في Ovo نموذجية لاختبار مركبات الأنسولين ميميتيك

Summary

في هذه الدراسة، يصف لنا نظام في ovo كأداة واعدة لاختبار مركبات الأنسولين ميميتيك في حي. وتشمل المزايا الرئيسية معدلات الإنتاجية الكافية وتكاليف مقبولة، والتي تمكن من تحديد هوية المواد الكيميائية النباتية مع خصائص الأنسولين ميميتيك.

Abstract

مستويات السكر في الدم مرتفعة في نوع 2 السكري (T2DM)، أمراض ايضية المعقدة والمتعددة العوامل، ناجمة عن عدم المقاومة وخلايا بيتا الأنسولين. اتبعت استراتيجيات مختلفة، بما في ذلك حقن الأنسولين أو استخدام المخدرات توعية الأنسولين، لعلاج T2DM أو على الأقل الحد من الأعراض. وبالإضافة إلى ذلك، تطبيق المركبات العشبية وقد اجتذب اهتماما متزايداً. وبالتالي، من الضروري إيجاد نظم اختبار الكفاءة تحديد وتوصيف المركبات الأنسولين ميميتيك. هنا قمنا بتطوير نموذج جنين فرخ معدلة، التي تمكن من اختبار المركبات الاصطناعية ومقتطفات من الأعشاب مع خصائص الأنسولين ميميتيك. استخدام fluorescence المستندة إلى الفحص المجهري شاشة الأولية، التي يوضحها نقل جسد الجلوكوز الناقل 4 (Glut4) لغشاء البلازما، كنا قادرين على تحديد المركبات، أساسا من مستخلصات الأعشاب، التي تؤدي إلى زيادة الجلوكوز داخل الخلايا التركيزات في adipocytes. بيد أن فعالية هذه المواد يتطلب المزيد من التحقق في حي. وهكذا، استخدمنا نهج في ovo إلى التعرف على خصائص خفض جلوكوز الدم. لا تلزم موافقة لجنة أخلاقيات بحيث لا يعتبر استخدام أجنة الدجاج خلال الثلثين الأول من التنمية الجنينية تجربة حيوان. ويرد هنا، تطبيق هذا النموذج بالتفصيل.

Introduction

السكري من الأمراض ايضية تتميز بارتفاع السكر في الدم، ويحدث بسبب خلل في إفراز الأنسولين أو الأنسولين الإجراء¹. تسعين في المئة من جميع حالات السكري هي فئة نوع 2 السكري (T2DM)، التي تظهر فيها الأفراد مقاومة الأنسولين و نقص الأنسولين معظمها². هناك عدة عوامل معروفة لزيادة انتشار عالمي من T2DM، بما في ذلك التغييرات في نمط الحياة، ولا سيما تلك المتصلة بالإفراط في التغذية، والشيخوخة، والخمول البدني. ما يقرب من 400 مليون شخص بمرض البول السكري في العالم وفقا لاتحاد السكري الدولي (جيش الدفاع الإسرائيلي). هذا العدد من المتوقع أن تصل إلى 600 مليون خلال ال 20 سنة القادمة³.

السكري المضاعفات الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم ومقاومة الأنسولين، مثل ارتفاع ضغط الدم، دسليبيدميا، الجلوكوز التعصب وأمراض القلب والشرايين، وأمراض الأوعية الدموية الدماغية، يؤدي إلى انخفاض كبير متوسط العمر المتوقع ونوعية⁴. الأفراد المتضررين تتطلب تخفيض مستوى السكر العلاج الصيدلاني؛ ومع ذلك، استخدام المخدرات، مثل الميتفورمين⁵ وكثيراً ما يرتبط مع آثار جانبية دراماتيكية^6،،من⁷⁸. ولذلك، كذلك ضرورية antidiabetic النهج التي آمنة ومتاحة على نطاق واسع وغير مكلفة.

تم المسند إلى ميزة الأنسولين mimetic خصائص المركبات العشبية المختلفة ومقتطفات، والنباتات، والمغذيات بتحوير الوظائف الخلوية المختلفة. سمة هامة حفز نقل جسد الجلوكوز الناقل 4 (GLUT4) لغشاء البلازما من أماكن تخزين داخل الخلايا، مما أدى استيعاب زيادة الجلوكوز في العضلات والأنسجة الدهنية في غياب الأنسولين، المعروفة باسم إلى خصائص الأنسولين ميميتيك⁹. في السابق، قمنا بتنفيذ نهج قائم على الفحص المجهري الأسفار التحديد الكمي لعملية نقل جسد GLUT4¹⁰. وأسفر تحليل للمستخلصات النباتية العديد من مكتبة استخراج¹¹ استخدام هذا الفحص تحديد المرشحين الواعدين. ومع ذلك، تلزم مزيد من الاختبارات في الكائنات الحية. النهج الذي وصف بالتفصيل في هذه الورقة، نموذج جنين فرخ معدلة، ثبت أن تكون نموذجا واعداً لتحديد المواد مع خصائص الأنسولين ميميتيك. وهو يمثل أداة جذابة سد الفجوة الواسعة بين الدراسات في المختبر و في فيفو ويوفر العديد من المزايا مقارنة بالنظم القائمة مثل تكاليف مقبولة، وإجراءات معالجة بسيطة ومعدلات الإنتاجية الكافية. وباﻹضافة إلى ذلك، إذن من لجنة أخلاقية غير مطلوب.

Protocol

وفقا للتوجيه رقم 2010/63/الاتحاد الأوروبي، تجارب على أجنة الطيور غير دبرت خلال الثلثين الأول من التنمية الجنينية لا تحتاج الإذن من قبل لجنة أخلاقيات.

1-تخزين والإكثار من البيض

1. الحصول على بيض الدجاجة المخصبة (جدول المواد) من مربي محلية.
   ملاحظة: يمكن تخزين البيض في 14 درجة مئوية في جو هوميديفيد لمدة تصل إلى 10 أيام بعد زرع قبل استخدامها لإجراء التجارب.
2. احتضان البيض في 38 درجة مئوية مع رطوبة متوسط 40-60 في المائة لمدة 10 أو 11 يوما في حاضنة أن يتحول باستمرار البيض.

2-اختيار البيض

1. فحص البيض للاخصاب بعد الحضانة لمدة تصل إلى 11 يوما. استخدام ضوء كاندلينج لهذه الخطوة. تراجع هامش مصباح كاندلينج في إينكباد وشمعة الجانب أشار البيض.
2. لتحديد المثانة الهواء، تحقق من وجود الاختلافات في السطوع على رأس البيضة.
   ملاحظة: يظهر المثانة الهواء كمنطقة جولة، وأكثر شفافية، وفي حين الزلال أكثر قتامة عندما يتم كاندليد البيض.
3. بعد الكشف عن المثانة الهواء، وضع علامة على موقع بالضغط على المصباح قليلاً ضد البيض بالحبر تم تطبيقه مسبقاً.
4. استبعاد البيض غير المخصب في هذه الخطوة، التي لا تظهر فرقا في السطوع بين الزلال والمثانة الهواء.

3-حقن المواد

1. إعداد مضمون الفائدة (مثلاً، انتزاع الأعشاب أو الأنسولين) بتمييع المضمون في تركيز المطلوب في المخزن المؤقت لحل متوازن الملح (حبس) هانك. على سبيل المثال، 3.3 U/mL الأنسولين المتاحة تجارياً التناظرية في حبس.
2. لتطبيق المجمع المحدد، بعناية بيك قشر البيض مع زوج أشار من ملاقط في مجال ملحوظ المثانة الهواء. ولا تشكل حفرة أكبر من قطر الإبرة للمحاقن. حقن المخزن المؤقت الحل (300 ميليلتر) يحتوي على مضمون الفائدة في منطقة بيكيد عن طريق حقنه.
   ملاحظة: استخدم العقيمة، 1 مل من المحاقن تستخدم مرة واحدة، ونصائح ماصة، والسفن. ارتداء القفازات ومعطف مختبر للتجارب.
3. لتحديد مدى تأثير خفض جلوكوز الدم من مادة، وضع البيض مرة أخرى إلى الحاضنة ل 60 و 120 و 180 دقيقة، على التوالي. لتحديد مستويات الجلوكوز في الدم القاعدية، تشمل على الأقل 10-15 مراقبة معاملة غير البيض.

4. اختبارات السمية

1. وبعد تطبيق المجمع المحدد ح 24، حجته الغشاء كثافة قشرة مع المخزن المؤقت مخزنة المالحة (PBS) الفوسفات (ما يكفي لتغطية الغشاء كله كثافة قشرة) لمالا يقل عن 30 ثانية.
2. إزالة الزائدة المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني بصب ذلك بعيداً.
3. سحب قبالة الغشاء كثافة قشرة بعناية مع زوج أشار من الملقط.
4. فحص الأوعية الدموية للآفات والتأكد من حيوية الجنين الفرخ (مثلاً، الحركة).
   ملاحظة: انظر الشكل 1 للمقارنة الحيوية مقابل غير حيوية الأجنة بعد التطبيق لانتزاع الأعشاب السامة.

5-قياس قيمة الجلوكوز في الدم

1. في هذه النقطة الزمنية الخاصة بكل منها، بعناية إزالة قشر البيض في أعلاه المثانة الهواء وحجته الغشاء كثافة قشرة مع المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (ما يكفي لتغطية الغشاء كله كثافة قشرة).
2. إزالة الزائدة المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني بصب ذلك بعيداً.
3. سحب بعناية قبالة الغشاء كثافة قشرة مع زوج أشار من الملقط.
4. قطع وإزالة الغشاء تشوريوالانتويك مع مايكرو-مقص، لتمكين الوصول إلى الأوعية الدموية مناسبة. قص الغشاء 2-3 سم على الأقل. لا تقطع أي سفن كبيرة في الغشاء نفسه لتجنب فقدان الدم غير المرغوب فيها للجنين.
5. تحديد موقع السفينة الكبيرة التي تنشأ من البطن للجنين. رفع هذه السفينة من بياضه مع الصغرى-مقص مغلق ووضعه على درجة حموضة-شريط من بلاستيك. نقل قطاع الأس الهيدروجيني تحت السفينة، التي تعقد مع مايكرو-مقص، والانسحاب الجزئي-مقص بعيداً بعناية.
6. إزالة 1-2 مل السائل تحت الغشاء تشوريوالانتويك مع ماصة لتجنب تمييع الدم في الخطوة التالية. الجاف في السفينة والأس الهيدروجيني-قطاع مع أوراق الترشيح، قبل أن يتم قطع السفينة.
7. قطع الأوعية الدموية بعناية مع الصغرى-مقص على جانب واحد. لا تقطع عن طريق السفينة تماما.
   ملاحظة: السفينة سمكها حوالي 1 ملم. لا تقطع أكثر من نصف السفينة تجنب قطع من خلال السفينة تماما، كما أنها قد تنزلق قبالة قطاع غزة وليس جمع الدم من الممكن.
8. جمع الدم تسرب في قطاع الأس الهيدروجيني باستخدام ماصة. ميكروليتيرس عشرة من الدم مطلوبة لتحديد مستويات الجلوكوز في استخدام مقياس جلوكوز الدم.

6-إحصائية التقييم

1. حساب قيمة يعني على الأقل 10 بيضة الفردية في النقطة الزمنية وتطبيع هذه القيم إلى واحدة من البيض التحكم (غير أو المخزن المؤقت-المعالجة بيض).
2. وفي وقت لاحق، تحديد النسبة المئوية للانخفاض. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام الأنسولين كعنصر إيجابي.
   ملاحظة: تكرار التجربة كل ثلاث مرات على الأقل.

النتائج

وصف نهج جلوك-HET:

بعد الحضانة مع المواد التي تهم، يتم فتح البيض المخصب وعلى استعداد لجمع الدم بإزالة قشر البيض (الشكل 2). ويشمل زيادة إعداد الموازنة وإزالة الغشاء كثافة قشرة للوصول إلى الغشاء تشوريوالانتويك. ثم قطع هذا الغشاء بعناية لتوفير الوصول إلى الأوعية الدموية مناسبة لجمع الدم. يفضل أن يكون ذلك، يتم وضع السفينة الكبيرة التي تنشأ من البطن للجنين على درجة حموضة-شريط من بلاستيك. تفاديا لتمييع الدم أثناء جمع، هو يربت على السفينة والأس الهيدروجيني-قطاع الجافة بورق الترشيح. ثم يتم قطع الأوعية الدموية، ويتم جمع الدم يتسرب إلى قطاع الأس الهيدروجيني للتحليل باستخدام ماصة.

آثار مقتطفات مختارة من الأعشاب على مستويات الجلوكوز في الدم:

مع المنشأة حديثا إزفاء GLUT4 المستندة إلى كوانتيتيشن الرئيسي شاشة، نحن قادرون على تحديد المواد مع مميزة الأنسولين ميميتيك¹⁰. فحص المئات من مستخلصات الأعشاب للذوبان في الماء أسفرت عن تحديد عدة مرات. تم اختبار هذه المستخلصات في نموذجنا فيovo. مقتطفات أعدت من هندي كومبريتوم (رانجون الزاحف) وخلاصة غير المكشوف عنها (يطلق عليها استخراج 0845) استخدمت لهذه التجارب. ونحن حل المقتطفات في المخزن المؤقت لحبس في 300 مغ/لتر، بتركيز اتضح أن يكون مناسباً في الدراسات السابقة^12،13. تم تطبيق المواد على الأجنة المحتضنة لمدة 11 يوما. وكما هو مبين في الشكل 3، لم يؤد إلى المقتطف من رانغون الزاحف تخفيض جلوكوز دم كبيرة في ovo. بيد أن تركيز الجلوكوز في الدم بنجاح تخفيض مع استخراج 0845، مع انخفاض طفيف بعد 60 دقيقة، الذي يماثل تأثير لاحظ استخدام الأنسولين متاحة تجارياً تناظرية. ولوحظ أثر كبير عندما كان وقت حضانة البيض لفترات طويلة.

رقم 1: تأثير المركبات السامة على حيوية الأجنة. البيض كان المحتضنة لمدة 11 يوما (A و C) أو تعامل مع انتزاع الأعشاب سامة في اليوم العاشر لآخر 24 ساعة (ب ود)- وادي تطبيق الاستخراج لآفات شديدة من الأوعية الدموية في الغشاء تشوريوالانتويك (د) والجنين (ب).

الشكل 2: وصف النموذج في ovo - من اليسار إلى اليمين: فتح وإزالة قشر البيض (1-2)؛ تعرض الموازنة وإزالة الغشاء كثافة قشرة مع غشاء تشوريوالانتويك (3)؛ استعداد السفينة على درجة حموضة-قطاع (4)؛ جمع الدم وقياس تركيز الجلوكوز باستخدام مقياس جلوكوز (5). مقتبس من هاسيلجرويبلير et al., 2017¹². الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: تأثير مستخلصات الأعشاب على مستويات الجلوكوز في الدم بالمقارنة بالبيض غير المعالجة أو المعالجة بالانسولين. البيض هي المحتضنة لمدة 11 يوما وتعامل مع المواد المشار إليها (الأنسولين المتاحة تجارياً التناظرية: 3.3 U/mL؛ مقتطفات: 300 مغ/لتر) حلت في حبس المخزن المؤقت (300 ميليلتر حجم) ليصل إلى 3 h. الدم وحددت مستويات السكر باستخدام مقياس جلوكوز دم. وتظهر نتائج دون التأثير من المخزن المؤقت. أشرطة الخطأ تقوم على الخطأ المعياري للوسط. * ف < 0.05 و * * * ف < تنخفض 0.0001، كبيرة فيما يتعلق بالمعالجة بحبس البيض في نفس الوقت الحضانة. مقتبس من هاسيلجرويبلير et al., 2017¹². الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

والرزن HET-كام نظام اختبار بديلة مستخدمة على نطاق واسع للتجارب الحيوانية في الصناعة¹². ويمثل النظام في ovo الموصوفة هنا نسخة معدلة من الإنزيم HET-كام. بينما في شكلها الأصلي، يتم إجراء تجارب كام HET لدراسة خصائص مزعجة للمركبات وصياغة أو تحليل الأوعية^14،،من¹⁵¹⁶، وعلينا تكييف النهج لاختبار المركبات ذات الخصائص المفترضة الأنسولين ميميتيك¹². تجارب غير فقست أجنة الطيور خلال الثلثين الأول من التنمية الجنينية وفقا للتوجيه رقم 2010/63/الاتحاد الأوروبي، لا تحتاج الإذن من قبل لجنة أخلاقية حيث لا تعتبر هذه التجارب تجارب على الحيوانات. وقد أثبتت الدراسات الحديثة مدى ملاءمة النظام في ovo توصيف نجاعة الأعشاب مقتطفات مختارة، التي تم تحديدها في شاشة أساسية المستندة إلى إزفاء GLUT4¹⁰، للحد من مستويات الجلوكوز في الدم في نظراً لغياب الأنسولين^12،13. وتشمل النقاط الحرجة لأداء جيد للنظام في ovo : أولاً، مولده موثوق بها إيصال البيض المخصب. الدجاج البنى الكلاسيكي لومان خيار جيد لسلالة. ثانيا، تنفيذ سمية اختبارات استبعاد التأثيرات السمية لاحتياجات مجمع التحقيق يتعين القيام به. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم إعداد وعاء الدم مناسب لجمع الدم. من المهم لتجنب قطع السفن الكبيرة في غشاء تشوريوالانتويك نفسها، وهذا يمكن أن يؤدي إلى فقدان الدم غير أفضل. وعلاوة على ذلك، قبل أن يتم قطع السفينة إلى قطاع غزة درجة الحموضة، يجب أن تكون يربت الجافة باستخدام ورق الترشيح لمنع تمييع الدم التي تم جمعها. وأخيراً، يبدو عددا كافياً من التجارب الهامة. نوصي باستخدام البيض 10 على الأقل لكل نقطة من الوقت، وتكرار التجربة كل منها ثلاثة إضعاف.

وبطبيعة الحال، هناك بعض القيود المفروضة على هذا النهج في ovo . حيث يستغرق مدة تصل إلى 30 دقيقة حتى يتم استيعابها عبر غشاء كثافة قشرة المواد التي تأتي في اتصال وثيق مع الغشاء تشوريوالانتويك، من غير الممكن التحديد الكمي لاستجابة سريعة للجنين إلى مجمع التطبيقية. وعلاوة على ذلك، قد تكون بعض المركبات السامة في تركيز التطبيقية، الذي كثيرا ما يتسبب في آفات الأوعية الدموية في غشاء تشوريوالانتويك. وهكذا، سيتوتوكسيسيتي الاختبار استناداً إلى حضانة طويلة الأجل من المركبات لمدة حوالي 24 ساعة يبدو معقولاً. وأخيراً، وجدنا أن النظام المخزن المؤقت المستخدم لتطبيق المركبات أثر كبير على أداء المقايسة. ¹² حاليا، هبس المخزن المؤقت يستخدم نظراً لأنه يؤدي إلى تأثير أصغر على مستويات السكر في الدم للجنين.

للتطبيقات المستقبلية، قد يكون اختبار نظم المخزن المؤقت الإضافي كبديل لحبس. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تأثير مستخلصات الأعشاب على معلمات إضافية الدم مثل الكوليسترول والشحوم الثلاثية أو البروتينات الدهنية مسألة جذابة.

نظامنا في ovo الجديد أداة هامة وواعدة لاختبار المواد ذات الخصائص الأنسولين ميميتيك في حي دون الحاجة إلى تجربة الحيوان. ولذلك، أنه يسد الفجوة بين النهجين في المختبر و في فيفو . بالمقارنة مع القائمة في ovo نموذج نظم¹⁷ ليس هناك حاجة للحث على مرض السكري بالعلاج بالستريبتوزوتوسين (STZ)، كما يمكننا استخدام الأجنة في يوم 10 أو 11 من الحضانة. وفي هذه المرحلة، لم يبدأ إنتاج الأنسولين، ولكن الأجنة بالفعل الأنسولين الحساسة. بالإضافة إلى ذلك، إذن بإنشاء لجنة أخلاقيات قد تكون مطلوبة إذا الأجنة الذين تتراوح أعمارهم بين 14-17 يوما تكون المستعملة¹⁷. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الاستراتيجيات البديلة¹⁸، تطبيق مجمع كما هو موضح هنا ضارة وشاقة، زيادة تجريبية عن طريق وضع معدلات أقل.

مجتمعة، هذه في ovo نهج نظام جذابة إذا كان تأثير انخفاض الدم من مادة الأنسولين mimetic يحتاج إلى اختبار في حي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Biochrom	L1825
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH30268.02
NovoRapid	Novo Nordisk	8-0905-82-304-6
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)	Local Breeder
Accu-check performa	Roche	6454011
Accu-check Inform II Teststreifen	Roche	5942861
Incubator  HEKA- Turbo 288	HEKA Brutgeräte
Syringe Omnican F 1 mL	Braun	09161502S
Extracts	PEKISH extract library
Lamp Tempo Nr. 119	ORBAN