Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético

Resumen

En este estudio, describimos un sistema en la ovo como una herramienta prometedora para probar compuestos de insulina-mimético en un organismo vivo. Las principales ventajas incluyen velocidades de rendimiento adecuados y los costos aceptables, que permitan la identificación de sustancias fitoquímicas con propiedades insulina-mimético.

Resumen

Niveles elevados de glucemia en diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), una enfermedad metabólica compleja y multifactorial, son causados por falta de insulina resistencia y β-celular. Diversas estrategias, incluyendo la inyección de la insulina o el uso de las drogas de insulina-sensibilización, persiguieron para tratar T2DM o al menos reducir los síntomas. Además, la aplicación de compuestos herbales ha atraído una atención creciente. Por lo tanto, es necesario encontrar sistemas de prueba eficiente para identificar y caracterizar compuestos de insulina-mimético. Aquí se desarrolló un modelo de embrión de polluelo modificada, que permite pruebas de compuestos sintéticos y extractos herbales con propiedades insulina-mimético. Usando una fluorescencia microscopía pantalla basado en primaria, que cuantifica la translocación del transportador de glucosa 4 (Glut4) a la membrana plasmática, hemos sido capaces de identificar compuestos, extractos de hierbas principalmente, que conducen a un aumento de la glucosa intracelular concentraciones en los adipocitos. Sin embargo, la eficacia de estas sustancias requiere más verificación en un organismo vivo. Por lo tanto, utilizamos un enfoque en ovo para identificar sus propiedades reductoras de glucosa de la sangre. La aprobación por un Comité de ética no es necesaria porque el uso de embriones de pollo durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no se considera un experimento animal. Aquí, la aplicación de este modelo se describe en detalle.

Introducción

Diabetes mellitus es una enfermedad metabólica caracterizada por hiperglicemia y es causada por defectos en la secreción de insulina o insulina de acción¹. Noventa por ciento de los casos de diabetes son la categoría de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), donde individuos demuestran resistencia a la insulina y sobre todo la deficiencia de insulina². Varios factores se saben para aumentar la incidencia global de T2DM, incluyendo cambios en el estilo de vida, especialmente las relacionadas con la sobrealimentación, el envejecimiento y la inactividad física. Cerca de 400 millones de personas tienen diabetes mellitus a nivel mundial según la Federación Internacional de Diabetes (FID). Este número se espera llegar a 600 millones en los próximos 20 años³.

Complicaciones de la diabetes causadas por la hiperglucemia y resistencia a la insulina, tales como hipertensión, dislipidemia, intolerancia a la glucosa, enfermedad coronaria y enfermedad vascular cerebral, llevan a una significativamente menor esperanza de vida y calidad⁴. Las personas afectadas requieren farmacoterapia reductor de la glucosa; sin embargo, el uso de medicamentos como metformina⁵ suele ser asociado con efectos secundarios dramáticos^6,7,8. Por lo tanto, más antidiabéticos enfoques que son seguros, ampliamente disponible y barato son necesarios.

Nutracéuticos, extractos, plantas y diferentes compuestos de hierbas se han atribuido propiedades insulina-mimético característica modulando funciones celulares diferentes. Una característica importante es la estimulación de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) a la membrana plasmática de compartimentos de almacenamiento intracelular, resultando en una mayor captación de glucosa en músculo y tejido adiposo en la ausencia de insulina, conocido como insulina-mimético propiedades⁹. Anteriormente, hemos implementado un enfoque basado en la microscopía de fluorescencia para cuantificar el proceso de translocación de GLUT4¹⁰. Análisis de numerosos extractos de plantas de un extracto de la biblioteca¹¹ usando este análisis resultó en la identificación de candidatos prometedores. Sin embargo, se requieren pruebas adicionales en los organismos vivos. El enfoque descrito en detalle en este documento, un modelo de embrión de polluelo modificado, ha demostrado para ser un modelo prometedor para la identificación de sustancias con propiedades insulina-mimético. Representa una herramienta atractiva, llenando el boquete amplio entre los estudios in vitro y en vivo y ofrece varias ventajas en comparación con los sistemas existentes como costos aceptables, los procedimientos de manejo sencillo y velocidades de rendimiento adecuado. Además, no se requiere autorización por un Comité de ética.

Protocolo

Según la Directiva 2010/63/EU, los experimentos con embriones aves no nacieron durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no es necesario permiso de un Comité de ética.

1. almacenamiento y crianza de los huevos

1. Obtener huevos de gallina fertilizados (Tabla de materiales) de un criador local.
   Nota: Huevos pueden ser almacenados a 14 º C en un ambiente humidificado hasta 10 días después de la colocación antes de utilizar para los experimentos.
2. Incubar los huevos a 38 ° C con una humedad promedio de 40-60% para 10 o 11 días en una incubadora que constantemente da vuelta los huevos.

2. selección de los huevos

1. Compruebe los huevos para la fertilización después de la incubación de hasta 11 días. Utilice una luz autónoma para este paso. Sumergir el borde de la lámpara autónoma en una almohadilla de tinta y la parte puntiaguda del huevo de la vela.
2. Para identificar la vejiga de aire, comprobar las diferencias en brillo en la parte superior del huevo.
   Nota: La vejiga de aire aparece como una región más transparente, redonda, mientras que la albúmina es más oscuro cuando el huevo es candled.
3. Después de la detección de la cámara de aire, marque la ubicación Presione la lámpara ligeramente contra el huevo con la tinta previamente aplicado.
4. Excluye huevos no fecundados en este paso, que no muestran una diferencia de brillo entre la albúmina y la vejiga de aire.

3. inyección de sustancias

1. Preparar la sustancia de interés(por ejemplo, el extracto herbario o insulina) diluyendo la sustancia en la concentración de tampón de solución salina balanceada (HBSS) de Hank. Por ejemplo, 3,3 U/mL de un análogo en HBSS comercialmente disponible de la insulina.
2. Para la aplicación del compuesto seleccionado, peck con cuidado la cáscara del huevo con un acentuado pinzas en la zona de la vejiga de aire. No forman un agujero más grande que el diámetro de la aguja de la jeringa. Inyecte la solución tampón (300 μL) que contiene la sustancia de interés en el área de grabados a través de una jeringa.
   Nota: Uso estériles, 1 ml jeringas, puntas de pipetas y los vasos. Use guantes y una bata de laboratorio para los experimentos.
3. Para determinar el efecto de reducción de glucosa de la sangre de una sustancia, coloque los huevos en la incubadora para 60, 120 y 180 min, respectivamente. Para determinar niveles de glucemia basal, incluyen por lo menos 10-15 huevos de control no tratados.

4. toxicidad

1. Después de la aplicación del compuesto seleccionado durante 24 h, equilibre la membrana cascarón con tampón de fosfato salino tamponado (PBS) (suficiente para cubrir la membrana de la cáscara de huevo entero) durante al menos 30 s.
2. Retire el exceso de tampón PBS vertiendo lejos.
3. Quitar la membrana de la cáscara de huevo cuidadosamente con una pinzas puntiagudas.
4. Verificar los vasos sanguíneos de las lesiones y confirmar vitalidad (p. ej., movimiento) del embrión de pollo.
   Nota: Vea la figura 1 para la comparación de vital frente a embriones no vitales después de la aplicación de un extracto de hierbas tóxico.

5. medición del valor de glucosa de sangre

1. En el momento respectivo, con cuidado retire la cáscara de huevo encima de la vejiga de aire y equilibrar la membrana cascarón con tampón PBS (suficiente para cubrir la membrana de la cáscara de huevo entero).
2. Retire el exceso de tampón PBS vertiendo lejos.
3. Cuidadosamente Quite la membrana cascarón con una pinzas puntiagudas.
4. Corte y quite la membrana corioalantoideas con un micro tijera, para permitir buen acceso a vasos sanguíneos adecuados. Cortar la membrana por lo menos 2-3 cm. No corte ningún vasos grandes en la membrana para evitar la pérdida de sangre no deseados del embrión.
5. Localizar el vaso grande que origina en el abdomen del embrión. Levantar este barco de la albúmina con una tijera de micro cerrado y coloca sobre una tira de pH de plástico. Mueva la tira de pH bajo el buque, que se celebra con la micro-tijera, y tire hacia atrás el micro tijera cuidadosamente.
6. Quite el 1-2 mL del líquido debajo de la membrana corioalantoideas con una pipeta para evitar la dilución de la sangre en el siguiente paso. Seco del recipiente y la tira de pH con papel de filtro, antes de que el buque se corta.
7. Cortar los vasos sanguíneos cuidadosamente con una tijera micro en un lado. No cortar completamente el recipiente.
   Nota: El vaso es de aproximadamente 1 mm de espesor. No corte más de la mitad de la embarcación para evitar cortar por el vaso, puede deslizarse de la tira y recolección de sangre no es posible.
8. Recoger la sangre que se escapa en la tira de pH utilizando una pipeta. Diez microlitros de sangre se requieren para determinar los niveles de glucosa con el medidor de glucosa en sangre.

6. estadística evaluación

1. Calcular el valor medio de al menos 10 huevos individuales por momento y normalizar estos valores a uno de los huevos de control (huevos tratados no o tampón).
2. Posteriormente, determinar el porcentaje de disminución. Además, usar la insulina como control positivo.
   Nota: Repetir cada experimento por lo menos tres veces.

Resultados

Descripción del enfoque Gluc-HET:

Tras la incubación con las sustancias de interés, los huevos fertilizados son abiertos y preparados para recolección de sangre por eliminación de la cáscara de huevo (figura 2). Preparación incluye equilibrar y el retiro de la membrana de la cáscara de huevo para obtener acceso a las membranas corioalantoideas. Esta membrana se corta cuidadosamente para proporcionar acceso a un recipiente adecuado de sangre para recolección de sangre. Preferiblemente, el vaso grande que origina en el abdomen del embrión se coloca en una tira de pH de plástico. Para evitar la dilución de la sangre durante la colección, la nave y la tira de pH es secarlo con papel de filtro. Entonces se corta el vaso sanguíneo y se recoge la sangre que se escapa en la franja de pH para análisis mediante una pipeta.

Efectos de extractos de hierbas en los niveles de glucemia:

Con un recién creado translocación de GLUT4 cuantificación pantalla basado en primaria, que son capaces de identificar sustancias con una característica insulina-mimético¹⁰. Proyección de cientos de extractos de hierbas hidrosolubles resultó en la identificación de varios golpes. Estos extractos fueron probados en nuestro modelo en -ovo. Extractos preparados a partir de Combretum indicum (enredadera de Rangún) y un extracto no divulgada (llamado extracto 0845) fueron utilizados para estos experimentos. Hemos disuelto los extractos en tampón HBSS a 300 mg/L, una concentración que resultó para ser adecuado en anteriores estudios^12,13. Sustancias se aplicaron a los embriones se incubaron durante 11 días. Como se indica en la figura 3, el extracto de la enredadera de Rangún no produjo una significativa sangre glucosa reducción en ovo. Sin embargo, la concentración de glucosa de la sangre se redujo con éxito con el extracto 0845, con una disminución menor después de 60 min, que es comparable con el efecto observado con un análogo de insulina disponible en el mercado. Se observó un efecto significativo cuando se prolongó el tiempo de incubación de los huevos.

Figura 1: influencia de compuestos tóxicos en la vitalidad del embrión. Huevos fueron incubados durante 11 días (A y C) o tratados con un extracto de hierbas tóxico día 10 por otro 24 h (B y D). Aplicación del extracto condujo a graves lesiones de los vasos sanguíneos de las membranas corioalantoideas (D) y el embrión (B).

Figura 2: Descripción del modelo en ovo . De izquierda a derecha: apertura y remoción de la cáscara del huevo (1 - 2); equilibrado y el retiro de la membrana de la cáscara de huevo con membranas corioalantoideas expusieron (3); recipiente dispuesto en una tira de pH (4); la colección de sangre y medición de la concentración de glucosa con un medidor de glucosa (5). Adaptado de Haselgruebler et al., 2017¹². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: efecto de extractos de hierbas en los niveles de glucemia en comparación con los no tratados o tratados con insulina huevos. Huevos incubados durante 11 días y fueron tratados con las sustancias indicadas (análogo de insulina disponible comercialmente: 3.3 U/mL; extractos: 300 mg/L) disuelto en tampón HBSS (volumen de 300 μL) para hasta 3 h. de sangre los niveles de glucosa se determinaron usando un medidor de glucosa en sangre. Resultados se muestran sin el efecto de la memoria intermedia. Barras de error se basan en el error estándar de la media. * P < 0.05 y *** P < 0.0001, importante disminución con respecto a los huevos tratados con HBSS del mismo tiempo de incubación. Adaptado de Haselgruebler et al., 2017¹². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El ensayo HET-CAM es un sistema de prueba alternativa ampliamente utilizado para los ensayos con animales en el sector¹². El sistema en ovo descrito aquí representa una versión modificada del ensayo HET-CAM. Mientras que en su forma original, se realizaron experimentos de HET-CAM para estudiar las propiedades irritantes de compuestos y formulación o el análisis de la angiogénesis^14,15,16, hemos adaptado el enfoque de la prueba compuestos con supuestas características insulina-mimético¹². Según la Directiva 2010/63/UE, experimentos con embriones aves no nacieron durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no es necesario permiso de un Comité de ética ya que estos experimentos no se consideran los experimentos con animales. Estudios recientes han demostrado la idoneidad del sistema en ovo para caracterizar la eficacia de extractos de hierbas seleccionadas, que se han identificado en una pantalla principal basado en la translocación de GLUT4¹⁰, para reducir los niveles de glucemia en el ausencia de insulina^12,13. Puntos críticos para un buen funcionamiento del sistema en ovo incluyen: primero, un criador confiable entrega los huevos fertilizados. El pollo marrón clásico Lohmann es una buena opción de raza. En segundo lugar, la aplicación de toxicidad pruebas para excluir los efectos tóxicos de los investigados compuesto hay que hacer. Además, la preparación de un vaso sanguíneo adecuado para recolección de sangre es importante. Es importante evitar el corte de vasos grandes en las membranas corioalantoideas sí mismo, esto puede llevar a una pérdida no preferible de la sangre. Además, antes de que el buque se corta en la tira de pH, tiene que ser le dio unas palmaditas secas con papel de filtro para evitar la dilución de la sangre recogida. Por último, un número suficiente de experimentos parece ser importante. Se recomienda utilizar al menos 10 huevos para cada punto del tiempo y una triple repetición de la experiencia respectiva.

Naturalmente, existen algunas limitaciones de este enfoque en ovo . Puesto que toma hasta 30 minutos hasta que las sustancias son absorbidas por la membrana de la cáscara de huevo y entran en contacto con las membranas corioalantoideas, no es posible cuantificar una respuesta rápida del embrión al compuesto aplicado. Además, algunos compuestos pueden ser tóxicos en la concentración aplicada, que con frecuencia resulta en lesiones de los vasos sanguíneos de las membranas corioalantoideas. Por lo tanto, pruebas de citotoxicidad basados en incubación a largo plazo de los compuestos por cerca de 24 horas parece razonable. Finalmente, se encontró que el sistema utilizado para la aplicación de los compuestos tiene un efecto significativo sobre el rendimiento de la prueba. ¹² actualmente, HBSS tampón se utiliza debido a el menor efecto sobre los niveles de glucosa de la sangre del embrión.

Para futuras aplicaciones, sistemas de amortiguamiento adicional como una alternativa a HBSS pueden probarse. Además, la influencia de extractos de hierbas en parámetros adicionales de la sangre como colesterol, triglicéridos o lipoproteínas podría ser una pregunta atractiva.

Nuestro nuevo sistema en ovo es una herramienta importante y prometedor para probar sustancias con características de insulina-mimético en un organismo vivo sin la necesidad de un experimento animal. Por lo tanto, rellena el hueco entre los enfoques in vitro y in vivo . En comparación con la existente en ovo-lacto-modelo sistemas¹⁷ no hay necesidad para inducir diabetes tratamiento streptozotocin (STZ), como el uso embriones en el día 10 u 11 de la incubación. En esta etapa, no se ha iniciado la producción de insulina, pero los embriones son ya insulina sensible. Además, autorización por un Comité de ética puede ser necesario si los embriones de edad 14-17 días son usados¹⁷. Además, comparado con estrategias alternativas¹⁸, la aplicación compuesta como se describe aquí es menos dañina y laborioso, aumento de las tasas de rendimiento experimentales.

Tomados en conjunto, esta en ovo-lacto- enfoque es un sistema atractivo si es un efecto de disminución de sangre de una sustancia insulina-mimético en un organismo vivo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Biochrom	L1825
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH30268.02
NovoRapid	Novo Nordisk	8-0905-82-304-6
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)	Local Breeder
Accu-check performa	Roche	6454011
Accu-check Inform II Teststreifen	Roche	5942861
Incubator  HEKA- Turbo 288	HEKA Brutgeräte
Syringe Omnican F 1 mL	Braun	09161502S
Extracts	PEKISH extract library
Lamp Tempo Nr. 119	ORBAN