JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол с помощью микроскопии интереса одновременно изображение актина структур, микротрубочки и микротрубочек плюс конец связывания белков в клетках B, которые распространились на coverslips покрытием с антителами к B-клеточный рецептор, модель для начального этапа формирования иммунной синапса.

Аннотация

B-клеток, которые связывают мембраны прыгните антигены (например, на поверхности антиген представляющих клеток) образуют иммунной синапса, специализированные клеточную структуру, которая оптимизирует B-клеточной сигнализации рецептора (BCR) и приобретение BCR-опосредованной антигена. Ремоделирование Цитоскелет актина и переориентации микротрубочек сети к антигена контакт сайта имеют важное значение для формирования иммунной синапса. Ремоделирование Цитоскелет актина в плотной периферийное кольцо F-актина сопровождается поляризации микротрубочек Организация центра к иммунной синапсе. Микротрубочки плюс конец связывания белков, а также белки корковых плюс конец захвата посредником физических взаимодействий между актина и микротрубочек cytoskeletons, которые позволяют им быть реорганизована на скоординированной основе. Изучение механизмов управления, которую этот цитоскелета реорганизации, а также понять как эти цитоскелета структуры формы формирования иммунной синапса и BCR сигнализации, может обеспечить новое понимание активации B клеток. Это способствовало разработке суперразрешением микроскопии подходов, которые показывают новые детали цитоскелета сети Организации. Здесь мы описываем метод с помощью микроскопии простимулированное излучение истощения (интереса) одновременно изображение актина структур, микротрубочки и transfected GFP-тегами микротрубочек плюс конец связывания белков в клетках B. Модель раннего события в формировании иммунитета синапса, мы позволяем клетки B распространить на coverslips покрытием с anti-иммуноглобулина (анти Ig) антител, которые инициируют BCR сигнализации и модернизация цитоскелета. Мы предоставляем пошаговые протоколы для выражения GFP синтез белков в клетках A20 B-лимфомы, за распространение анти Ig индуцированной клеток и для фиксации последующие ячейки, иммуноокрашивания, получение изображения и изображения деконволюция шаги. Изображения с высоким разрешением, полученных с помощью этих процедур позволяют одновременно визуализировать актина структуры, микротрубочки и микротрубочек плюс конец связывающих белков, которые могут связать эти две сети цитоскелета.

Введение

Когда клетки B связать поляризованных массивы антигенов (например, отображаются на поверхности антиген представляя клетки (АПК)), полученный B-клеточный рецептор (BCR) сигнализации диски, формирование структуры классический иммунной синапса, который был впервые описано в T клетки1,2,3,4,5,6,,78,9,10, 11,12,13. Первоначально microclusters формы БКРС антиген прыгните на периферии клетки B: APC связаться с сайта. Эти microclusters затем двигаться в направлении центра антигена контакт сайта, где они сливаются в Центральной супрамолекулярные активации кластер (cSMAC), который образует ядро иммунной синапса. Формирование иммунной синапса оптимизирует BCR сигнализации и облегчает извлечение BCR-опосредованной антигена APC мембраны14. Это приобретение антиген, который следуют интернализации BCR-опосредованной антигена и обработки последующих антигена, позволяет клетки B представить пептида: MHC II комплексов для Т-клетки и вызывают Т-клеток помощь14. Потому что формирование иммунной синапса способствует активации клеток B, определить механизмы, которые устанавливают этот функциональный шаблон Организации рецептор может обеспечить новое понимание как гуморального иммунного ответа инициируются и регулируется.

Реорганизация актина и микротрубочек cytoskeletons имеет важное значение для формирования иммунной синапса. Локализованные BCR сигнализации стимулируется пространственно поляризованных массив антигенов стимулирует быстрое и резкое ремоделирования Цитоскелет актина,1,,15. Формирование структур дендритных актина на периферии клетки B оказывает движущей силы на плазматической мембраны и способствует клетки B распространения. Это позволяет клетки B для сканирования большую площадь поверхности антиген подшипник и увеличивает количество БКРС, которые связывают антигена и активировать BCR, сигнальные пути. В то же время сеть микротрубочек и КТВМ переориентирована на сайт антигена контакта. Как КТВМ подходов контакт сайта антигена, микротрубочки, вытекающих из КТВМ протянулись вдоль внутренней поверхности плазматической мембраны на стыке между клетки B и поверхности антиген подшипника16,17. Затем эти juxtamembrane микротрубочки может выступать в качестве треков для Динеин опосредованной центростремительного движения антиген прыгните BCR microclusters18, приводит к образованию cSMAC.

Переориентация и поляризации КТВМ к иммунной синапса требует нетронутыми актина и микротрубочек cytoskeletons и часто зависит от взаимодействия между корковой актина сети и микротрубочек16,17, 19,20. Корковых актин связывающих белков, таких как IQGAP1, можно захватить микротрубочек, взаимодействуя с белковых комплексов, которые украшают микротрубочек плюс заканчивается21. Эти динамические комплексы плюс конец связывания белков включают в себя EB1 и клип-170, которые обозначаются как микротрубочек плюс конец отслеживания белков (+ советы)21,22. + Подсказки на концах микротрубочек можно привязать к белки, которые связаны с плазматической мембраны или корковые актина цитоскелета. Это позволяет силы создание механизмов (например, минус конец направленного движения cortically якорь Динеин вдоль микротрубочек) оказывают потянув силы на микротрубочек, и тем самым изменить КТВМ. КЛИП-170 можно привязать к актин связанные леса белка IQGAP123, и мы показали, что оба эти белки необходимы для КТВМ BCR-индуцированной поляризации к иммунной синапса17. Это взаимодействие IQGAP1-клип-170 может играть ключевую роль в координации, Ремоделирование Цитоскелет актина с репозиционирования микротрубочек сети на B-клетки иммунной синапса.

Обычных флуоресцентной микроскопии показал резкое реорганизации актина и микротрубочек cytoskeletons во время B-клетки иммунной синапса формирования2. Однако этот подход не может разрешить небольших клеточных структур в деталях из-за дифракционный предел света, который, согласно закону Аббе, зависит от длины волны света, используется для освещения образца и диафрагмы объективных24. Этот дифракционный предел ограничивает разрешение обычного света Микроскопы до 200-300 Нм в боковой направлении и 500-700 Нм в осевом направлении25. Таким образом меньше внутриклеточных структур, а также мелкие детали актина и микротрубочек cytoskeletons, можно только наблюдать с помощью электронной микроскопии. Микроскопии изображений цитоскелета отнимает много времени, требует суровых образца фиксации и подготовка протоколов, которые можно изменять биологических структур и ограничен для обнаружения антител опосредованной. Способность к имунноконтраст и одновременно изображение несколько белков или клеточных структур является существенным преимуществом микроскопии флуоресцирования. Кроме того выражая флуоресцентные синтез белков в клетках позволяет в реальном времени обработки изображений и является полезным, когда эффективные антитела для иммуноокрашивания протеина интереса не доступны.

Последние технологические достижения в микроскопии суперразрешением преодолеть ограничения дифракции света и позволяет визуализировать наноразмерных клеточных структур24. Один из таких методов микроскопии суперразрешением называется микроскопии простимулированное излучение истощения (интереса). СИГНАЛУ использует два лазера, где один лазерный возбуждает Флюорофор и второй лазерный с рисунком форме пончика избирательно подавляет флуоресценции выбросов вокруг Флюорофор. Это уменьшает точки распространения функция (очевидной район) одной флуоресцентные частицы и предоставляет югу дифракционный предел флуоресцентного изображения25,26. Микроскопия истощение земли государство также использует методы, основанные на флуоресценции, приобрести супер-разрешение изображения. Однако долгое время приобретения и реконструкции изображения, есть только ограниченное количество флуорофоров, который может быть использован, и одновременно с высоким разрешением изображения нескольких цитоскелетных компонентов технически сложным, потому что поддержание Актин и микротрубочек структур требует фиксации различных процедур. Таким образом интереса имеет несколько преимуществ над электронной микроскопии и других микроскопии суперразрешением подходы в том, что он предлагает быстрое изображение приобретения, имеет минимальные требования к пост-обработки и использует же флуорофоров и пятная методы которые используются для обычных флуоресцентной микроскопии фиксированной образцы26.

Супер-резолюции микроскопии теперь был использован для визуализации актина структур на иммунные синапсов в естественных убийца клеток (НК) и T клетки26,27,28,,2930, 31. Однако, супер резолюции изображений микротрубочек цитоскелета, а также скоординированных реорганизации актина и микротрубочек cytoskeletons во время формирования иммунной синапса, лишь недавно был сообщил17. Мы использовали интереса микроскопии изображений B клеток, которые было разрешено распространить на coverslips покрытием с антителами anti-иммуноглобулина (анти Ig), которые стимулируют BCR сигнализации и инициировать реорганизацию цитоскелета. Когда покрытием на иммобилизованные антитела анти Ig, B клетки проходят драматические актин-зависит от распространения, который повторяет первоначальных событий во время формирования иммунной синапса. Важно отметить, что интереса микроскопии выявлены мелкие детали дендритных кольцо F-актина, что формы на периферии иммунной синапса и показало, что недалеко от антигена контакт сайта17переехали КТВМ, а также микротрубочек, прилагается к нему. Эти микротрубочек расширенной наружу к периферийное кольцо F-актина. Кроме того, многоцветные изображения интереса различных комбинаций F-актина, тубулин, IQGAP1 и GFP-тегами клип-170 + советы показали, что микротрубочки плюс концы отмечен клип-170-ГФП были тесно связаны с сеть периферийных актина и IQGAP1, корковых захвата белка17.

Здесь мы представляем подробный протокол для визуализации актина и микротрубочек cytoskeletons на иммунные синапса, с помощью микроскопии интереса. Эти методы были оптимизированы с помощью линии A20 мышиных клетки B, который широко использовался для изучения BCR сигнализации и иммунных синапса формирования17,,3233,,3435 , 36 , 37 , 38 , 39. Поскольку коммерческие антител к клип-170 не работает хорошо для иммуноокрашивания в предыдущих экспериментах, мы подробно описать выражение гена GFP-тегами клип-170 в клетках A20, наряду с пятная протоколы одновременно визуализации до три цитоскелетных компонентов или Белки цитоскелета связанные. Методы использования микроскопии интереса к Изображение актина в NK клеток иммунной синапсы были описаны ранее40. Здесь мы передаем это приобретение суперразрешением многоцветные изображения актина и микротрубочек cytoskeletons в клетки.

Критическое рассмотрение для микроскопии суперразрешением использует соответствующий фиксации процедур для поддержания клеточных структур и предотвращения ущерба для флуоресцентных белков. Фиксация и пятная методы, представленные в настоящем документе были оптимизированы для сохранить GFP флуоресценции и обеспечить высоким разрешением изображений сетей актина и микротрубочек. При выражении флуоресцентных белков, следует отметить, что клетки B, обычно трудно transfect. Используя этот протокол, 20-50% A20 клетки обычно выражают transfected синтез белка GFP, и среди этой группы населения уровень экспрессии белков являются переменными. Тем не менее, супер резолюции изображений актина и микротрубочек, с использованием процедур, мы описали довольно надежные и легко получаются изображения высокого качества. Несмотря на их небольшой размер относительно ячейки A20 мы показываем, что эти процедуры могут также использоваться для изображений в сети микротрубочек в первичных B-клетки, которые были кратко активированы с липополисахарида (LPS). Мы показали, что LPS-активированный первичной клетки B может transfected с малые интерферирующие РНК в относительно высокой эффективности (т.е., такие что истощение белка может быть обнаружен, immunoblotting), что делает их хорошей альтернативой для использования линий клетки B для некоторых исследований 17.

протокол

Все животные процедуры были утверждены в университете Британской Колумбии животное уход Комитета.

1. выражая GFP-синтез белков в клетках A20 B-лимфома

  1. Культура клетки А20 в полное RPMI среднего (с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), 50 мкм 2-меркаптоэтанол, глютамин 2 мм, 1 мм пируват, 50 ед/мл пенициллин и 50 мкг/мл стрептомицина RPMI 1640) при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с 5 % CO2.
  2. Подготовьте трансфекции реагента (см. Таблицу материалы) согласно инструкциям производителя.
    Примечание: Этот протокол был оптимизирован для определенных реагентов и протокол transfection описанные в Таблица материалов. Другие трансфекции реагенты, которые мы пытались не дали достаточных эффективность трансфекции.
  3. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Центрифуга 2,5 х 106 A20 клетки (для каждого трансфекции) за 5 мин в 525 x g. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл Реагента трансфекции, содержащие 1-2,5 мкг плазмидной ДНК. Для ДНК кодирования КЛИПА-170-GFP23используйте 2,5 мкг на transfection. Осторожно перемешать.
  4. Клетки перехода к хорошо 6-ну плиты и отрегулируйте громкость по 2 мл с подогретым полный RPMI среднего. Культура клетки для 18 ч при 37 ° C, чтобы позволить выражения протеина.

2. изоляция клетки первичной мыши B и активизируя их с ПЛАСТИНОК

  1. Использование стерилизовать хирургические инструменты для удаления селезенки из мыши, следующие протоколы, утвержденных Комитетом за учреждение животных.
  2. В культуре ткани капот место стрейнер клеток стерильные 70-мкм в 35-мм тканевой культуры блюдо, содержащие 3 мл стерильного PBS комнатной температуры. Используйте резиновые части поршень от шприц 5 мл, чтобы подавить селезенки через стрейнер ячейки.
  3. Накапайте одноклеточного подвеска splenoctyes в стерильную пробирку 15 мл и центрифуги на 525 x g за 5 мин.
  4. Использование магнитных клетки B на основе бисера изоляции комплект (см. Таблицу материалы) для получения высокообогащенного популяция клеток B.
  5. Ресуспензируйте B клеток/мл 3 x 10-6в полной RPMI среднего дополнена 2,5 мкг/мл LPS плюс 5 нг/мл клетки B активация фактор (BAFF; выживания цитокинов).
  6. Культура клетки для 6 ч при 37 ° C.

3. покрытие стекла Coverslips с антителами Anti-Ig

  1. Подготовьте раствор антител для покрытия coverslips. Разбавить раствор антител Ig коза анти мышь в комнатной температуре стерильные PBS сделать 12,5 мкг/мл раствора; Для каждого coverslip требуется 400 мкл раствор антител.
    Примечание: Использование коза против IgG A20 клетки; Использование коза анти IgM первичной клетки B. Коза IgG антитела не связывать хорошо мыши Fc рецепторов. Однако чтобы избежать любых потенциальных Fc рецептор привязки, можно использовать F(ab) или F(ab')2 фрагменты анти мыши IgG или против мышиных антител IgM.
  2. DIP #1.5 18-мм круглые стекло coverslip в 100% метанола и дайте ему высохнуть (~ 10 мин).
  3. С помощью щипцов, место сушеные coverslip в 12-ну тканевые культуры пластины и пипетки 400 мкл раствора 12,5 мкг/мл антитела (5 мкг всего; 2 мкг/см2) на coverslip, так что он образует пузырь в центре coverslip и простирается до края.
  4. Будьте осторожны, чтобы покрыть весь coverslip, но не позволяют раствор антител продлить за край стекла coverslip и на пластической культуры ткани. Инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
  5. В хорошо и впоследствии аспирационных решение для очистки coverslips дозирования 1 мл стерильного PBS. Повторите еще два раза, чтобы удалить несвязанные антитела.
  6. Добавьте 1 мл стерильного PBS в хорошо содержащие coverslip антителами пока клетки не готовы быть добавлены.
    Примечание: Coverslips может храниться при комнатной температуре, покрытые PBS, для использования в тот же день.

4. клетки B распространение на анти Ig покрытием Coverslips

  1. Подготовить изменения HEPES-амортизированное физиологический (mHBS): 25 мм HEPES, рН 7,2, 125 мм NaCl, 5 мм KCl, 1 мм CaCl2, 1 мм Na2HPO4, 0,5 мм MgSO4, 1 мг/мл декстрозы, глютамин 2 мм, пируват натрия 1 мм и 50 мкм 2-меркаптоэтанол). Фильтр стерилизовать это решение и хранить при 4 ° C.
  2. В день эксперимента, сделать mHBS с 2%-50мл FBS (mHBS-FBS) путем добавления 1 мл тепла инактивированная FBS 50 мл mHBS. Теплые mHBS-FBS до 37 ° C перед использованием.
  3. Центрифуга transfected клеток A20 или первичной B-клетки, которые были культивируемых с BAFF плюс LPS в 525 x g за 5 мин.
  4. Ресуспензируйте клеток в 1 мл mHBS-FBS, подсчитать количество ячеек с помощью Горяева и разбавить клетки 2 x 105 клеток/мл в mHBS-FBS.
  5. С помощью щипцов, передать coverslip от культуры ткани пластины кусок парафина фильма.
  6. 250 мкл B (5 х 104 клетки), для каждого coverslip.
  7. Инкубируйте coverslips при 37 ° C 15 мин в темноте, чтобы позволить клетки B распространить на анти IgG покрытием поверхности.

5. крепление и иммуноокрашивания клетки

  1. Подготовьте решение фиксации путем разбавления параформальдегида 16% раствор и Стоковый раствор 50% глютаральдегид в комнатной температуре дистиллированной воде произвести окончательный концентрации 3% параформальдегида и 0,1%-го раствора. Приготовляют раствор фиксации на тот день, когда это использоваться и отбросить лишнюю.
    Предупреждение: Параформальдегида и глутаровый акций решения должно использоваться только в химической зонта. Следуйте инструкциям на паспорт безопасности материала (MSDS).
  2. Подготовка permeabilization/блокирование буфера (BSA 3% и 0,1% тритон X-100 разводят в PBS). Фильтр стерилизовать это решение и хранить при 4 ° C. В день эксперимента теплый необходимой суммы до комнатной температуры.
  3. Подготовьте окрашивание буфера (1% BSA и 0,1% сапонинов в PBS). Стерилизовать это решение, используя фильтр 0.2 мкм и хранить при 4 ° C. В день эксперимента теплый необходимой суммы до комнатной температуры.
  4. Накапайте 350 мкл раствора фиксации на каждом coverslip, обеспечивая, что поверхность полностью покрыта. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
  5. Удаление решения фиксации из coverslip, тщательно аспирационных от края coverslip, с помощью micropipet.
    Предупреждение: Фиксация решения должны быть отклонены как опасных химических отходов.
  6. Мыть coverslips раз с 500 мкл permeabilization/блокировки буфера. Накапайте жидкости.
  7. Разрушения и блокировать ячейки, добавив 250 мкл permeabilization/блокирование буфера для каждого coverslip и инкубации за 10 мин при комнатной температуре в темноте.
  8. Разбавьте 1: 100 анти тубулин антитела кролика в пятнать буфера.
  9. Аспирационная от permeabilization/блокирование буфера от coverslips и 50 мкл раствора разбавленные антитела анти тубулина в каждом coverslip. Инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
  10. Приготовляют раствор пятно вторичные антитела/актина путем разбавления Alexa Fluor 532-конъюгированных коза анти кролик IgG вторичного антитела и Alexa Fluor 568-конъюгированных Фаллоидин масштаба 1: 100 в пятнать буфера.
  11. Мыть coverslips 3 раза, чтобы удалить избыток основное антитело, добавив 500 мкл пятнать буфер и затем аспирационных.
  12. 50 мкл раствора вторичные антитела/актина пятно для каждого coverslip и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре в темноте.
  13. Мыть coverslips 3 раза, чтобы удалить избыток вторичные антитела путем добавления 500 мкл пятнать буфер и затем аспирационных.
  14. Добавьте 10 мкл Реагента монтажа микроскопа. Установите coverslip на микроскопа клетки стороной вниз.
    Примечание: «Анти затухания» монтаж среднего (см. Таблицу материалы) настоятельно рекомендуется сохранить интенсивность флуоресценции GFP синтеза белков. Избегайте использования монтажа реагентов, содержащие DAPI, которая может помешать с изображениями флуорофоров, при использовании лазера интереса.
  15. Разрешить слайды для высыхания на ночь в темноте. Изображения слайдов на следующий день.
    Примечание: Imaging слайды, как только coverslip сухой настоятельно рекомендуется, поскольку GFP флуоресценции будет уменьшаться с течением времени.

6. обработка изображений с помощью микроскопа интереса

Примечание: Пожалуйста, обратите внимание, что все программное обеспечение, описанные ниже являются специфическими для Микроскоп и программного обеспечения, мы использовали (см. Таблицу материалов). Действия и настройки, нужно будет корректироваться, если визуализация выполняется с использованием другой Микроскоп/программного обеспечения.

  1. Включите в Микроскоп интереса, активировать лазеры и лампа освещения эпифлуоресцентного и запуск программного обеспечения Микроскоп.
  2. Установите параметры для лазеров истощения интереса.
    Примечание: Это будет зависеть от конкретных Микроскоп используется и лазеров, которые он оснащен. Некоторые Рекомендуемые параметры являются белый свет (WLL) 70%; 592 Нм лазер на 80%; 660 нм лазер на 80%.
  3. Активизируйте параметры интереса и выровняйте интереса лазерных лучей с помощью 100 X цель.
  4. С помощью окуляра, фокус образца и выберите ячейку с умеренной экспрессия гена GFP.
    Примечание: Низкая GFP выражение не будет видна потому что сигналу уменьшает интенсивность выбросов. И наоборот высокая экспрессия клип-170-GFP индуцирует спонтанного формирования больших кластеров, которая не отражает нормальное микротрубочек плюс конец белка сложную морфологию и распределения. Выбрав ячейку с умеренной экспрессия гена GFP имеет важное значение для точно изображений цитоскелета структур на сайте контакт антигена.
  5. Zoom в выбранную ячейку и выберите регион интерес к записи образа. Отрегулируйте фокус, таким образом, чтобы плоскость x-y , B ячейки, которая находится ближе всего к coverslip, в центре внимания.
    1. Для этого, переместите цель постепенно ближе к coverslip, чтобы структуры цитоскелета клетки B вступают в фокус и затем идти не в фокусе. Затем постепенно переместить цель в противоположном направлении до тех пор, пока структуры цитоскелета клетки B сначала возвращаются в центре внимания.
  6. Оптимизируйте параметры, включая мощности лазера, возбуждения луча и детектор диапазона. Начните с настройками, рекомендуемыми экспертами с инструкциями производителя. Затем внесите необходимые изменения для оптимизации сигнала для образцов. Изображение все образцы для сравнения друг к другу с теми же параметрами.
  7. На вкладке «приобрести» программного обеспечения установите захвата изображений для приобретения последовательных кадров в нижней левой панели «Последовательное сканирование», установив параметр «между кадрами».
  8. Задайте порядок приобретения.
    Примечание: Мы приобретаем GFP флуоресценции сначала для того, чтобы избежать деградации сигнала GFP.
    В зависимости от комбинации флуорофоров, которые используются в дополнение к GFP изображений больше сигнал флуоресценции волны впервые может дает лучшие результаты. Однако порядок в котором флуорофоров или флуоресцентные белки подвергаются простимулированное излучение истощения и образы должны быть оптимизированы для получения сильных сигналов флуоресценции и лучшее разрешение.
  9. Выберите и установите мощность лазера интереса для каждого Флюорофор программного обеспечения на вкладке «Приобретение» и используйте ползунок для 592-Нм или 660 нм лазер интереса для регулировки мощности лазера. Отрегулируйте мощность для истощения 592-Нм лазер для GFP и Alexa Fluor 532. Регулировка мощности для истощения 660 нм лазер для Alexa Fluor 568.
  10. Чтобы увеличить разрешение и уменьшить фонового сигнала, перейдите на «Приобретение» параметры на вкладке «Приобретение» программного обеспечения, увеличить линии и/или раме, усреднение, выбрав значение больше 1, используя раскрывающееся меню для каждого параметра.
  11. Кроме того, приобрести флуоресцентные сигнал, с помощью условного времени интереса, проверив параметр шлюзовые для Флюорофор на вкладке «Приобретение» и указание значений для время стробирования (см. Примечание ниже). Увеличьте мощность лазера интереса для повышения резолюции, хотя это также увеличит Фотообесцвечивание флуорофоров.
    Примечание: Время стробирования будет нужно быть оптимизированы для микроскопа, выборки и флуорофоров используется. Время стробирования от 0,3 до 6 ns рекомендуется. После фиксации GFP особенно чувствителен к высоким лазерного луча. Чтобы уменьшить Фотообесцвечивание GFP, должны применяться время стробирования и следует уменьшить мощность лазера интереса.
  12. Для захвата изображения 3D интереса, используйте ползунок, чтобы изменить точку распространения функция (PSF) «3D интереса».
  13. Вручную, приобрести несколько изображений для обеспечения воспроизводимости. Deconvolve изображения (см. Рисунок 1) с помощью программного обеспечения деконволюция пакет41(см. Таблицу материалы).

Результаты

Для распространения на иммобилизованных анти Ig клетки B интереса микроскопии, в сочетании с программным обеспечением деконволюция обеспечивает изображения более высокого разрешения цитоскелета структур чем confocal микроскопии. Это проявляется в Рисунок 1

Обсуждение

Подробные изображения цитоскелета структур могут быть получены с помощью микроскопии суперразрешением интереса, который теоретически может достичь урегулирования 50 Нм, по сравнению с обычными confocal микроскопии, для которого дифракционный резолюции составляет ~ 200 Нм 24. сп...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим визуализации объекта UBC института наук о жизни (LSI) за поддержание интереса микроскопа. Эта работа финансировалась Грант #68865 от канадской институтов медицинских исследований (M.R.G.). Мы благодарим д-р Козо Kaibuchi (Университет Нагоя, Нагоя, Япония) за клип-170-GFP плазмиды.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
A20 mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific R0883
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific12483020Heat inactivate at 56 oC for 30 min
2-mercaptoethanolMillipore SigmaM3148
GlutamineMillipore SigmaG5763
Sodium pyruvateMillipore SigmaP5280
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Liquid, 10,000 units
Additional materials for primary B cells
70-µm cell strainerCorning352350
Magnetic bead-based B cell isolation kitStemcell Technologies19854EasySep Mouse B cell Isolation kit
Lipopolysaccharide (LPS)Millipore SigmaL4391LPS from E. coli 0111:B4
B cell-activating factor (BAFF)R&D Systems2106-BF-010
NameCompanyCatalog NumberComments
Transfection
Plasmid encoding CLIP-170-GFPGift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Recommended transfection reagents and equipment
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Program L-013 used
Falcon 6-well plates, TC treated, sterileCorning353046
NameCompanyCatalog NumberComments
Coating coverslips
18-mm diameter round #1.5 cover glassesThomas Scientific1217N81Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580
ForcepsFisher Scientific1381242Dissecting extra fine splinter forceps
Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plateCorning353043
100% methanolFisher ScientificA412-4
Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumThermo Fisher Scientific10010049
Goat-anti-mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch115-005-008For A20 cells
Goat-anti-mouse IgM antibodyJackson ImmunoResearch115-005-020For primary mouse B cells
NameCompanyCatalog NumberComments
Staining
Paraformaldehyde (16% stock solution)Electron Microscopy Sciences15710Dilute with PBS to working concentration
Glutaraldehyde (50% stock solution)Millipore Sigma340855Dilute with PBS to working concentration
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponinMillipore SigmaS2149
Bovine serum albumin (BSA), Fraction VMillipore Sigma10735094001
Rabbit anti-tubulin antibodyAbcamab528661:250 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA110091:100 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 568-conjugated phalloidinThermo Fisher ScientificA123801:100 dilution recommneded but should be optimized
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970Without DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
ParafilmVWRP1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DextroseFisher ScientificD16-500
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopy
Leica SP8 TCS STED microscopeLeica
Huygens deconvolution softwareScientific Voume ImagingSee https://svi.nl/HuygensProducts

Ссылки

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
  6. Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
  7. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
  8. Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
  9. Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
  10. Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
  11. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
  12. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  13. Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  14. Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
  15. Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
  16. Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
  17. Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
  18. Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
  19. Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
  20. Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
  21. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  22. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  23. Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
  24. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
  25. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  26. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  27. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
  28. Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
  29. Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
  30. Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
  31. Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
  32. Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
  33. Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
  34. McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
  35. Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
  36. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  37. Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
  38. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  39. Yuseff, M. -. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  40. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  41. Russ, J. C. . The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).
  42. Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
  43. Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены