Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Özet

BLISS, lignification dinamikleri, eğitim için bir çift etiketleme iletişim kuralı geliştirilmiştir. Sentetik monolignol kullanarak gazetecilere ve SPAAC ve CuAAC bioorthogonal sıralı bir arada tepkiler, bu metodoloji açıyor lignins planta içindeBiyogenez düzenleyen faktörler derinlemesine analiz için yolu tıklatın.

Özet

Lignin gezegendeki en yaygın biyopolimer ve lignocellulosic biyokütle önemli bir bileşeni biridir. Bu fenolik polimer geliştirme ve hayat daha yüksek bitkilerin önemli bir yapısal ve koruyucu rol oynar. Her ne kadar kuvvetle lignification süreçleri içinde vivo düzenleyen karmaşık mekanizmalar endüstriyel valorization birçok bitki elde edilen ürünlerin etkisi, bilimsel topluluk hala onları deşifre etmek için gitmek için uzun bir yol var. Basit bir üç adım akışında aktif bölgeleri bitki dokuların lignifying bioimaging çalışmaları burada sunulan çift etiketleme iletişim kuralı sağlar. İlk adım iki bağımsız kimyasal gazetecilere, lignin H ve G birimleri ortaya çıkmasına iki yerli monolignols vekilleri metabolik birleşmesiyle oluşur. Lignin polimerler büyüyen içine birleşme sonra her muhabir sonra özellikle kendi floresan sonda bioorthogonal SPAAC/CuAAC tıklayın reaksiyonlar sıralı kombinasyonu ile taşır. Lignin autofluorescence ile birlikte, bu yaklaşım ve lignin bitki hücre duvarları içinde üç renkli yerelleştirme haritaların üretimi confocal floresan mikroskopi tarafından yol açar ve etkin durumunda kesin mekansal bilgi sağlar lignification makine bitki doku, hücre ve farklı hücre duvarı katmanları ölçekte.

Giriş

Son iki yılda, kimyasal muhabir strateji dynamics ve sigara-genetik olarak kodlanmış biomolecules fonksiyonlarını araştırmak için güçlü iki aşamalı metodoloji ortaya çıkmıştır. ^{1 , 2 , 3} bu strateji küçük modülasyon- kimyasal muhabir -ilgiyle biomolecule sentetik bir analog ilk canlı organizma ve sonra kimyasal bir sonda metabolize (örn., bir fluorophore floresan için confocal mikroskobu görüntüleme) kovalent anonim muhabiri bioorthogonal tıklayın kimya yoluyla bağlanır. Sonda hızla ve özellikle tepki gerekir herhangi bir biomolecules yaşam sistemde, inert olurken tanıtılan kimyasal değişiklik ile. Birçok yönden, bu yöntem çok özel tıklayın kimya d böylece metabolitleri veya önceden ulaşılmaz biomacromolecules izlemek için fırsat sağlayan kullanımı ile ortak bioconjugation teknikleri ile ilgili sınırlamalar üstesinden gelir yaşayan sistemler^4,5,6.

Bakteri ve hayvan hücrelerinde güçlü Bu yöntem hızlı büyüyen popülerlik rağmen şaşırtıcı derecede az ve çok⁷arasında^{,8,9,10kullanımı bitki Biyoloji açıklayan raporlar, 11,12}. Bu strateji lignin, gezegendeki en yaygın biyopolimer biri ve lignocellulosic biyokütle önemli bir bileşeni oluşumu eğitim tesislerinde uygulama özellikle ilgilenmişlerdir. ^{13 , 14} lignin geliştirme ve hayat daha yüksek bitkilerin önemli bir yapısal ve koruyucu rol oynar Bakalit bir polimerdir.

Genellikle üç 4-hydroxyphenylpropanoid moieties oluşmaktadır: H (p- hydroxyphenyl), G (guaiacyl) ve S (syringyl) birimler sırasıyla üç türetilmiş olan 'monolignols' (p- coumaryl, coniferyl ve sinapyl alkoller) (şekil 1) hücrenin sitoplazmada phenylpropanoid yolu üzerinden sentezledim. Hücre duvarı ihraç edilmekte, monolignols okside peroxidases veya laccases sonra onlar kimyasal radikal kaplin tepkiler lignin polimerler için polimerize geçmesi radikaller için bir işlemi olarak lignification. ^{15 , 16} lignins güçlü birçok bitki kaynaklı sanayi valorization etkisi rağmen ürünler, bilimsel topluluk hala vardır lignification düzenleyen karmaşık mekanizmaları deşifre etmek için gitmek için uzun bir yol.

Şekil 1: bitki hücreleri lignification işleminde. Monolignols uzarlar fenilalanin sitozol içinde gelen vardır. Hücre duvarı ihraç edilmekte, monolignols okside peroxidases veya laccases sonra onlar kimyasal radikal kaplin tepkiler lignin polimerler için polimerize geçmesi radikaller için bir işlemi olarak lignification. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bioorthogonal reaksiyonlar kullanım için glycan analiz raporları çeşitli olmakla birlikte,^2,3,17 biomolecules diğer türleri için kendi uygulama örnekleri daha az. Bioorthogonal kimya lignin bioimaging amaçlar için kullanımı ancak son zamanlarda Tobimatsu ve ark. tarafından öncülük ⁸ ' Arabidopsis thaliana nereye G birimleri, böylece kavram kanıtı gösteren^8,9 formları lignin polimer alkol vekilleri coniferyl birleşme hakkında bilgi sağlamak için bu kimyasal muhabir stratejileri bu bağlamda geçerlidir. CuAAC kullanımı da farklı coniferyl alkol türev kullanarak bir kaç ay sonra Bukowski ve arktarafından betimlenir. ⁹ lignin ancak, ayrıca H ve S birimleri içerir ve lignification işlemi daha derin bir anlayış nasıl tüm monolignols polimer dahil edilmiştir hakkında daha fazla bilgi gerektirir ve ne faktörler kompozisyonunu kontrol edebilirsiniz. Bu alandaki yeni gelişmeler şu anda birden fazla kimyasal gazetecilere aynı anda yaşayan sistemler içinde izlemek için etkili yöntemler geliştirilmesi bağlıdır. Glukanlardir üzerinde bir kaç makale son yıllarda^18,19'^,zemin koydu olsa bile^20,21,22, yaklaşımlar etiketleme çift kalır içinde büyük bir meydan okuma bioorthogonal Kimya. Bir tekrarlanabilir tek etiketleme tıklayın Protokolü geliştirmek zor, o zaman çift karşılıklı iki tandem optimizasyonu gerektirir yaklaşımlar etiketleme ise iki ayrı kimyasal gazetecilere uyumlu bioorthogonal reaksiyonlar daha da zor. Bu yönü öncülük birkaç örnekler zorlanma terfi azid-ALKİN cycloaddition (SPAAC) ve alkene-tetrazine ters elektronik talep Diels-Alder (DA_Inv) reaksiyonları glukanlardir hayvan hücrelerinde çalışırdım. Ancak, biz DAinv tepki bioorthogonality (oluşan elektron-fakirlerle tepki verebilir yerine konan cinnamyl türü-elektron zengini monomerleri lignin ve yapısal özellikleri sayesinde bu uygulamada garanti değil olduğunu düşündüm Hava Dienes DAinv tepkileri kullanılan tetrazine sondalar gibi) ve bu belirsiz etiketleme oluşturabilir. Ayrıca, erişim, hem de için hantal ve böylece olasılığını yükseltmek lipofilik sentetik zor olan kimyasal kolları DA_Inv tepki gerektirir bu birleşme, taşıma ve/veya kimyasal yerelleştirilmesini oranı muhabir vivo içinde etkilenip etkilenmedikleri sınanmamıştır. Biz ikinci yönü özellikle lignification çalışmak için bir tıklama kimya yaklaşım söz konusu olduğunda ilgili olarak kabul olarak, farklı yönde seçti ve bir Bioorthogonal tüp ligasyonu Imaging sıralı strateji (mutluluk) kullanılarak geliştirilmiş bir Strain-Promoted azid ALKİN Cycloaddition (SPAAC) ve bakır katalizörlük azid ALKİN Cycloaddition (CuAAC) içinde vivo. ²³

Bu iki tepkiler gerçekten iki ana bioorthogonal'ı tıklatın bugüne kadar kullanılan reaksiyonlar ve lignin ve birkaç örnek daha özellikle bu Imaging Yayınlandı son zamanlarda vardır. ^{8 , 9} çift etiketleme stratejimiz sağlar bir azid yan bir monolignol muhabiri ve terminal ALKİN diğer i) biyolojik ilgili yapıların doğru tepkisizdir ve II) çok küçük boyutlu (Şekil 2 iki kimyasal işleme ). Sonuç olarak, sentetik modifikasyonlardan altında eğitim biomolecule fizikokimyasal özellikleri üzerinde etkisi böylece taşıma açısından doğal olmayan ve doğal monolignol yüzeyler arasındaki olası tutarsızlıkları azaltmak küçültülür ve metabolization gore metabolik birleşme adım sırasında. SPAAC ve CuAAC ile birlikte ilk bakışta çok sezgisel görünüyor, bizim bilgi yapıları glukanlardir dışında bu strateji ve ilk uygulamasını kullanarak ikili işaretleme sadece ikinci örneği olsa da. ^{12 , 23}

Şekil 2: BLISS strateji etiketleme ikili. Kimyasal gazetecilere H_AZ ve G_ALK yerel H ve G monolignols tagged analogları vardır. Onlar ilk eksojen (Adım 1) besleme tarafından hücre duvarları büyüyen lignin polimerler dahil edilmiştir. Cyclooctyne - ve azid-floresan problar o zaman sırayla bakmaksızın anonim gazetecilere bioorthogonal tarafından functionalized kimya tıklatın: SPAAC reaksiyon (Adım 2) H_AZ birimlerinin çok özel ve bir CuAAC reaksiyon (tarafından takip edilir 3. adım) G_ALK birimleri (Adım 3), belirli böylece her iki gazeteci belirli yerelleştirme izin bağımsız olarak aynı örnek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Biz öncelikle tasarlanmış ve azid öğesini monolignol muhabir H_AZ (vekil p- coumaryl alkol) ve lignin H birimleri habercisi doğrulanmış ve BLISS çift etiketleme stratejisi içinde kullanılan ile tandem tasarladı daha önce ALKİN öğesini G_ALK,⁹ (vekil coniferyl alkol) ve lignin G birimleri habercisi bildirdi. Geliştirilen ve keten içinde test tekrarlanabilir bu protokol için bir ekonomik açıdan önemli bitki türleri, H_AZ ve G_ALK çift metabolik birleşme lignin içine ilk sıralı SPAAC/CuAAC önce elde edilir etiketleme. Burada, tagged H_AZ birimleri ilk özellikle yolu ile etiketlenmiş G_{ALK CuAAC-aracılı ligasyonu ikinci bir floresan inceleyebilirsek tarafından takip bir cyclooctyne functionalized fluorophore SPAAC ligasyonu etiketlenir} birimleri. Bu yöntem lignification süreçleri bitki hücre duvarları içinde dinamikleri araştırmak için kullanılan ve kesitler, fidan farklı bitki türlerinin yanı sıra kaynaklanıyor yaşayan durdurması için uygulanan vivo içinde olabilir.

Protokol

Not: Sıvı ve katı ½ MS medya ek tablo 1' de açıklandığı gibi önceden hazırlanmış olması gerekir.

1. bitki kültürü

1. 2 aylık Keten bitki kültürü
   1. Plastik tencere Çömlekçilik kompost kullanarak keten (Linum usitatissimum L.) tohumları ekmek.
   2. Büyümek büyüme odalarında bir photoperiod 16 h/8 h ile 22 ° C'de keten/gündüz.
   3. 1 ay sonra dikey destek bitkilerle donatmak ve 2 aylık onlar kadar büyür.
2. Kültür 2 haftalık keten fidan
   1. 12 keten tohumu bir parça peynir bez sarın ve bir paket yapmak için bir lastik bant ile düzeltmek.
      Not: sonraki adımlar laminar akış duman başlık altında steril koşullarda yerine getirir.
   2. Tohum paket bir daha önce autoclaved 250 mL cam şişe yerleştirin.
   3. % 70 70 mL ekleyin alkol şişe ve yavaşça 1 dakika karıştırın.
   4. Dikkatli bir şekilde şişeye paket bırakarak decantation tarafından alkol çıkarın.
   5. 100 mL % 2 sodyum hipoklorit ekleyin ve 10 dakika hafifçe karıştırın.
   6. Sodyum hipoklorit çözüm şişede paket bırakarak decantation çıkarın.
   7. Adımları 1.2.5-1.2.6 tekrarlayın.
   8. 100 mL steril ultrasaf su ekleyin ve 1 dakika karıştırın.
   9. 1.2.8 3 kez, her durulama (5, 10 ve 15 dk) durulama süre artan adımları yineleyin.
   10. Katı ½ MS orta sıcak, bir steril bitki kültür kutuda 2 cm yüksekliğinde dök ve katılaşma kadar aşağı soğumaya bırakın.
   11. Kibar bir şekilde her tohum steril forseps kullanarak katı medyada yer.
   12. Steril kutusunu kapatın.
   13. Kutuyu bir büyüme odası ile bir photoperiod 16 h/8 h 22 ° C'de transfer gündüz/gece ve 2 hafta boyunca keten fidan büyümeye.

2. metabolik kimyasal gazetecilere birleşmesiyle

Not: Üç modeller aşağıda sunulmuştur: i) metabolik etiketleme kök kesit, II) bütün kaynaklanıyor ve III) bitki fidesi. Her iletişim kuralı için bir biyolojik REPLICATE sunulur ve miktarları gerekli biyolojik çoğaltır sayıya adapte edilebilir. Monolignol çözümler deneme önce Tablo 2 ' de açıklandığı gibi yapılır stok çözümlerinden hazırlanır. Hisse senedi çözümleri-20 ° C'de birkaç ay saklanabilir H_AZ: G_ALK veya H:G oranlarını tüm özel yapım deneysel tasarımlar uyacak şekilde ayarlanabilir.

1. 2 aylık keten kök kesit içine kimyasal muhabir birleşme
   1. G_ALK 10 µM ve H_AZ 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren bir 300 µL kimyasal muhabir çözüm hazırlamak.
   2. Girdap H_AZ/G_ALK çözüm ve bir micropipette 48-şey plakalı bir kuyu aktarmak.
   3. 10 µM g ve H 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren 300 µL negatif kontrol çözümü hazırlayın.
   4. Girdap H/G çözüm ve aynı 48-şey plaka ikinci bir kuyu için transfer.
   5. Yeni jilet kullanarak toprak seviyesinden 10 cm 2 aylık Keten bitki kök kesmek.
   6. İnce 50 serbest enine kesit jilet (yaklaşık 150-250 µm kalınlığında) kullanarak kök hazırlamak.
   7. Hemen izle cam sıvı steril ½ MS orta kesit yerleştirin.
   8. Kontrol edin ve bozulmamış tüm kesit seçin ve rasgele 10 tanesi de H_AZile dolu, dağıtmak /G_ALK çözüm.
   9. Adımı yineleyin 2.1.8 de dolu için h/G çözüm (olarak negatif kontrol).
   10. Bir de (floresan temel confocal mikroskobu görüntülerin sonraki veri işleme sırasında ayarlamak için arka plan denetimi) olarak ½ MS orta 300 µL ile dolu üçüncü için 2.1.8 arasındaki adımları yineleyin.
   11. Sürekli bir büyüme odası 20 h için 20 ° C'de ışıkta plaka kuluçkaya.
   12. Her iyi bir micropipette ile monolignol çözüm kaldırın.
   13. Her şey için 500 µL ½ MS orta ekleyin, 10 dakikadır hafifçe karıştırın ve bu çözüm bir micropipette ile durulama kaldırın. 4 kez tekrarlayın ve hemen etiketleme BLISS (Bölüm 3) devam edin.
2. 2 aylık keten bütün kaynaklanıyor içine kimyasal muhabir birleşme
   1. G_ALK 10 µM ve H_AZ 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren bir 5 mL kimyasal muhabir çözüm hazırlamak.
   2. Girdap H_AZ/G_ALK çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksek cam test tüp bir pipet ile.
   3. 10 µM g ve H 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren 5 mL negatif kontrol çözümü hazırlayın.
   4. Girdap H/G çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksek cam test tüp.
   5. (Floresan temel confocal mikroskobu görüntülerin sonraki veri işleme sırasında ayarlamak için arka plan denetimi) olarak ½ MS orta 5 mL içeren üçüncü bir cam test tüpü hazırlayın.
   6. Yeni jilet kullanarak toprak seviyesinden 10 cm 2 aylık Keten bitki kök kesmek. Kök sistemi ve kök alt kısmı atın ve bitki kök üst kısmındaki sonraki adıma geçin.
   7. H_AZiçeren tüp içinde bütün kesilmiş kök Bankası sokmak /G_ALK çözüm. Kök kuluçka çözüm kurumasını önlemek için hemen kök sistemi kaldırıldıktan sonra yerleştirin.
      Not: küçük/büyük bitkiler ve/veya diğer türler için yöntem uygulanırsa, monolignol çözümleri hacmi büyüklüğüne göre ayarlanması gerekir / yaş bitki ve onun kök çapı.
   8. Kök düz tutmak için dikey bir destek ekleyin.
   9. Cam tüp çözüm buharlaşma önlemek için parafilm ile kapatın.
   10. Hile negatif kontrol örneği için adımları 2.2.6-2.2.9 tekrar /G çözüm.
   11. Adımları 2.2.6-2.2.9 ½ MS orta içeren floresan arka plan denetimi örneğini için yineleyin.
   12. Her kök sürekli ışık neon ışık kullanarak 20 h için kuluçkaya.
   13. Metabolik şirketleşme 20 h sonra H_AZinkübe kök kaldırmak /G_ALK çözüm ve ½ MS orta ile durulayın.
   14. Kesip alt jilet kullanarak kök 1 cm atmak ve 1 cm yüksek silindir kalan kök tabanından hazır olun.
   15. Dikkatle 20 serbest enine kesit (yaklaşık 150-250 µm kalınlığında) üzerinden bu silindir hazırlamak ve hemen izle ½ MS orta ile dolu bir bardak koyun.
   16. ½ MS orta 500 µL 48-şey plaka bir kuyuda koymak.
   17. Kontrol edin ve bozulmamış tüm kesit seçin ve rasgele 10 tanesi ½ MS çözümü ile dolu iyi dağıtmak.
   18. 2.2.13-2.2.17 H/G çözüm ile inkübe negatif kontrol kök için adımları yineleyin.
   19. Adımları 2.2.13-2.2.17 floresan arka plan denetimi kök için ½ MS orta ile inkübe yineleyin.
   20. Dikkatli bir şekilde çözüm her iyi bir micropipette ile çıkarın.
   21. Her şey için 500 µL ½ MS orta ekleyin, 10 dakikadır hafifçe karıştırın ve bu çözüm bir micropipette ile durulama kaldırın. 4 kez tekrarlayın ve hemen etiketleme BLISS (Bölüm 3) devam edin.
3. 2 haftalık keten fidan içine kimyasal muhabir birleşme
   Not: Aşağıdaki adımları tüm steril koşullar altında yapılmaktadır.
   1. G_ALK 10 µM ve H_AZ 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren bir 2 mL kimyasal muhabir çözüm hazırlamak.
   2. Girdap H_AZ/G_ALK çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksekliğindeki cam test tüp bir pipet ile.
   3. 10 µM g ve H 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren 2 mL negatif kontrol çözümü hazırlayın.
   4. Girdap H/G çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksekliğindeki cam test tüp.
   5. (Floresan temel confocal mikroskobu görüntülerin sonraki veri işleme sırasında ayarlamak için arka plan denetimi) olarak ½ MS orta 2 mL içeren üçüncü bir 20 cm yüksek cam test tüpü hazırlayın.
   6. İnce uzun bir çift cımbız kullanarak katı ½ MS ortamından bir 2 haftalık keten fide kaldırmak (Bölüm 1.2. yukarıda).
   7. Yavaşça fide H_AZiçeren tüp transferi /G_ALK çözüm, kökleri çözümde daldırılır sağlanması.
   8. Cam tüp buharlaşma önlemek için plastik bir kap ile kapatın.
   9. H ile negatif kontrol tüp için adımları 2.3.6-2.3.8 tekrar / G çözüm.
   10. Adımları 2.3.6-2.3.8 ½ MS orta içeren floresan arka plan denetimi tüp için yineleyin.
   11. Sürekli ışık 20 ° C'de 20 h için büyüme odasında her fide kuluçkaya
   12. İnce H_AZinkübe fide kaldırmak /G_ALK çözüm ve ½ MS orta ile durulayın.
   13. İnce 20 serbest kesit (kalın approximatively 150-250 µm) hypocotyl, hazır olun.
   14. ½ MS orta 500 µL 48-şey plaka bir kuyuda koymak.
   15. Kontrol edin ve bozulmamış tüm kesit seçin ve rasgele 10 tanesi ½ MS çözümü ile dolu iyi dağıtmak.
   16. 2.3.12-2.3.15 H/G çözüm ile inkübe negatif kontrol fide için adımları yineleyin.
   17. Adımları 2.3.12-2.3.15 floresan arka plan denetimi fide için ½ MS orta ile inkübe yineleyin.
   18. Dikkatli bir şekilde çözüm her iyi bir micropipette ile çıkarın.
   19. Her şey için 500 µL ½ MS orta ekleyin, 10 dakikadır hafifçe karıştırın ve bu çözüm bir micropipette ile durulama kaldırın. 4 kez tekrarlayın ve hemen etiketleme BLISS (Bölüm 3) devam edin.

3. çift floresan bitki kesit örnekleri SPAAC ve CuAAC tarafından etiketlerine göre

Not: Protokolü etiketleme BLISS tüm 3 deneysel modeller (Bölüm 2) için aynıdır.

1. Zorlanma terfi azid ALKİN Cycloaddition (SPAAC) etiketleme
   1. 1 mL DBCO-PEG₄-5 5 mikron içeren bir SPAAC çözeltisi hazırlamak/6-carboxyrhodamine 110 sıvı steril ½ MS orta. Girdap çözüm ve karanlıkta tut.
   2. Son yıkama sonrası adımları [2.1.13, 2.2.21 veya 2.3.19 bağlı olarak seçilen deneysel tasarım], metabolik kuruluş protokolünün ½ MS orta kaldırın ve SPAAC çözüm iyi bir micropipette ile başına 300 µL ekleyin.
   3. Işık 48-şey plaka kaplama alüminyum folyo ile veya bir kutuya yerleştirerek kalkan.
   4. Hafifçe plaka üzerinde karanlık ortam sıcaklığında 1 h için mekanik bir shaker karıştırın.
2. Bakır katalize azid ALKİN Cycloaddition (CuAAC) etiketleme
   1. Her şey 4 kez adım 2.1.13 açıklandığı gibi karanlıkta plaka tutarken yıkayın.
   2. 1 mL 2.5 mM sodyum askorbat, 0,5 mM CuSO₄ ve 5-TAMRA-PEG₃5 mikron içeren bir CuAAC çözeltisi hazırlamak-azid sıvı steril ½ MS orta. Girdap çözüm ve karanlıkta tut.
      Not: Bu CuAAC çözüm kullanmadan önce taze hazırlanmalıdır ve birkaç gün 4 ° C'de depolanan
   3. ½ MS orta her kuyuya kaldırın ve doğrudan 300 µL iyi bir micropipette kullanarak başına CuAAC çözüm ekleyin.
   4. Hafifçe plaka üzerinde karanlık ortam sıcaklığında 1 h için mekanik bir shaker karıştırın.
   5. Bir micropipette kullanarak CuAAC çözüm kaldırın.
   6. Bir micropipette kullanarak, ½ MS 500 µL ekleyin, 10 min için karanlık ilave edin sonra bu yıkama çözüm kaldırın. İki kez tekrarlayın.
   7. 7:3 MeOH/su solüsyonu 500 µL ekleyin, 1 h için karanlık ilave edin sonra çözüm kaldırma
      Dikkat: Metanol ciltle temas veya inhalasyon tarafından toksik ve bir insan kanserojen atanır. Onun kullanımı kimyasal duman davlumbaz ve eldiven gerektirir.
   8. ½ MS 500 µL ekleyin, 10 min için karanlık ilave edin sonra çözümü kaldırın. 4 kere tekrar edin.

4. mikroskop örnekleri montajı slaytlar

1. Montaj orta cam mikroskop Slayttaki yer 5 bırakır.
2. Dikkatle her H_AZdepozito /G_ALKtagged kesiti slayt üzerinde.
3. Tırnak cilası slaydın iki karşı taraflarda uygulanır.
4. Bir coverslip slaytla kapsar. Hava kabarcıklarını önlemek dikkatli olun.
5. Aşırı montaj orta bir kağıt havlu kullanarak kaldırın.
6. Tırnak cilası her 4 tarafında örnekle kapatın. Oda sıcaklığında (yaklaşık 30 dakika) kuru vernik çivi ver.
7. 4.1-4,6 negatif kontrol H/G kesit için yineleyin.
8. 4.1-4,6 floresan arka plan denetimi kesit için yineleyin.
9. 4 ° C'de slaytları gözlem confocal mikroskop altında kadar karanlıkta depolama.
   Not: Hazırlanan slaytlar hazırlık kalitesine bağlı olarak birkaç ay birkaç hafta saklanır. Yeni bir gözlem depolama sonra yapılacak ise, örnekleri kurumuş olduğunu değil emin olun.

5. resim alma tarafından Confocal Floresans mikroskobu

1. Üreticinin yönergelerine göre doğru düzende confocal mikroskobu sisteminin tüm gerekli birimler açın.
2. Maksimal sayısal diyafram ile istediğiniz hedefi seçin ve uyarma ve emisyon dalga boylarında uyarlanmış (örneğin, obj 60 x, N.A. 1.2. Autofluorescence kanal: λ_ex 405 nm, λ_em 450 nm /25; SPAAC H_AZ kanal: λ_ex 488 nm, λ_em 525 nm /25; CuAAC G_ALK kanal: λ_ex 561 nm, λ_em 595 nm /25; Sıralı modu).
3. Yazılım (12 veya 16 gerekli, bit piksel boyutunu Nyquist kriteri için uyarlanmış) Albümdeki nesil için istenen parametrelerini seçin.
4. H_AZ/G_ALK slayt mikroskop sahnesinde yerini ve objektif mercek altında örnek konumlandırın.
5. Gözlemlemek ve bitki dokusunun istediğiniz bölgesini bulun.
6. Yüksek kaliteli iki kat etiketli H_AZ/G confocal görüntülerini elde_ALK örnek.
   1. En floresan uçağa z ekseni seçin.
   2. Kazanç, ayarlamak en iyi sinyal dağıtım her kanal (autofluorescence, H_AZ ve G_ALK) için tüm gri düzeyi aralığı boyunca elde etmek için uzaklık ve lazer güç. Aynı parametreleri aşağıdaki satın almalar için uygulanması gerekir.
   3. Seçili resmin edinimi başlatın ve dosyayı kaydedin. Örnek ilgili her alanı için yineleyin.
      Not: 3D Z-yığın rekonstrüksiyonlar Ayrıca gerekirse elde edilebilir.
7. Aynı ayarları kullanarak, yalnızca autofluorescence düzeyi (2 bölümde açıklandığı gibi floresan arka plan denetimi) belirlemek için ½ MS inkübe etiketsiz örnek görüntüleri elde etmek.
8. Aynı ayarları kullanarak, yerel monolignols belirsiz fluorophore yapışma örnek belirlemek için H/G ile inkübe negatif kontrol örnekleri için görüntüleri elde etmek.
9. Veri tedavi çıkarma arka plan autofluorescence sinyalleri H/G negatif kontrol görüntüleri ve H_AZ/G_ALK görüntüleri elde edilen görüntülere uygulanır.

Sonuçlar

Sentetik monolignol analogları ve bioorthogonal ilgili sunulan BLISS protokolünü kullanarak kimya tıklatın, yaşayan bitkiler lignification sürecinde dinamikleri görselleştirmek mümkündür. (Histochemical boyama, immunolocalization veya autofluorescence gibi), bu 'çift tıklayın' protokolü sadece görselleştirme lignin için kurulan teknikleri aksine metabolik birleşme sırasında üretilen lignin de novo hedefler adım ve confocal Floresans mikroskobu (şekil 3) üç kanallı hücresel görüntüleme ile örnek önceden varolan lignin dan ayırır. H _AZ-birimleri DBCO-PEG₄-5 uyarma ve emisyon dalga boylarında kullanarak algılanır/6-özellikle azid fonksiyonları tıklandığında carboxyrhodamine 110 dahil H_AZ molekülleri SPAAC adım (λex sırasında 501 nm /λ_em 526 nm, yeşil kanal), oysa G_ALK-birimleri aynı şekilde özel olarak G anonim terminal ALKİN Etiketler tıklandığında azidefluor 545 inceleyebilirsek karakteristik dalga boylarında, tespit _ALK CuAAC adımı (λex 546 nm /λ_em 565 nm, kırmızı kanal); Üçüncü kanal 405 kendi içsel autofluorescence kullanarak algılanır önceden varolan lignin karşılık gelen nm (mavi kanal). Bu yaklaşım üç renkli yerelleştirme haritalar ve lignin varlığı kesin mekansal bilgi sağlar bitki hücre duvarları içinde ya da aktif lignification makine yokluğu nesil bir organ (şekil 3A farklı dokular arasında açar. ), farklı hücre tipleri aynı doku (şekil 3B-C) ve (şekil 3D) aynı hücrenin farklı duvar katmanları arasında. Başka bir deyişle, bu metodoloji bize vurgulayın ve özellikle 'etkin' lignification siteleri (H_AZ ve G_ALK kanalları) yerelleştirmek onları nerede lignin bir önceki kuruldu bölgelerdeki ayırt sağlar bitki gelişiminin (autofluorescence kanal) aşamasında. Buna ek olarak, teknik duyarlılığını autofluorescence için karşılaştırıldığında önemli ölçüde geliştirilmiş ve çok daha küçük miktarda taze sentezlenmiş lignin olabilir (şekil 3B) algıladı.

Şekil 3: keten kaynaklanıyor anonim monolignol kimyasal gazetecilere Imaging. (A)bir el yapımı enine bölümünü keten bir kök yeniden oluşturulan resmi yarısı. (B) xylem ayırt ilk katmanları Close-up. Paneli yaptı: lignin autofluorescence (mavi, 405 nm), Orta paneli: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve H_AZ floresan (yeşil, 526 nm) kanallar, doğru kapı aynası: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve G_ALK floresan (kırmızı, 565 nm) kanalları. Ok autofluorescence ile karşılaştırıldığında BLISS artan duyarlılık gösteren cambium ilk etiketli hücre duvarından gösterir. (C) etiketleme farklı hücre farklı katmanları aynı hücre duvarı etiketleme değişimler gösteren ikincil xylem hücreleri üzerinde ikincil xylem ve (D) yakın çekim. Paneli yaptı: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve H_AZ floresan (yeşil, 526 nm) kanallar, Orta paneli: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve G_ALK floresan (kırmızı, 565 nm) kanallar, sağ Panel: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi), H_AZ (yeşil) ve G_ALK (kırmızı) floresan kanalları. H_AZ ve G_ALK co yerelleştirme sarı renk ile tasvir edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Burada sunulan BLISS yöntemi veya daha önce Tobimatsu vd tarafından Yayınlanan tek etiketleme yordamlar gibi kimyasal muhabir stratejileri ⁸ bu nedenle IMMUNO - veya histochemical uygulanması çok kolay olurken boyama gibi daha önce erişilebilir yöntemlerine göre çok ince bir çalışma izin verebilirsiniz. Örneğin, şekil 4 göstermektedir H_AZsinyal yoğunluğu /G_ALK birleşmesiyle keten ikincil xylem fiber tracheids/damarlarının (FT) cambium gelen ilk birkaç hücre duvarları içinde çok yüksek ama büyük hücrelerde giderek azalır. Bu profil bu autofluorescence karşısında ve en çok o lignification çok hızlı bir şekilde cambium gelen ilk 2-3 FT hücre katmanlarında ulaşıldığında gösterir. Buna ek olarak, daha sonraki aşamaları için lignification olarak H_AZonların gelişimi devam etmek için ray (R) hücreleri görünür /G_ALK birleşme olduğunu çok daha sürekli cambium ilik için hücre duvarlarında. Bu hücre türleri farklı biyolojik rolleri ile ilişkili farklılıklar kendi gelişim programında beri FT ve R hücre türleri tezat lignification dinamikleri, görüntüler şaşırtıcı değil. FTs olgun ve hızlı bir şekilde ölmek gerçekten uzun tüpler, kalın lignified duvarlı R dar satırlarının hücreleri ise bu mekanik destek ve su ve mineraller, dikey taşıma önemli rol oynarlar bırakarak ölü boş hücreler xylem oluşturmak ışınları olgun ve fonksiyonel durumlarında kalın lignified duvarlar kalmadan hayattasın.

Şekil 4: hücre özgü monolignol muhabir birleşme keten xylem. Keten bir kök serbest bir kesitin parçası Bright-alan confocal mikroskobu görünümünü(a). Pembe (ray parankimi hücreleri, R) ve sarı (fiber tracheid hücreleri, FT) okları gösterir vektörler ilik doğru cambial bölgeden yayılan ve lignin autofluorescence 405, taranan nm (B), H_AZ Floresans 526, nm (C) ve G _ALK Floresan, 565 nm (D). İkincil xylem (E) görünümü. Paneli yaptı: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi), H_AZ (yeşil) ve G_ALK (kırmızı) floresan kanalları. H_AZ ve G_ALK co yerelleştirme sarı renk ile tasvir edilir. Doğru kapı aynası: keten kök ikincil xylem yapısındaki şematik gösterimi. V, gemi; FT, fiber tracheid; R, ray parankimi hücre. Bu rakam aslan ve ark. değiştirildi ²³ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Buna ek olarak, iki farklı kimyasal gazeteciler için H - ve G-birimleri BLISS protokolündeki iki bioorthogonal reaksiyonlar ile karşılık gelen kullanımı daha fazla nicel sonuçları elde sağlar. BLISS ek anlayışlar birleşme oranları çeşitli koşullarda monolignol kontrolünü sağlayabilir ve zor lignification işleminin deşifre için katkıda bulunabileceğini gibi stratejileri etiketleme multiplexed. Lignins H, G ve S monolignols, göreli yüzdelerini gerçekten çok tür, doku, yaş veya bitki çevre koşullarına göre değişken ise, bu kompozisyon düzenleyen karmaşık mekanizmaları hala tamamen anlaşılır. Çift etiketleme teknolojisi lignin kompozisyon düzenleyen parametrelerden bazıları soruşturma güçlü bir şekilde temsil eder. Örneğin, H_AZdeğişen: GBLISS ile_ALK oranı bize lignin kompozisyon ikincil xylem dokularda monolignol durumu hücre duvarları içinde yerine üzerine doğrudan bağlı olduğunu göstermek için izin peroksidaz/Lakkaz özgüllük (şekil 5).

Şekil 5: farklı yüzde oranları ile keten kök bölümlerini H_AZ ve G_ALKkuluçka etkisi. H_AZ: G_ALK% oranları rakamlar her sütun verilmiştir. Top: H_AZ ve G_ALK kanalları birleştirilir. Alt: H_AZ ve G_ALK farklı % oranları için ortalama Floresans yoğunluğunu gösteren çubuk grafikler. Değerleri gri düzeyleri ± SD ölçek ortalama Floresans şiddeti ortalaması olarak ifade edilen çubuk 100 µm. = bu rakam aslan ve ark. değiştirildi ²³ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Keten, tekstil, lüks evrak ya da çevre dostu kompozit malzemeler üretimi için kullanılan lif için (BF) büyüyor. Onların endüstriyel valorization önemli bir yönünü lignin bir son derece kalın S2/G ikincil katman^19,24tarafından karakterize onların hücre duvarları içinde çok az düzeyde içermesidir. BLISS lignification dynamics farklılıklar aynı hücre duvarı farklı katmanları arasında vurgulayabilirsiniz. Şekil 6A H_AZ ve G_ALK muhabir birleşme hücre köşe ve ancak tüm lif orta lamel/birincil hücre duvarı ile sınırlı olduğunu göstermektedir. Hypolignified durumlarına moleküler ortamı için uygun olmamasından ortaya çıkar ortaya lignification monolignol kimyasal gazetecilere exogenously olduğunda bile kalın bast fiber ikincil hücre duvar katmanını içinde toplam yokluğunda verilen enzimatik aracılı oksidasyon ve monolignols birleşmesiyle büyüyen polimer zinciri içine ve sadece monolignol biyosentezi genlerin transkripsiyon düzenlenmesi nedeniyle daha önce olmadığına²⁵bildirdi. Bu gözlem de o keten peroksidaz gen up-lignified lif²⁶sahip keten kimyasal lbf1 mutant dış kök dokularda düzenlenmiştir de gerçeği ile ilişkilendirir.

Şekil 6: BLISS hücre duvarı altyapı veya katman özel farklılıkları vurgulamaktadır. (A)sol kapı aynası: keten kök bölümüne alan parlak görüntü. Daire bir lif paket gösterir. Doğru kapı aynası: lif üzerinde yakın. Birleştirilmiş H_AZ ve G_ALK kanalları (ve alan parlak olmayan) o lignification hücrenin köşeler için sınırlı olduğunu gösteren () ve orta lamel/birincil hücre duvarına bir lif. BF, bast fiber; Par, parankimi hücre; M, orta lamel; P, birincil hücre duvarı; S1, ikincil hücre duvarı ilk katman; İkincil hücre duvarı S2/G, ikincil katman/jelatinimsi tabakası. (B) 2D dilim ve 3D confocal z-yığın zum keten kök endodermis bölgesinin inşası. Casparian Şerit () sadece autofluorescence görüntüler ve H_AZ veya G_ALKdahil değil. İlişkili fluorogram G_ALK/H_AZ Anti-korelasyon gösterir: yüksek yeşil Floresans düşük kırmızı sinyal (korteks) ve tersi (endodermis) ilişkili. Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Son olarak, bu iki renkli metodoloji da değerli bilgiler hücre duvarı ayarlamış 'lignification durumu' üzerinde çeşitli gelişim aşamalarında ve kök dışındaki bitki organlarında sağlayabilir. Örneğin, keten kökleri endodermis Radyal ve enine hücre duvarları Casparian grupta varlığını geliştirme erken aşamalarında karakterizedir. Hidrofobik biyopolimer, suberin ve/veya lignin, yapılan grup su ve solutes apoplast ile pasif girmesini kök tarafından alınan önler ve böylece katkıda bir symplastic yol ile plazma zarı geçmek güçleri Seçici alımını kapasiteleri bitki kökleri. Keten köklerine uygulanan, bizim strateji endodermal hücreleri de olduğu gibi Casparian band (6B rakamyok) nerede parçalar Radyal duvarların teğet duvarlar H_AZ ve G_ALK dahil edilmiştir gösterdi. Ancak, Toplam Devamsızlık Casparian bandında monolignol muhabir şirketleşme hala sitenin daha fazla biyopolimer yükünün olmakla birlikte diğer duvarlar bu gelişme bu aşamada olgun olduğunu gösterir. Z-yığın yeniden oluşturulan 3B Görünümü açıkça Casparian band ışık getiriyor. İlginçtir, endodermis için bitişik bazı kortikal hücrelerinin duvarları da kanıtladı H_AZ tercihen bütünleştiren (böylece lignin/suberin keten kök kortekste varlığını gösteren) değil G_ALKama. Co yerelleştirme analiz H_AZ ve G_ALK, bu iki bitişik hücre türü hücre özel duvar yapısı/enzimatik makine varlığını önermek arasında anti-bir korelasyon gösterdi.

Ek tablo 1: hazırlık katı ½ MS orta Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2: kimyasal muhabir hisse senedi çözümleri hazırlanması Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Daha önce belirtildiği gibi bu raporda sunulan çift etiketleme BLISS bir SPAAC/CuAAC kombinasyon vivo içinde^12,23ilk örneklerinden biri protokoldür. Her adım iyice optimize edilmiş ve onaylanmış ve içinde iki etiketleme reaksiyonlar sırayla gerçekleştirilen kimya tıklatın sipariş saygı çok önemlidir (yani, SPAAC ilk, takip CuAAC tarafından). Tüm çapraz denetimleri BLISS Protokolü uygulanan²³ olduğunda etiketleme her adım belirli olduğunu gösterdi: SPAAC adım taşıyan ilk yüksek chemoselective yol H_AZ azid işlevleri tarafından etiketlerine göre cyclooctyne functionalized fluorophore hızlı kinetiği ile [3 + 2] cycloaddition reaksiyonu yoluyla. H_AZ birimleri etiketlendikten sonra triazole bağlantılar tarafından tepki ile azid fluor 545 probe oluşturmak için G_ALK terminal alkynes aktivasyonu katalize copper(I) gerektiren CuAAC adım yapılabilir. Buna karşılık, ters sırada (yani, CuAAC ilk, takip SPAAC tarafından) G_ALK ve H_AZ birimine yol açar gibi kullanılmamalıdır fluorophore ligasyonu ile birlikte buz dansında yarışmaktadır ve dramatik bir sinyal kaybı indükler çapraz-bağlantı . Non-spesifik boyama önlemek için ara çamaşır adımlar gerekliliğini vurgulamak önemlidir.

Biz bizim yöntem çeşitli biyolojik deney tasarımları için uygulanabilir olduğunu göstermiştir. İletişim kuralı etiketleme BLISS ilk serbest kesit önceden kesilmiş ve tıklayın hazır monolignols ile inkübe keten kaynaklanıyor (yaklaşık 150-250 µm kalınlığında) uygulandı. Bu tasarım gibi (kuluçka birimleri azaltılır) kimyasal muhabir gerekli miktarda en aza indirilmesi ve istatistiksel çoğaltır üretimini kolaylaştırmak avantajı olmasına rağmen bu kesinlikle bahsetmişken, bir vivo içinde sistem değil ve bazı durumlarda, değil gerçek spatio-temporal lignification dynamics tüm yönleriyle yansıtabilir. Bir ikinci deneysel tasarım, bu nedenle daha önce çam ve gingko²⁷' deki radiolabeled monolignols birleşmesiyle çalışmak için kullanılan bir yöntem BLISS protokole uyarlanmış. Bu yaklaşımda, kökler ve kök bitki fiziksel olarak ayrılır ve tüm kök tabanı ne 'çiçek vazo' yaklaşım lakaplı içinde monolignol çözümünde inkübe. Sapları istediğiniz (kuluçka) zaman ayrıldıktan sonra kesit kesim ve gerçekleştirilen BLISS Protokolü vardır. Bu değiştirilmiş monolignols yaşayan kök taşınır ve lignin polimerler hücre duvarları içinde büyüyen dahil edilmiştir (i) olduğunu ve yerelleştirme modeli esas kesit için özdeş (II) olduğunu göstermek bize izin yaklaşım. Bu tür bir deney bir gerçek yaşam tesisinde gerçekleştirilen hak vardır / canlı hücre uzun deneyler ve daha ayrıntılı çalışmalar izin yaklaşım, ama kimyasal muhabir büyük miktarda gerektirir. Son olarak, BLISS protokolü de Keten bitki Fidan, bir gerçek yaşam içinde kimyasal gazetecilere kadar kök nakli önce kökleri absorbe olması gerekir bitki modeli temsil eden ile kullanıldı. Bu model uygulamada, yaşam tesislerinde gerçekleştirilen açık avantajı ise genç fidan sınırlıdır ve lignification dynamics büyük tesislerinde pratik nedenlerle (uzun bir kuluçka süresi, yükseltilmiş soruşturma için gerçekten uygun değildir ««kimyasal gazetecilere miktarı). Yine de, bu üç deney tasarımları tamamlayıcı niteliktedir ve tüm kendi artıları ve eksileri ile ilgili pratik yönleri ve biyolojik soru cevap türüne bağlı olarak biyolojik önemi var.

Keten lignification dinamiklerini incelemek için geliştirilen, bizim protokol son derece uyarlanabilir, sadece biyolojik deney tasarımı açısından aynı zamanda diğer uygulama açısından bitki tür ve organ/doku. Örneğin, BLISS kolayca Arabidopsis ya da daha fazla çalışmalar çeşitli genler için knock-out veya knock-down mutantlar ile mükellef bulunmaktadır Populus cins için transfer edilebilir. Prensip olarak, bizim yaklaşım ile çift etiketleme çalışmaları da diğer biomolecules için bitki hücre duvarı polimerler - tüm üç ana monolignols veya metabolik onların öncüleri olarak çeşitli de dahil olmak üzere iki ayrı değiştirilmiş öncüleri kullanarak uzatılabilir polisakkarit matris oluşturan bol. Kuruluşundan bu yana, bioorthogonal kimya gerçekten de esas olarak glukanlardir/polisakkaritler metabolik oligosakkarit mühendislik (MOE)^4,5,17,28üzerinden araştırmak için geliştirilmiştir, Ama şaşırtıcı olmuştur sadece biyoloji bitki için çok az uygulamaları defa^{7,8,9,10,11,12}. Tepkiler uyumluluk açısından, lignin ve çalışma gerçekten her iki kimyasal gazetecilere aynı retiküle polimer dahil edilmiştir gibi çözmek için karışık bir vaka oldu. Etiketlenmemiş H_AZ- olasılığıG_ALK kullandığında oluşumu G_ALK ve H_AZ birimleri 3D içinde kayma yakınlığı nedeniyle üstesinden gelmek için büyük bir sorun oldu. lignin²³, iki kimyasal gazetecilere değil dahil edilmiştir Eğer biyopolimer aynı tür veya verilen herhangi bir hücreyi aynı kayma bölgesi olmayabilir bir sınırlama yapısını.

Daha geniş bir kapsamda BLISS metodoloji aslında iki farklı kimyasal gazetecilere taşıyan bir azid ve terminal ALKİN etiketi, sırasıyla kullanarak bakteriyel veya hayvan modellerinde herhangi bir iki renkli floresan görüntüleme çalışma için uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% sodium hypochlorite
20 cm high glass tube
250 mL Schott glass bottle
48-well Plate
5/6-TAMRA-PEG3-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
Aluminium foil
Cheese cloth
Compost containing clay
Coniferyl alcohol (G)	Sigma Aldrich	MFCD00002922
Copper (II) sulfate pentahydrate
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110	Jena Bioscience	CLK-A127-1
Milli-Q Ultrapure water
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Flax seeds (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Glass coverslip
Glass microscope slide
Growth chamber	CLF-Plant Climatics		For 2-week-old plants culture
Growth chamber	Angelantoni Life Sciences		For 2-month-old plants culture
Magenta plant culture box			For 2-week-old seedling culture
Methanol			Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood
Micropipette
Nail polish
Nikon A1R confocal microscope	Nikon
Orbital shaker
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)	Carbosynth	FC145653
Plastic cap
Plastic pipette
Plastic pot			For 2-month-old plants culture
Razor blade
Rubber band
Sodium Ascorbate
Sterile clamp
Vertical support
Vortex
Reagents for liquid and solid ½ MS medium
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Glycine
Nicotinic acid
Myo-inositol
Saccharose
MES hydrate
Agar