدامها لتصنيع المنسوجات، أوراق فاخرة أو مواد مركبة صديقة للبيئة. جانبا مهما من على تثمين الصناعية هو أنها تحتوي على مستويات منخفضة جداً من اللجنين في جدرانها الخلية، التي تتميز بكثيف جداً S2/ز^19،طبقة ثانوية²⁴. يمكن تمييز بليس ليجنيفيكيشن ديناميات الاختلافات بين طبقات مختلفة من نفس الخلية جدار. يبين الشكل 6A مقصورة على أركان الخلية وجدار الخلية الابتدائية صفاحه الأوسط الحائيه بعض ولكن ليس كافة إدراج مراسل ح_{من الألف إلى الياء} و ز_كيه . الغياب التام ليجنيفيكيشن في الخلية الثانوية الجدار طبقة سميكة اللحاء الألياف حتى عند الصحفيين مونوليجنول الكيميائية مناشئ الموردة تكشف أن دولته هيبوليجنيفيد ينبع من عدم وجود بيئة جزيئية مناسبة أكسدة انزيماتيكالي بوساطة وإدماج مونوليجنولس في سلسلة بوليمر متنامية، وأنه ليس فقط بسبب تنظيم النسخي جينات تخليق الحيوي مونوليجنول كما سبق وذكرت²⁵. هذه الملاحظة أيضا يرتبط تماما مع الحقيقة أن البيروكسيديز الكتان الجينات حتى-ينظم في الأنسجة الجذعية الخارجي للمسخ الكتان الكيميائية lbf1 التي تمتلك الحائيه ليجنيفيد²⁶.

رقم 6: النعيم يسلط الضوء على الاختلافات الهيكلية أو طبقة محددة جدار الخلية. (أ) ترك الفريق: صورة مشرقة الميدانية قسم الجذعية الكتان. الدائرة تشير إلى حزمة ألياف. اللوحة اليسرى: قريبة في الحائيه. دمج قنوات ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه (مع ودون مشرق الميدان) تبين أن ليجنيفيكيشن يقتصر على أركان الخلية () وجدار الخلية الابتدائية صفاحه الأوسط بعض الحائيه. فرنك بلجيكي، ألياف اللحاء؛ الاسمية، لحمه الخلية؛ M، صفاحه الأوسط؛ ف، جدار الخلية الأولية؛ S1، والطبقة الأولى من جدار الخلية الثانوية؛ S2/ز، والثانوي طبقة/هلامية طبقة من جدار الخلية الثانوية. (ب) شريحة 2D والتعمير 3D من المكدس z [كنفوكل] التكبير الكتان الجذر endodermis المنطقة. وفي قطاع كاسباريان () يعرض أوتوفلوريسسينسي فقط ولا تتضمن ح_از أو ز_كيه. فلوروجرام المرتبطة بها يظهر ز_كيه/H_{من الألف إلى الياء} المضادة الارتباط: يرتبط الفلورية الخضراء عالية لإشارة حمراء منخفضة (اللحاء) والعكس بالعكس (endodermis). بيريسيكلي (ف)، Endodermis (ﻫ)، Cortex (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

أخيرا، هذه المنهجية اللونين يمكن أيضا تقديم معلومات قيمة عن 'الدولة ليجنيفيكيشن' من جدار الخلية هياكل فرعية في مراحل إنمائية مختلفة وفي مصنع الأجهزة عدا الجذعية. على سبيل المثال، endodermis من الكتان الجذور تتميز بوجود عصابة كاسباريان في جدرانه خلية شعاعي وعرضية خلال المراحل الأولى من التنمية. يمنع الماء والذوائب بالجذر من دخول سلبية من خلال أبوبلاست هذه الفرقة من بيوبوليمير مسعور، مصنوعة من سوبيرين و/أو اللجنين، ويفرض عليهم المرور عبر غشاء البلازما عبر مسار سيمبلاستيك مما يسهم في قدرات الامتصاص الانتقائي لجذور النباتات. عند تطبيقها على جذور الكتان، واستراتيجيتنا أظهرت أن ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه مدرجة في الجدران عرضية للخلايا اندوديرمال، وكذلك كما هو الحال في أجزاء من الجدران شعاعي حيث الفرقة كاسباريان غياب (الشكل 6B). ومع ذلك، الغياب التام لإدماج مراسل مونوليجنول في الفرقة كاسباريان نفسها تشير إلى أنها ناضجة في هذه المرحلة الإنمائية بينما الجدران الأخرى لا يزال الموقع كذلك بيوبوليمير ترسب. عرض ثلاثي الأبعاد أعيد بناؤها من كدسة z وضوح يجلب الفرقة كاسباريان للضوء. من المثير للاهتمام، على جدران بعض الخلايا القشرية المجاورة endodermis ثبت أيضا قادرة على دمج ح_{من الألف إلى الياء} تفضيلي (مما يشير إلى وجود اللجنين/صابرين في قشرة الجذر الكتان) لكن لا ز_كيه. وأظهر تحليل المشارك الترجمة ارتباط المضادة بين ح_{من الألف إلى الياء} وز_كيه، والتي توحي بوجود إليه هيكل/الانزيمية جدار الخلية المحددة في هذين النوعين من الخلايا المجاورة.

تكميلية الجدول 1: إعداد الصلبة ½ MS المتوسطة اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

تكميلية الجدول 2: إعداد الحلول الكيميائية مراسل الأسهم اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

كما ذكر آنفا، البروتوكول بليس التوسيم المزدوجة المعروضة في هذه الورقة أحد الأمثلة الأولى تركيبة سباك/كواك في فيفو^12،23. كل خطوة كان جيدا الأمثل، والتحقق من صحتها، وأنه من المهم جداً أن يحترم النظام فيها اثنين انقر فوق الكيمياء ردود فعل التوسيم تتم تسلسلياً (أي سباك أولاً، تليها كواك). ضوابط عبر كافة أظهرت أن كل خطوة وصفها محددة عندما يكون البروتوكول بليس التطبيقية²³ : القيام بخطوة سباك يؤدي أولاً إلى تشيموسيليكتيفي عالية وسم حمهام أزيد_{من الألف إلى الياء} فونكتيوناليزيد سيكلوكتيني فلوروفوري من خلال رد فعل [2 3 +] سيكلواديشن مع حركية سريعة. حالما يتم تمييزها وحدات ح_{من الألف إلى الياء} ، يمكن القيام الخطوة كواك مما يستلزم تفعيل ز_كيه الكينس محطة لتوليد وصلات تريازولي برد فعل مع التحقيق 545 فلور أزيد النحاس الأحادي حفزت. وفي المقابل، بالترتيب العكسي (أي، كواك أولاً، متبوعة سباك) لا ينبغي أن تستخدم كما أنها تؤدي إلى وحدة ز_كيه وح_{من الألف إلى الياء} اقتران الصليب، الذي يتنافس مع ربط فلوروفوري ويؤدي إلى خسارة درامية في إشارة . من المهم أيضا التشديد على ضرورة الخطوات الوسيطة الغسيل لتجنب تلطيخ غير محددة.

وقد أظهرنا أن لدينا طريقة يمكن تطبيقها على مختلف التجارب البيولوجية التصاميم. أولاً طبق بليس وسم البروتوكول للمقاطع العرضية مرفوعة من الكتان ينبع (حوالي 150-250 ميكرون سميكة) التي كانت سابقا قص والمحتضنة مع مونوليجنولس انقر فوق استعداد. على الرغم من أن هذا التصميم يتميز بتقليل الكميات اللازمة من مراسل الكيميائية (كما يتم تقليل حجم حاضنات) وتيسير إنتاج replicates الإحصائية، أنها ليست كذلك، صارما في حديثة، نظام في الجسم الحي ، وفي بعض الحالات، قد لا تعكس جميع جوانب الديناميات ليجنيفيكيشن الحقيقي الزمانية. في تصميم تجريبية ثانية، ولذلك نحن تكييف البروتوكول بليس لأسلوب الذي تم استخدامه مسبقاً لدراسة إدراج مونوليجنولس راديولابيليد في الصنوبر والجنكه²⁷. في هذا النهج، جذور وساق النبات تكون مفصولة ماديا وهي المحتضنة قاعدة الجذع كله في حل مونوليجنول بما قد يطلق عليه النهج 'إناء الزهور'. بعد مغادرة ينبع الوقت المطلوب (الحضانة)، المقاطع العرضية هي قص وبروتوكول النعيم أداء. هذا يسمح لنا بإظهار (ط) أن مونوليجنولس تعديل يتم نقلها عن طريق الجذعية الحية وأدرجت في تزايد البوليمرات اللجنين داخل جدران الخلية و (ثانيا) أن كان نمط التعريب أساسا مطابقاً للمقطع العرضي النهج. يتميز هذا النوع من التجربة المنجزة في مصنع لمعيشة حقيقية/خلية يعيش نهج السماح بتجارب أطول وأكثر الدراسات المتعمقة، ولكن يتطلب كميات أكبر من المواد الكيميائية مراسل. وأخيراً، كان أيضا استخدام البروتوكول النعيم مع شتلات نبات الكتان، تمثل حقيقي يعيش طراز النبات فيها للصحفيين الكيميائية يجب أن تكون يمتص عن طريق الجذور قبل نقلها حتى وقف. بينما هذا النموذج له ميزة واضحة يجري تنفيذها في النباتات الحية، في الممارسة العملية، فإنه يقتصر على شتلات صغار وليس حقاً مناسبة للتحقيق في ديناميات ليجنيفيكيشن في النباتات الأكبر سنا لأسباب عملية (حضانة طويلة الوقت، مرتفعة كمية من الصحفيين الكيميائية). ومع ذلك، هذه التجربة ثلاثة التصاميم متكاملان، وجميعها إيجابيات وسلبيات فيما يتعلق بالجوانب العملية وأهمية بيولوجية تبعاً لنوع السؤال البيولوجية الرد على.

المتقدمة لدراسة ديناميات ليجنيفيكيشن في الكتان، لدينا بروتوكول القدرة على التكيف، ليس فقط من حيث تصميم التجربة البيولوجية، بل أيضا من حيث انطباقه على الآخر زراعة الأنواع وأجهزة/الأنسجة. على سبيل المثال، يمكن بسهولة نقل بليس لنبات أو أجناس حور التي أكثر قابلية للدراسات مع طفرات المغلوب أو تدق لأسفل لجينات مختلفة. من حيث المبدأ، دراسات وضع العلامات المزدوجة مع نهجنا يمكن أيضا توسيع للجزيئات الحيوية الأخرى باستخدام اثنين من السلائف معدلة متميزة البوليمرات جدار الخلية النباتية--بما في ذلك جميع مونوليجنولس الرئيسية الثلاث أو سلائفها الأيضية فضلا عن مختلف السكريات الأحادية التي تشكل مصفوفة السكاريد. منذ نشأتها، الكيمياء بيورثوجونال في الواقع أساسا وضعت للتحقيق في جليكانس/السكريات عن طريق oligosaccharide الأيضية الهندسية (وزارة التربية والتعليم)^4،5،،من¹⁷²⁸، ولكن من المدهش أن هناك فقط تطبيقات قليلة جداً لزراعة الأحياء حتى الآن^7،،من^89،10،،من¹¹¹². من حيث التوافق من ردود الفعل، وكانت دراسة اللجنين الواقع قضية معقدة لحل كل الصحفيين الكيميائية مدرجة ضمن نفس البوليمر شبكية. إمكانية غير مسمى ح_{من الألف إلى الياء}-تكوين قياس_كيه زكان القضية الرئيسية للتغلب على نظراً للقرب المكاني ز_كيه ووحدات_{من الألف إلى الياء} حداخل 3D هيكل من اللجنين²³، قيد التي قد لا تكون موجودة في حالة عدم إدراج اثنين من الصحفيين الكيميائية في نفس النوع من بيوبوليمير أو في نفس المنطقة المكانية لأي خلية معينة.

على نطاق أوسع يمكن تطبيق المنهجية بليس أساسا لأي دراسة الأسفار اللونين التصوير في النماذج البكتيرية أو الحيوانية باستخدام اثنين من الصحفيين الكيميائية المتميزة آخذا أزيد والعلامة ألكاين الطرفية، على التوالي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% sodium hypochlorite
20 cm high glass tube
250 mL Schott glass bottle
48-well Plate
5/6-TAMRA-PEG3-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
Aluminium foil
Cheese cloth
Compost containing clay
Coniferyl alcohol (G)	Sigma Aldrich	MFCD00002922
Copper (II) sulfate pentahydrate
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110	Jena Bioscience	CLK-A127-1
Milli-Q Ultrapure water
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Flax seeds (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Glass coverslip
Glass microscope slide
Growth chamber	CLF-Plant Climatics		For 2-week-old plants culture
Growth chamber	Angelantoni Life Sciences		For 2-month-old plants culture
Magenta plant culture box			For 2-week-old seedling culture
Methanol			Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood
Micropipette
Nail polish
Nikon A1R confocal microscope	Nikon
Orbital shaker
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)	Carbosynth	FC145653
Plastic cap
Plastic pipette
Plastic pot			For 2-month-old plants culture
Razor blade
Rubber band
Sodium Ascorbate
Sterile clamp
Vertical support
Vortex
Reagents for liquid and solid ½ MS medium
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Glycine
Nicotinic acid
Myo-inositol
Saccharose
MES hydrate
Agar