JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكول لاستخدام الفحص المجهري STED في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا ب التي انتشرت في كوفيرسليبس المغلفة بالأجسام المضادة لمستقبلات الخلية ب، ونموذج للمرحلة الأولى تشكيل المشبك محصنة.

Abstract

ب الخلايا التي تربط المستضدات غشاء محدد (مثلاً، على سطح خلية عرض مستضد) تشكيل المشبك منأى، بنية خلوية متخصصة التي يحسن إشارات مستقبلات (المركز) ب-الخلية واقتناء مستضد المركز بوساطة. كلا يعيد البناء cytoskeleton أكتين وإعادة توجيه الشبكة microtubule نحو الموقع الاتصال مستضد ضرورية لتشكيل المشبك محصنة. يعيد البناء من cytoskeleton أكتين في حلقة المحيطية كثيفة من أكتين و يرافق الاستقطاب مركز تنظيم microtubule نحو المشبك محصنة. البروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة، فضلا عن البروتينات القشرية نهاية بالإضافة إلى التقاط التوسط التفاعلات الفيزيائية بين سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، التي تسمح لهم بإعادة تنظيمها بطريقة منسقة. توضيح آليات أن تحكم عملية إعادة التنظيم هذه سيتوسكيليتال، فضلا عن فهم كيف أن هذه الهياكل cytoskeletal تشكيل تشكيل المشبك محصنة ويشير إلى المركز، يمكن أن توفر أفكاراً جديدة في تنشيط الخلية ب. وهذا قد ساعد بوضع نهج مجهرية فائقة القرار التي تكشف عن تفاصيل جديدة عن شبكة سيتوسكيليتال المنظمة. يصف لنا هنا طريقة لاستخدام الميكروسكوب استنفاد (STED) حفز الانبعاثات في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات transfected microtubule معلم بروتينات فلورية خضراء بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا باء. نموذج الأحداث المبكرة في تشكيل المشبك محصنة، نسمح للخلايا ب ينتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، التي تبدأ إشارات المركز وإعادة عرض cytoskeleton. نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة للتعبير عن التجارة والنقل الانصهار البروتينات في الخلايا A20 ب-سرطان الغدد اللمفاوية للخلية التي يسببها Ig مكافحة انتشار وتثبيت الخلية اللاحقة وإيمونوستاينينج، والحصول على الصور والخطوات deconvolution صورة. الصور عالية الدقة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات تسمح بتصور في نفس الوقت هياكل أكتين وميكروتوبوليس والبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة microtubule التي قد تربط هذه الشبكات سيتوسكيليتال اثنين.

Introduction

عند ربط الخلايا ب الاستقطاب صفائف مستضدات (مثلاً، عرض على سطح عرض مستضد الخلايا (Apc))، مستقبلات ب-الخلية الناتجة (المركز) مما يشير إلى تشكيل بنية المشبك محصنة ضد الكلاسيكية، الذي كان أول وصف في محركات الأقراص تي الخلايا1،2،3،4،5،6،،من78،9،10، 11،،من1213. في البداية، ميكروكلوستيرس نموذج بكرس مستضد زمنياً في المحيط الموقع الاتصال ب الخلية: آسيا والمحيط الهادئ. ثم نقل هذه ميكروكلوستيرس نحو مركز الموقع مستضد الاتصال، حيث أنهم بلورتها في تنشيط supramolecular وسط كتلة (كسماك) الذي يشكل جوهر المشبك محصنة. يحسن المركز مما يشير إلى تشكيل المشبك محصنة ويسهل استخراج مستضد المركز بوساطة من الغشاء APC14. يسمح هذا الاستحواذ مستضد، التي تبعتها مستضد المركز بوساطة التدخيل وتجهيز مستضد اللاحقة، خلايا ب تقديم الببتيد: MHC المجمعات الثاني لخلايا تي، والتماس مساعدة خلية T14. ونظرا لأن يعزز تشكيل المشبك محصنة تنشيط الخلية ب، توضيح الآليات التي تنشئ يمكن توفير هذا النمط الوظيفي للمنظمة مستقبلات جديدة ثاقبة الاستجابات المناعية خلطيه كيف بدأت تنظم.

إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء أمر ضروري لتشكيل المشبك محصنة. يدفع المركز مترجمة إشارات تحفزها مجموعة الأقطاب مكانياً من مولدات المضادات سريعة ودرامية يعيد البناء من1،سيتوسكيليتون أكتين15. تشكيل هياكل أكتين الجذعية في محيط الخلية بتمارس قوي دفع في غشاء البلازما ويعزز نشر الخلية ب. هذا يسمح للخلية بالي مسح مساحة أكبر من سطح مستضد الحاملة، ويزيد عدد بكرس التي تربط المستضد وتنشيط المركز مما يشير إلى مسارات. في الوقت نفسه، بعد وشبكة ميكروتوبولي بتوجيه نحو موقع الاتصال مستضد. مع اقتراب بعد الموقع الاتصال مستضد، microtubules المنبثقة عن بعد تمتد على طول الوجه الداخلي لغشاء البلازما في مجال التفاعل بين الخلية ب و تحمل مستضد السطح16،17. ثم يمكن أن تعمل هذه ميكروتوبوليس جوكستاميمبراني كمسارات للحركة المركزي دينين بوساطة مستضد زمنياً بنك ميكروكلوستيرس18، مما يؤدي إلى تشكيل كسماك.

إعادة توجيه والاستقطاب من بعد نحو المشبك المناعي يتطلب أكتين سليمة وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي، وغالباً ما يعتمد على التفاعل بين الأكتين القشرية الشبكة وميكروتوبوليس16،17، ،من 1920. يمكن التقاط القشرية البروتينات أكتين-ملزمة، مثل IQGAP1، ميكروتوبوليس من خلال التفاعل مع البروتين المجمعات التي تزين نهايات الجمع microtubule21. وتشمل هذه المجمعات الحيوية للبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة EB1 ومقطع-170، التي يشار إليها مجتمعة وصفه ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية تتبع البروتينات (+ نصائح)21،22. + يمكن ربط نصائح في نهايات microtubules البروتينات المرتبطة بغشاء البلازما أو cytoskeleton أكتين القشرية. هذا يسمح لآليات توليد القوة (مثلاً، الناقص-النهاية توجيه حركة دينين كورتيكالي ترتكز على طول microtubules) بذل سحب القوات في ميكروتوبوليس ومن ثم تغيير موضع بعد. ربط البروتين السقالات المرتبطة أكتين IQGAP123قصاصة-170، وقد أظهرنا أن كلا من هذه البروتينات مطلوبة من أجل الاستقطاب الناجم عن المركز بعد نحو المشبك محصنة ضد17. هذا التفاعل IQGAP1-القصاصة-170 قد تلعب دوراً رئيسيا في تنسيق إعادة عرض cytoskeleton الأكتين مع إعادة تنظيم شبكة microtubule في المشبك محصنة ب-الخلية.

وكشفت مجهرية الفلورية التقليدية المثيرة إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك محصنة خلية ب2. ومع ذلك، لا يمكن حل هذا النهج الهياكل الخلوية الصغيرة بالتفصيل بسبب الحد حيود الضوء، الذي، وفقا للقانون لأبي، ويعتمد على الطول الموجي للضوء المستخدمة لإلقاء الضوء على العينة وفتحه موضوعية24. يقيد هذا الحد حيود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية إلى 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي و 500-700 نانومتر في اتجاه محوري25. ولذلك، سوبسيلولار هياكل أصغر حجماً، فضلا عن التفاصيل الدقيقة سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، يمكن فقط ملاحظة باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني. التصوير بالميكروسكوب الإلكتروني سيتوسكيليتون هو مضيعة للوقت، ويتطلب عينة قاسية وتثبيت وإعداد البروتوكولات التي يمكن أن تغير الهياكل البيولوجية، ويقتصر على الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة. القدرة على إيمونوستاين وفي نفس الوقت صورة بروتينات متعددة أو الهياكل الخلوية ميزة كبيرة للفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار في الخلايا يتيح التصوير في الوقت الحقيقي ومفيد عندما لا تتوفر الأجسام المضادة الفعالة ل immunostaining بروتين الفائدة.

الأخيرة التقدم التكنولوجي في مجال مجهرية فائقة القرار التغلب على حدود حيود الضوء والسماح لهم التصور من النانو الهياكل الخلوية24. مثل أسلوب مجهرية فائقة القرار واحد يسمى مجهرية استنفاد (STED) حفز الانبعاثات. وتوظف STED اثنين من أشعة الليزر، حيث ليزر واحد يثير في فلوروفوري وليزر ثانية مع نقش على شكل دونات بشكل انتقائي يمنع انبعاث fluorescence حولها فلوروفوري. هذا يقلل من انتشار نقطة الدالة (منطقة الظاهرة) من الجسيمات الفلورية واحد ويوفر حيود الفرعية حد صورة فلورسنت25،26. كما تستخدم استنزاف الأرض-دولة مجهرية التقنيات المستندة إلى الأسفار للحصول على صور فائقة الدقة. ومع ذلك، مرات اقتناء والتعمير في الصورة طويلة وهناك عدد محدود فقط من فلوروفوريس التي يمكن استخدامها والتصوير عالي الدقة المتزامنة من عدة مكونات cytoskeletal يمثل تحديا تقنيا للحفاظ على هياكل أكتين و microtubule يتطلب إجراءات مختلفة من التثبيت. ولذلك، STED مزايا متعددة أكثر من المجهر الإلكتروني ونهج أخرى مجهرية فائقة القرار حيث أنه يوفر الحصول على الصور السريعة، ولديه الحد الأدنى من متطلبات تجهيز، وتوظف فلوروفوريس نفسه وتلطيخ تقنيات التي يتم استخدامها الفلورية التقليدية الفحص المجهري لعينات ثابت26.

الآن وقد استخدم مجهرية فائقة القرار لتصور الهياكل أكتين على المشبك المناعي في الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعي وتي الخلايا26،27،،من2829،30، 31-بيد تصوير القرار فائقة من سيتوسكيليتون ميكروتوبولي، وكذلك تنسيق إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك المناعية، إلا في الآونة الأخيرة عنها17. كنا مجهرية STED الصورة ب الخلايا التي كان قد سمح لتنتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، مما حفز المركز الإشارات والشروع في عملية إعادة التنظيم cytoskeleton. عندما مطلي على الأجسام المضادة-Ig المعطل تداولها، خلايا ب الخضوع درامية أكتين-تعتمد على الانتشار، الذي يلخص الأحداث الأولى أثناء تشكيل المشبك محصنة. الأهم من ذلك، الفحص المجهري STED كشف التفاصيل الدقيقة لعصابة الجذعية من أكتين و أشكال في المحيط المناعة المشبك وأظهرت أن بعد، فضلا عن microtubules المرتبطة به، قد انتقلت قريبة من موقع الاتصال مستضد17. هذه microtubules الموسعة إلى الخارج نحو الحلقة المحيطية من أكتين و. وعلاوة على ذلك، تصوير STED متعدد الألوان من توليفات مختلفة من F-أكتين، توبولين، IQGAP1، ومعلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 + نصائح بينت أن microtubule زائد-ينتهي تميزت CLIP-170-التجارة والنقل ارتباطاً وثيقا مع meshwork أكتين الطرفية، ومع IQGAP1، التقاط القشرية البروتين17.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتصوير سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي في المشبك محصنة ضد استخدام الفحص المجهري STED. وقد تم تحسين هذه الأساليب باستخدام الخط مورين بالخليه A20، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة المركز الإشارات والمشبك محصنة ضد تشكيل17،،من3233،،من3435 , 36 , 37 , 38 , 39-نظراً لأن الأجسام المضادة التجارية إلى القصاصة-170 لا تعمل جيدا بالنسبة إيمونوستاينينج في التجارب السابقة، يصف لنا بالتفصيل التعبير عن معلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 في الخلايا A20، جنبا إلى جنب مع تلطيخ البروتوكولات لتصور في نفس الوقت تصل إلى ثلاثة مكونات cytoskeletal أو البروتينات المرتبطة سيتوسكيليتون. أساليب لاستخدام STED المجهري للصورة أكتين في ناغورني كاراباخ الخلايا المناعية نهايات منذ الموصوفة سابقا40. هنا، نحن تمديد هذا للحصول على صور متعددة الألوان فائقة القرار سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء في الخلايا ب.

يتم استخدام أحد الاعتبارات الهامة مجهرية فائقة القرار إجراءات التثبيت المناسبة للحفاظ على الهياكل الخلوية ومنع الأضرار بالبروتينات الفلورية. لقد تم تحسين التثبيت وتلطيخ الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة الاحتفاظ بالأسفار التجارة والنقل وتوفير تصوير عالي الدقة من شبكات أكتين وميكروتوبولي. عند التعبير عن البروتينات الفلورية، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا ب يصعب عادة ترانسفيكت. استخدام هذا البروتوكول، 20-50% من A20 يعرب الخلايا عادة البروتين فيوجن التجارة والنقل ترانسفيكتيد وبين هذه الفئة من السكان هي مستويات البروتين التعبير المتغير. ومع ذلك، تصوير فائقة القرار أكتين وميكروتوبوليس باستخدام الإجراءات التي يمكننا وصف قوية جداً وهي سهولة الحصول على صور عالية الجودة. وعلى الرغم من صغر حجمها بالنسبة إلى الخلايا A20، نظهر أن هذه الإجراءات يمكن أيضا استخدامها لصورة الشبكة ميكروتوبولي في الخلايا ب الأولية التي قد تم تفعيلها بإيجاز مع lipopolysaccharide (LPS). وقد أظهرنا أن لبس تنشيط الخلايا ب الابتدائي يمكن تكون transfected مع سيرناس في كفاءة عالية نسبيا (أي، مثل أن نضوب البروتين يمكن الكشف عنها بواسطة immunoblotting)، يجعلها بديلاً جيدا لاستخدام خطوط الخلايا ب لبعض الدراسات 17.

Protocol

وافق جميع الإجراءات الحيوان بالجامعة "اللجنة الرعاية الحيوانية في مقاطعة كولومبيا البريطانية".

1-الإعراب عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء-الانصهار في الخلايا A20 ب-سرطان الغدد الليمفاوية

  1. الثقافة A20 الخلايا في إكمال ربمي المتوسطة (ربمي-1640 تستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS)، 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol، الجلوتامين 2 مم، بيروفات 1 مم، 50 يو/مليلتر البنسلين و 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) عند 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة مع 5 % CO2.
  2. تحضير الكاشف تعداء (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: قد تم تحسين هذا البروتوكول الكواشف محددة وبروتوكول تعداء الموصوفة في الجدول للمواد. لم تؤد الكواشف تعداء الأخرى التي حاولنا كافية تعداء الكفاءة.
  3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. أجهزة الطرد المركزي 2.5 × 106 A20 الخلايا (لكل تعداء) لمدة 5 دقائق في 525 x غ. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من تعداء الكاشف الذي يحتوي على 1-2.5 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي. للحمض النووي ترميز مقطع-170-بروتينات فلورية خضراء23، استخدام 2.5 ميكروغرام كل تعداء. المزيج بلطف.
  4. نقل الخلايا إلى بئر للوحة 6-جيدا، وضبط مستوى الصوت إلى 2 مل مع حرارة قبل المتوسطة ربمي كاملة. ثقافة الخلايا ح 18 في 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير البروتين.

2-عزل الخلايا الأولية الماوس ب وتفعيل لهم بلبس

  1. استخدام أدوات جراحية معقمة لإزالة الطحال من ماوس، عقب البروتوكولات التي وافقت عليها "اللجنة العناية بالحيوان" للمؤسسة.
  2. في هود زراعة الأنسجة، وضع مصفاة خلية عقيمة 70-ميكرومتر في طبق استنبات الأنسجة 35 ملم تحتوي على 3 مل من درجة حرارة الغرفة PBS العقيمة. استخدم الجزء المطاط من المكبس من حقنه 5 مل لسحق الطحال من خلال مصفاة الخلية.
  3. بيبيت تعليق خلية واحدة من سبلينوكتييس إلى أنبوب 15 مل العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 525 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. استخدام عزل مغناطيسي على أساس حبة بخليه كيت (انظر الجدول للمواد) للحصول على عدد سكانها ب خلايا التخصيب.
  5. ريسوسبيند الخلايا ب إلى 3 × 106/mL في كامل ربمي المتوسطة وتستكمل مع 2.5 ميكروغرام/مل لبس زائد 5 نانوغرام/مل بخليه تنشيط عامل (باف؛ سيتوكين البقاء على قيد الحياة).
  6. الثقافة الخلايا للموارد البشرية 6 عند 37 درجة مئوية.

3-طلاء الزجاج كوفيرسليبس مع الأجسام المضادة-Ig

  1. إعداد الحل جسم لطلاء كوفيرسليبس. تمييع الحل الأسهم من أجسام Ig الماعز-مكافحة--الماوس في درجة حرارة الغرفة PBS العقيمة لجعل حل 12.5 ميكروغرام/مل؛ 400 ميليلتر من جسم الحل مطلوب لكل ساترة.
    ملاحظة: استخدام الماوس لمكافحة الماعز مفتش A20 الخلايا؛ استخدام الماوس الماعز المضادة IgM الابتدائي ب الخلايا. الأجسام المضادة "مفتش الماعز" لا تربط جيدا لمستقبلات Fc الماوس. بيد لتجنب أي ملزم مستقبلات Fc المحتملة، أحد استخدام الأجزاء2 F(ab) أو F(ab') للماوس المضادة IgG أو الأجسام المضادة IgM الماوس المضادة.
  2. تراجع ساترة #1.5 زجاج جولة 18 ملم في 100 ٪ الميثانول وأتركها تجف تماما (~ 10 دقيقة).
  3. استخدام الملقط، ضع ساترة المجففة في زراعة الأنسجة جيدا 12 لوحة وبيبيت 400 ميليلتر 12.5 ميكروغرام/مل جسم الحل (5 ميكروغرام المجموع؛ 2 ميكروغرام/سم2) على ساترة حتى أن تشكل فقاعة في مركز ساترة وينتشر إلى الحواف.
  4. كن حذراً لتغطية ساترة كامل، ولكن لا تسمح بحل جسم تمديد الماضي حافة ساترة زجاجية وعلى البلاستيك زراعة الأنسجة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. أغسل كوفيرسليبس حسب بيبيتينج 1 مل من PBS العقيمة إلى يسفط جيدا ومن ثم الخروج الحل. كرر مرتين أخريين إزالة الأجسام المضادة غير منضم.
  6. أضف 1 مل PBS العقيمة إلى التقرير كذلك تتضمن ساترة المغلفة بالأجسام المضادة حتى الخلايا على استعداد لإضافة.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ كوفيرسليبس في درجة حرارة الغرفة، مغطاة ببرنامج تلفزيوني، لاستخدامها في نفس اليوم.

4-خلية بينتشر في Ig المغلفة مكافحة كوفيرسليبس

  1. إعداد تعديل هيبيس مخزنة المالحة (مهبس): 25 مم هيبيس، الرقم الهيدروجيني 7.2، 125 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1 مم كاكل2، 1 مم نا2هبو4، 0.5 مم MgSO4، 1 ملغ/مل سكر العنب، الجلوتامين 2 مم، بيروفات صوديوم 1 مم، و 50 ميكرون 2-ميركابتوثانول). فلتر تعقيم هذا الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. في يوم التجربة، تجعل 50 مل مهبس مع 2% FBS (مهبس-FBS) بإضافة 1 مل من الحرارة إبطال FBS مهبس 50 مل. الحارة في مهبس FBS إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. الطرد المركزي A20 transfected الخلايا أو الخلايا ب الأولية التي قد تم مثقف مع باف بالإضافة إلى لبس في 525 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من مهبس-FBS، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، وتمييع الخلايا إلى 2 × 105 خلايا/مل في مهبس-FBS.
  5. استخدام الملقط، نقل ساترة من لوحة زراعة الأنسجة إلى قطعة من الفيلم البارافين.
  6. إضافة 250 ميليلتر من خلايا ب (5 × 104 خلايا) لكل ساترة.
  7. احتضان كوفيرسليبس في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام للسماح للخلايا ب لتنتشر على السطح المغلفة مفتش مكافحة.

5-تحديد وإيمونوستينينج الخلايا

  1. إعداد تثبيت الحل بتمييع الحل الأسهم بارافورمالدهيد 16% وحل الأسهم glutaraldehyde 50% في الماء المقطر بدرجة حرارة الغرفة تسفر عن تركيزات نهائية من 3 ٪ glutaraldehyde بارافورمالدهيد و 0.1 في المائة. إعداد الحل التثبيت في اليوم إلى استخدامها، وتجاهل أي فائض.
    تنبيه: بارافورمالدهيد و glutaraldehyde الأسهم يجب فقط استخدام الحلول في غطاء الأبخرة كيميائية. اتبع الإرشادات التي تظهر في صحيفة بيانات سلامة المواد (MSDS).
  2. إعداد المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن/حجب (BSA 3% و 0.1% X-100 تريتون المخفف في برنامج تلفزيوني). فلتر تعقيم هذا الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية. في يوم التجربة، الحارة المبلغ المطلوب لدرجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد المخزن المؤقت المصبوغة (1% صابونين جيش صرب البوسنة و 0.1 في المائة في برنامج تلفزيوني). هذا الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية. في يوم التجربة، الحارة المبلغ المطلوب لدرجة حرارة الغرفة.
  4. بيبيت 350 ميليلتر محلول التثبيت على كل ساترة، ضمان أن تغطي السطح تماما. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام.
  5. إزالة تثبيت الحل من ساترة يسفط بعناية من حافة ساترة استخدام ميكروبيبيت.
    تنبيه: يجب أن يتم تجاهل الحل التثبيت كالنفايات الكيميائية الخطرة.
  6. أغسل كوفيرسليبس مرة واحدة مع 500 ميليلتر permeabilization/حجب المخزن المؤقت. بيبيت قبالة السائل.
  7. بيرميبيليزي وكتلة الخلايا بإضافة 250 ميليلتر permeabilization/حجب المخزن المؤقت لكل ساترة، وحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  8. تمييع أرنب tubulin المضادة الأجسام المضادة 1: 100 في تلطيخ المخزن المؤقت.
  9. نضح إيقاف المخزن المؤقت حظر/بيرميبيليزيشن من كوفيرسليبس، وإضافة 50 ميليلتر من الحل المخفف tubulin المضادة جسم لكل ساترة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  10. إعداد الحل الثانوي جسم/أكتين وصمة عار بإضعاف كل من الماعز مترافق أليكسا فلور 532 أرنب المضادة مفتش الثانوي جسم ومترافق 568 فلور أليكسا فالويدين 1: 100 في تلطيخ المخزن المؤقت.
  11. تغسل في كوفيرسليبس 3 مرات لإزالة الأجسام المضادة الأولية الزائدة بإضافة 500 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت وثم يسفط عليه.
  12. إضافة 50 ميليلتر الحل الثانوي جسم/أكتين وصمة عار لكل ساترة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  13. تغسل في كوفيرسليبس 3 مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة بإضافة 500 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت وثم يسفط عليه.
  14. إضافة 10 ميليلتر من كاشف المتصاعدة على شريحة مجهر. جبل ساترة على شريحة المجهر مع الجانب خلية لأسفل.
    ملاحظة: وسيلة متزايدة "تتلاشى المضادة" (انظر الجدول للمواد) ينصح بشدة للحفاظ على كثافة الأسفار من البروتينات فيوجن التجارة والنقل. تجنب استخدام تركيب الكواشف التي تحتوي على DAPI، التي يمكن أن تتداخل مع تصوير فلوروفوريس عند استخدام الليزر STED.
  15. السماح بأن الشرائح الجافة بين عشية وضحاها في الظلام. صورة الشرائح في اليوم التالي.
    ملاحظة: التصوير الشرائح بمجرد ساترة الجافة ينصح بشدة، كما ستنخفض fluorescence التجارة والنقل مع مرور الوقت.

6-التصوير باستخدام مجهر STED

ملاحظة: يرجى ملاحظة أن جميع البرامج الخطوات الموضحة أدناه الخاصة بالمجهر والبرمجيات المستخدمة ونحن (انظر الجدول للمواد). الخطوات والإعدادات سوف تحتاج إلى تعديل إذا كان يتم إجراء التصوير باستخدام مجهر/برامج مختلفة.

  1. تشغيل المجهر STED وتنشيط بأشعة الليزر ومصباح إضاءة ابيفلوريسسينسي، وبدء برنامج المجهر.
  2. تعيين المعلمات لاستنفاد STED الليزر.
    ملاحظة: هذا سيتوقف على المجهر المحددة المستخدمة والليزر التي هي مجهزة. وأوصى بعض الإعدادات هي الضوء الأبيض (ذ) 70 في المائة؛ 592 نانومتر ليزر 80%؛ 660 نانومتر ليزر 80%.
  3. تنشيط إعدادات STED ومحاذاة أشعة الليزر STED استخدام الهدف X 100.
  4. باستخدام العدسة، تركز النموذج وحدد خلية مع معتدلة بروتينات فلورية خضراء التعبير.
    ملاحظة: التعبير انخفاض بروتينات فلورية خضراء لن تكون مرئية ل STED يقلل كثافة الانبعاثات. على العكس من ذلك، يدفع التعبير عالية من قصاصة-170-التجارة والنقل عفوية تشكيل التكتلات الكبيرة، التي لا تعكس microtubule العادي بروتين زائد في نهاية معقدة مورفولوجيا والتوزيع. تحديد خلية مع معتدلة بروتينات فلورية خضراء التعبير ضروري لدقة التصوير هياكل سيتوسكيليتال في موقع الاتصال مستضد.
  5. تكبير الخلية المحددة واختر منطقة اهتمام تصويرها. ضبط التركيز حيث أن الطائرة س-ص بالخليه الأقرب إلى ساترة في التركيز.
    1. للقيام بذلك، نقل الهدف تدريجيا أقرب إلى ساترة حيث أن هياكل cytoskeletal خلية بموضع التركيز، وثم انتقل من التركيز. ثم تدريجيا نقل الهدف في الاتجاه المعاكس حتى هياكل cytoskeletal خلية باولا العودة إلى التركيز.
  6. تحسين الإعدادات بما في ذلك السلطة الليزر وشعاع الإثارة، والكشف عن النطاق. تبدأ مع الإعدادات الموصى بها حسب إرشادات الشركة المصنعة. قم بعمل التعديلات اللازمة لتحسين الإشارة للعينات. صورة جميع العينات مقارنتها ببعضها البعض بنفس الإعدادات.
  7. ضمن علامة التبويب "اكتساب" من البرنامج، تعيين الحصول على صورة لاقتناء الإطار متسلسلة في اللوحة اليسرى السفلي "التفحص متسلسلة" بالتحقق من الخيار "بين الإطارات".
  8. تعيين تسلسل حيازتها.
    ملاحظة: نكتسب fluorescence بروتينات فلورية خضراء أولاً لتفادي تدهور إشارة التجارة والنقل.
    اعتماداً على مزيج فلوروفوريس التي يتم استخدامها بالإضافة إلى التجارة والنقل، التصوير إشارة fluorescence الطول الموجي الأطول أولاً قد تسفر عن نتائج أفضل. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل بالترتيب الذي تعرض ليحث إذاعة استنزاف fluorophores أو بروتينات الفلورسنت وتصويرها الحصول على إشارات fluorescence أقوى وأفضل قرار.
  9. تحديد وتعيين السلطة الليزر STED لكل فلوروفوري تحت علامة التبويب "الحصول على" البرمجيات، واستخدام شريط التمرير ل 592-نانومتر أو الليزر STED 660 نانومتر لضبط قوة الليزر. ضبط السلطة الليزر من استنفاد 592-شمال البحر الأبيض المتوسط للتجارة والنقل و 532 فلور أليكسا. ضبط قوة الليزر من استنفاد 660 نانومتر 568 فلور أليكسا.
  10. لزيادة دقة وتقليل الإشارات الخلفية، انتقل إلى إعدادات "حيازة" ضمن علامة التبويب "اكتساب" من البرنامج، زيادة على الخط و/أو الإطار المتوسط عن طريق تحديد قيمة أكبر من 1 باستخدام القائمة المنسدلة لكل خيار.
  11. أيضا، الحصول على إشارة الفلورية استخدام بوابات الوقت STED بالتحقق من الخيار النابضة ل fluorophore تحت علامة التبويب "اكتساب"، وتعيين القيم للساعة النابضة (راجع الملاحظة أدناه). زيادة قوة الليزر STED لتعزيز القرار، على الرغم من أن هذا سيزيد من فوتوبليتشينج فلوروفوريس.
    ملاحظة: سوف تحتاج إلى الوقت النابضة الأمثل للمجهر وعينه، وفلوروفوريس المستخدمة. الساعة النابضة من 0.3 إلى 6 يوصي ns. بعد التثبيت، التجارة والنقل حساس بشكل خاص لليزر عالية الطاقة. للحد من فوتوبليتشينج للتجارة والنقل، وينبغي تطبيق النابضة الوقت وينبغي خفض قوة الليزر STED.
  12. لالتقاط صور STED 3D، استخدم شريط التمرير لتغيير النقطة انتشار الدالة (PSF) إلى "STED ثلاثي الأبعاد".
  13. الحصول على صور متعددة لضمان إمكانية تكرار نتائج يدوياً. ديكونفولفي الصور (انظر الشكل 1) استخدام برمجيات deconvolution حزمة41(انظر الجدول للمواد).

النتائج

ب خلايا تنتشر في Ig مكافحة المعطل تداولها، يوفر STED المجهري تستخدم بالاقتران مع برامج deconvolution الصور دقة أعلى من هياكل سيتوسكيليتال من الفحص المجهري [كنفوكل]. وهذا واضح في الشكل 1، حيث كانت تصور الشبكة أكتين و استخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه. مقارنة بين [كنفو?...

Discussion

يمكن الحصول على صور مفصلة للهياكل سيتوسكيليتال باستخدام مجهرية فائقة القرار STED، الذي يمكن نظرياً أن التوصل إلى قرار 50 نانومتر، مقارنة بالفحص المجهري [كنفوكل] التقليدية، الذي هو قرار حيود محدودة ~ 200 nm 24-كما تم تعزيز القدرة على حل الهياكل الدقيقة باستخدام البرمجيات deconvolution لحس?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر "مرفق التصوير معهد علوم الحياة جامعة كولومبيا البريطانية" (LSI) لدعم وصيانة المجهر STED. تم تمويل هذا العمل بمنحه #68865 من "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (M.R.G.). ونشكر الدكتور كوزو كايبوتشي (جامعة ناغويا، ناغويا، اليابان) على بلازميد CLIP-170-التجارة والنقل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
A20 mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific R0883
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific12483020Heat inactivate at 56 oC for 30 min
2-mercaptoethanolMillipore SigmaM3148
GlutamineMillipore SigmaG5763
Sodium pyruvateMillipore SigmaP5280
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Liquid, 10,000 units
Additional materials for primary B cells
70-µm cell strainerCorning352350
Magnetic bead-based B cell isolation kitStemcell Technologies19854EasySep Mouse B cell Isolation kit
Lipopolysaccharide (LPS)Millipore SigmaL4391LPS from E. coli 0111:B4
B cell-activating factor (BAFF)R&D Systems2106-BF-010
NameCompanyCatalog NumberComments
Transfection
Plasmid encoding CLIP-170-GFPGift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Recommended transfection reagents and equipment
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Program L-013 used
Falcon 6-well plates, TC treated, sterileCorning353046
NameCompanyCatalog NumberComments
Coating coverslips
18-mm diameter round #1.5 cover glassesThomas Scientific1217N81Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580
ForcepsFisher Scientific1381242Dissecting extra fine splinter forceps
Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plateCorning353043
100% methanolFisher ScientificA412-4
Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumThermo Fisher Scientific10010049
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch115-005-008For A20 cells
Goat-anti-mouse IgM antibodyJackson ImmunoResearch115-005-020For primary mouse B cells
NameCompanyCatalog NumberComments
Staining
Paraformaldehyde (16% stock solution)Electron Microscopy Sciences15710Dilute with PBS to working concentration
Glutaraldehyde (50% stock solution)Millipore Sigma340855Dilute with PBS to working concentration
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponinMillipore SigmaS2149
Bovine serum albumin (BSA), Fraction VMillipore Sigma10735094001
Rabbit anti-tubulin antibodyAbcamab528661:250 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA110091:100 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 568-conjugated phalloidinThermo Fisher ScientificA123801:100 dilution recommneded but should be optimized
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970Without DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
ParafilmVWRP1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DextroseFisher ScientificD16-500
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopy
Leica SP8 TCS STED microscopeLeica
Huygens deconvolution softwareScientific Voume ImagingSee https://svi.nl/HuygensProducts

References

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
  6. Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
  7. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
  8. Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
  9. Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
  10. Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
  11. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
  12. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  13. Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  14. Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
  15. Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
  16. Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
  17. Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
  18. Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
  19. Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
  20. Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
  21. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  22. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  23. Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
  24. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
  25. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  26. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  27. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
  28. Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
  29. Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
  30. Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
  31. Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
  32. Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
  33. Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
  34. McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
  35. Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
  36. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  37. Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
  38. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  39. Yuseff, M. -. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  40. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  41. Russ, J. C. . The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).
  42. Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
  43. Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134 microtubules microtubule STED

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved