طراز ماوس تشيميريك كبد البشري الكوليستيرول أسرية باستخدام خلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنشاء نموذج ماوس تشيميريك كبد البشري من الكوليستيرول الأسرية باستخدام خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent. وهذا نموذجا قيماً لاختبار علاجات جديدة الكوليستيرول.

Abstract

معظمها بسبب طفرات مستقبلات (لدلر) low-density lipoprotein الكوليستيرول الأسرية (FH) ويؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بأمراض القلب والشرايين بداية مبكرة بسبب الارتفاع الملحوظ الكولسترول الضار (LDL-C) في الدم. Statins السطر الأول من الأدوية الخافضة للدهون لعلاج FH وأنواع أخرى من الكوليستيرول، ولكن نهج جديدة آخذة في الظهور، في أجسام PCSK9 خاصة، والآن يجري اختبارها في التجارب السريرية. لاستكشاف النهج العلاجية رواية FH, أدوية جديدة أو تركيبات جديدة، نحن بحاجة إلى مناسبة في فيفو نماذج. ومع ذلك، الاختلافات في الملامح الأيض الدهون مقارنة بالبشر مشكلة رئيسية للنماذج الحيوانية المتاحة من FH. لمعالجة هذه المسألة، ونحن قد ولدت نموذجا ماوس تشيميريك كبد البشري باستخدام الخلايا الجذعية pluripotent FH التي يسببها (اللجنة التوجيهية)-اشتقاق خلايا الكبد (عبس). كنا الفئران لدلر^-/-/Rag2^-/-/Il2rg^-/- (lrg صندوق) لتفادي الرفض المناعي لزرع الخلايا البشرية وتقييم تأثير لدلر-عبس ناقصة في لدلر فارغة الخلفية. يمكن إعادة زرع FH عبس ملء 5-10% الكبد الماوس lrg صندوق استناداً إلى تلطيخ الزلال البشري. وعلاوة على ذلك، إيهيبس انجرافتيد تستجيب للأدوية الخافضة للدهون ولخص الملاحظات الإكلينيكية لزيادة فعالية الأجسام المضادة PCSK9 مقارنة مع statins. وهكذا يمكن أن يكون نموذجنا تشيميريك الكبد البشري مفيدة للتجارب السريرية للعلاجات الجديدة إلى FH. استخدام البروتوكول نفسه، ومشابهة من الفئران تشيميريك الكبد البشري للمتغيرات الجينية FH الأخرى، أو الطفرات المقابلة لغيرها من أمراض الكبد الموروثة، قد يتم أيضا إنشاء.

Introduction

مستقبلات low-density lipoprotein (لدلر) تلتقط الكولسترول الضار (LDL-C) في الدم تعدل توليف الكولسترول في الكبد. الطفرات في الجينات لدلر هي السبب الأكثر شيوعاً الكوليستيرول الأسرية (FH)¹. Statins تقليديا في السطر الأول من الأدوية لعلاج FH وأنواع أخرى من الكوليستيرول (موروثة أو مكتسبة). Statins تمنع 3-هيدروكسي-3-ميثيلجلوتاريل-إنزيم ريدكتيز إلى انخفاض تخليق الكوليسترول في الكبد². بالإضافة إلى ذلك، statins زيادة مستويات لدلر على السطح تتمثل لتعزيز البلازما إزالة LDL-C. تحذير رئيسية للمعاملة مع الستاتين غير أنها حمل في نفس الوقت التعبير عن كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/هيكسين 9 (PCSK9)، إنزيم يربط لدلر النهوض تدهور³. هذا التأثير المسؤول عن الاستجابة غير كافية أو null حتى statins لوحظ في العديد من المرضى. دراسة هذه الآلية، بشكل غير متوقع، أدى إلى اكتشاف طريقة بديلة لعلاج الكوليستيرول. أضداد PCSK9 التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير مؤخرا تستخدم حاليا في التجارب السريرية، وإظهار كفاءة أعلى والتسامح أفضل من statins⁴. نجاح PCSK9 الأجسام المضادة يعني أيضا أنه قد تكون هناك إمكانيات أخرى علاجية لتعديل مسار التدهور لدلر (إلى جانب PCSK9) في المرضى الذين يعانون من الكوليستيرول. وبالمثل، هناك اهتمام بتطوير مثبطات جديدة من PCSK9 خلاف الأجسام المضادة، على سبيل المثال، siRNA أوليجوس⁵.

لاختبار علاجات جديدة FH وعامة أخرى على أي نوع من الكوليستيرول، نماذج مناسبة في فيفو ضرورية. مشكلة رئيسية من الحالي في فيفو نماذج، ومعظمهم من الفئران⁶ والأرانب⁷، هي تلك الاختلافات الفسيولوجية مع البشر. من الأهمية بمكان هذه المشاكل تشمل ملف تعريف الأيض الدهون مختلفة. الجيل من الحيوانات تشيميريك الكبد البشري⁸ قد تساعد في التغلب على هذا التحذير. الماوس تشيميريك الكبد البشري نوع من "أنسنة" الماوس مع الكبد في إعادة ملء مع خلايا الكبد البشري، على سبيل المثال، خلايا الكبد البشري الأساسي (pHH)⁹. مشكلة مع pHH أنه لا يمكن توسيع فيفو السابقين، بسرعة تفقد وظيفتها على العزلة، ومصدر محدود. بديل ل pHH هو استخدام الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية)-اشتقاق خلايا الكبد (إيهيبس)¹⁰. جدير بالذكر أن إيبسكس الخاصة بالمريض ويمكن زراعتها إلى أجل غير مسمى، حيث يمكن أن تنتج عبس على الطلب، وميزة كبيرة على مدى pHH الطازجة. وعلاوة على ذلك، إيبسكس يمكن أيضا أن تكون بسهولة وراثيا مع nucleases مصمم لتصحيح أو استحداث الطفرات في اسوي خلفية للسماح بإجراء مقارنات أكثر إخﻻصا¹¹.

الماوس تشيميريك الكبد البشري مع pHH انجرافتيد إظهار أوجه الشبه للبشر في التشكيلات الجانبية الأيضية للكبد، واستجابات المخدرات، والقابلية ل الإصابة بفيروس التهاب الكبد¹². وهذا يجعلها نموذجا جيدا لدراسة الدهون في الجسم الحي. تستند النماذج الأكثر استخداماً الماوس الماوس فاه^-/-/Rag2^-/-/Il2rg^-/- (FRG)¹³ والتحالف التقدمي المتحد الماوس المعدلة وراثيا⁸، التي تصل إلى 95 في المائة الماوس في الكبد يمكن الاستعاضة عن pHH. من المثير للاهتمام، وصف تقرير حديث لبشرية FH كبد تشيميريك ماوس (استناداً إلى الماوس الغواتيمالية) مع pHH من مريض تحمل تحور لدلر متماثل¹⁴. في هذا النموذج، خلايا الكبد البشري repopulated قد لا لدلر الوظيفية، ولكن خلايا الكبد الماوس المتبقية، مما يقلل من فائدة للأداء في فيفو اختبار العقاقير الاعتماد على المسار لدلر.

هنا، نحن تقرير بروتوكول مفصل استناداً إلى الأعمال المنشورة مؤخرا لدينا¹⁵ انجرافتينج عبس FH في الكبد الماوس لدلر^-/-/Rag2^-/-/Il2rg^-/- (lrg صندوق). هذا الفأر تشيميريك الكبد البشري مفيد للنمذجة FH وإجراء اختبار المخدرات المجراة في.

Protocol

كافة الأساليب الموصوفة هنا التي تنطوي على استخدام الحيوانات أقرتها اللجنة المعنية "استخدام الحيوانات تعيش" في التدريس والبحوث (كولتر) من جامعة هونغ كونغ.

1-الماوس إعداد واختبار المظهرية

1. جيل من العوز الفئران خروج المغلوب (كو) لدلر .
   1. استخدام الفئران سلالات لدلر^-/-، Rag2^--/--و Il2rg^-/- (انظر الجدول للمواد).
   2. عبر الفئران^-/- Rag2مع Il2rg^--/-- الفئران لتوليد Rag2^--/--/ Il2rg^--/-- الفئران، ثم عبور الفئران^-/- لدلرمع Rag2^-/- / Il2rg^--/-- الفئران لتوليد فئران لدلر^-/-/Rag2^-/-/Il2rg^-/- (lrg صندوق)¹⁵. في سن 3 إلى 4 أسابيع، جمع الحمض النووي من الإذن لتحديد النمط الوراثي PCR وتسلسلها.
   3. في السن من 8 إلى 12 أسبوعا، استخدام الفئران الذكور lrg صندوق كمتلقين لعبس لتوليد فئران تشيميريك الكبد البشري.
2. تغذية الفئران بنظام غذائي (هفهك) عالية من الدهون والكوليسترول العالية 7 أيام قبل زرع إيب لمساعدتهم على تطوير الكوليستيرول.
3. للحث على إصابة الكبد التي تسهل انتشار عبس انجرافتيد في الكبد، وضع الفئران في حاوية معقمة ويتهددها لهم باستخدام إيرادياتور جاما مع أشعة γ بجرعة 3 غراي 24 ساعة قبل انجرافتمينت. ثم العودة الفئران إلى اقفاصها السكن. يمكن رصد الحالة الصحية لهذه الفئران المشععة بقياس الوزن.  وسوف euthanized الفئران مع فقدان الوزن 20% أو أكثر.

2-إيب التمايز والانفصال

لدلر كو متخالف (+/-) أو متماثل إيبسكس البشرية كو (-/-)، أو FH-إيبسكس المريض مع الطفرات متخالف في لدلر (FH إيبسكس) تستخدم لإنتاج عبس. جيل لدلر +/-أو-/-إيبسكس، وهو وصف إيبسكس FH في أعمالنا السابقة من التقرير¹⁵.

1. تمايز الموجهة من إيبسكس إلى إيهيبس
   ملاحظة: يتم تعديل طريقة للتفريق بين إيبسكس البشرية في عبس من تقرير سابق¹⁶.
   1. ثلاثة أيام قبل التمايز (اليوم-3)، بذور إيبسكس على المصفوفة خارج الخلية المغلفة جيدا 6 لوحات (انظر الجدول للمواد) في كثافة 300000 خلايا/بئر في 1.5 مل (كما يلي) من اللجنة التوجيهية البشرية الصيانة المتوسطة (انظر "الجدول للمواد" ) وتستكمل مع 5 ميكرومتر روك المانع (Y27632). ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5%₂ CO حاضنة هوميديفيد. عادة، وعبس من لوحة 6-بئر تكفي انجرافت 5 الفئران.
   2. بعد 24 ساعة (يوم-2) 48 ساعة في وقت لاحق (اليوم-1)، وتغيير المتوسطة إلى اللجنة التوجيهية البشرية الطازجة الصيانة المتوسطة دون مثبط لموسيقى الروك.
      ملاحظة: إيبسكس قبل التمايز ينبغي التعبير عن مستويات عالية من OCT4 ونانج، التي يمكن أن تدرسها RT-PCR الكمي، الفلورة أو التدفق الخلوي.
   3. في اليوم 0 من التمايز، تغسل الخلايا مع RPMI 1640 مرة واحدة ثم قم بإضافة 1640 RPMI تستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر أضافت A و 25 نانوغرام/مل WNT3a.
   4. في يوم 1 و 2 يوم للتمايز، تغيير المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر أضافت أ
      ملاحظة: إذا كان هناك الكثير من موت الخلايا في هذه المرحلة (0 – 3 أيام)، تصل إلى 0.5% مصل بقرى الجنين (FBS) يمكن أن تضاف إلى وسيلة لتحسين بقاء الخلية. ومع ذلك، فإننا نقترح اختبار الحد الأدنى من FBS تضاف لكل خط محدد من اللجنة التوجيهية، FBS الزائدة يمكن أن تؤثر أيضا على التفرقة.
   5. في يوم 3، تغسل الخلايا مع دميم مرة واحدة، ثم التبديل إلى 2^nd المرحلة المتوسطة (استبدال 20% مصل والأحماض الأمينية غير الأساسية x 1، ل م 2-الجلوتامين، 0.1 M بيتا-mercaptoethanol وسلفوكسيد ثنائي ميثيل 1% في المتوسط دميم). تغيير في المتوسط كل يوم حتى يوم 10.
      ملاحظة: في يوم 7، الخلايا ينبغي وصلت إلى التقاء وعرض حواف واضحة. قد يكون هناك بعض المناطق غير متمايزة التي تظهر في هذه المرحلة؛ تجاهلها إذا كانت النسبة المئوية لهذه المناطق الصغيرة. إذا كانت النسبة عالية، الحد من التقاء إيبسكس في اليوم 0 والحد من كمية FBS المستخدمة في المرحلة الأولى من التفريق.
   6. في يوم 10، تغسل الخلايا مع متوسطة القاعدية تتمثل مرة واحدة، ثم التبديل إلى تتمثل الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر البشرية الكبد عامل النمو و 20 نانوغرام/مل oncostatin م تعزيز نضج إيهيب. تغيير في المتوسط كل يوم.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، > 90% الخلايا يجب أن تكون إيجابية بالنسبة HNF4A، وفقا الفلورة تلطيخ أو التدفق الخلوي.
   7. في يوم 15 – 17، الخلايا على استعداد انجرافتمينت. بشكل اختياري، يمكن جمع المادة طافية ثقافة الخلية وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحديد كمية الزلال يفرز (القلب) بواسطة عبس.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، > عبس 80% يجب أن تكون إيجابية بالنسبة HNF4A والقلب α1-antitrypsin (محكمة الاستئناف الإدارية) وفقا لتلطيخ الفلورة. حوالي 60-70% من يوم 17 عبس ينبغي أن تكون إيجابية بالنسبة أسجبر، كما هو موضح بالتدفق الخلوي. في أيدينا، وقد عبس في هذه الفترة القدرة المثلى إعادة ملء الكبد الماوس؛ عبس قد تفرز مستويات أعلى من القلب في المختبر ولكن أيضا تصبح مسن إذا تأخر في انجرافتمينت.
2. الانفصال وتحميل عبس في محقن الأنسولين
   1. إعداد الكواشف اللازمة والمواد:
      1. 24 ساعة قبل انجرافتمينت، ذوبان الجليد المبلغ المطلوب (V = ميليلتر 40 * عدد الفئران) من المصفوفة خارج الخلية في الثلج مربع في غرفة باردة، ووضع حقنه الأنسولين ومربع من 200 ميليلتر نصائح في ثلاجة 4 درجات مئوية.
      2. ساعة واحدة قبل انجرافتمينت، الحارة الإنزيم تفكك خلية يكمل مع 50 ميكروغرام/مل الدناز أنا إلى درجة حرارة الغرفة ومكان المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 20% مصل الاستبدال على الجليد.
   2. التقاط صور التباين المرحلة (100 X و 200 X) من عبس سجل مركزها، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا، والنمو، وكثافة الخلايا.
   3. أغسل إيهيبس مع 2 مل/جيدا لدرجة حرارة الغرفة Ca^{2 +} و Mg^{2 +}-مجاناً برنامج تلفزيوني مرتين، ثم قم بإضافة 1 مل إنزيم تفكك خلية يكمل مع 50 ميكروغرام/مل الدناز أنا لكل بئر. إعادة وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 8 – 10 دقائق.
      ملاحظة: لتحسين تفكك الخلية مع خلية إنزيم الانفصال، تغسل الخلايا مع Ca^{2 +} و Mg^{2 +}-مجاناً برنامج تلفزيوني. إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلية، نقترح الناي الآبار لا يزيد عن 6 كل مجموعة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، فإننا نقترح تقييد معاملة إنزيم تفكك خلية لأقل من 10 دقائق.
   4. رصد مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر. عند معظم الخلايا تصبح الجولة، إضافة تساوي حجم الباردة 1640 RPMI تستكمل مع استبدال 20% مصل لكل بئر، "الماصة؛" الخلايا برفق لفصل من اللوحة، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل جديدة.
      ملاحظة: هذه الخطوة ذات أهمية حاسمة لبقاء الخلايا المقطوع. إذا كانت الخلايا يصعب فصلها من اللوحة، لا يهم إذا كانت بعض الخلايا التي خلفها. إذا كان فصل الخلايا كمربعات كبيرة من أحادي الطبقة، ثم "الماصة؛" بلطف بعد الطرد المركزي للحصول على تعليق خلية مفردة.
   5. كرر الخطوة 2.2.4 لكل جيدا حتى يتم جمع الخلايا المرفقة كلها تقريبا. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
   6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة في أنبوب 15 مل. "الماصة؛" الخلايا برفق للحصول على تعليق خلية واحدة ثم قم بإضافة برنامج تلفزيوني الباردة إلى وحدة تخزين نهائي 1 مل * عدد من الآبار منفصلان. وأخيراً، تمر الخلايا 40 ميكرومتر خلية مصفاة لإزالة الركام.
      ملاحظة: عادة 1-2 × 10⁶ خلايا/جيدا يمكن حصادها بعد التصفية.
   7. الكوة ميليلتر 20 من الخلية تعليق وإضافة 20 ميليلتر من محلول تريبان الأزرق 0.4%، ثم عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية وسجل تركيز تعليق خلية ك "ج". حساب حجم المطلوبة (V1 = [10⁶ * (1 n +)]/ج، حيث n هو عدد الفئران أن انجرافتيد) من تعليق خلية (1 مليون/الماوس) لحقن إينتراسبلينيك.
   8. قاسمة حجم المطلوب من تعليق خلية في أنابيب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
   9. إزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في وحدة التخزين المناسبة لبرنامج تلفزيوني الباردة جعل حجم الخلية تعليق (n + 1) * 55/2 ميليلتر (n = عدد من الفئران)، ثم قم بإضافة وحدة تخزين متساوية من المصفوفة خارج الخلية لجعل وحدة التخزين النهائي لتعليق خلية (n + 1) * 55 ميليلتر.
   10. مكان حقنه الأنسولين البارد على الجليد وتوصيل المكبس ونقل 55 ميليلتر من تعليق خلية في المحاقن وثم وضع المكبس مرة أخرى. تصريف الفقاعات بعناية ووضع المحاقن مرة أخرى على الجليد.
   11. كرر 2.3.10 حتى أن تم تحميل جميع المحاقن مع الخلايا. المحاقن أصبحت الآن جاهزة للحقن.
       ملاحظة: إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلية، نوصي بحفظ الخلايا على الجليد بعد الانفصال. 2.2.4–2.2.11 الخطوات أعلاه، تأكد الجميع الكواشف وتحفظ في 2 – 8 درجة مئوية قبل الاستخدام.

3-إينتراسبلينيك حقن عبس

1. تخدير الفئران مع الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ) حقن إينترابيريتونيلي. وضع مرهم البيطرية في عيون الفئران لمنع جفاف أثناء إجراء التخدير، ورصد تلك ردود الفعل العضلات ملاحظة تأثير التخدير وتقييم الألم.
2. مرة واحدة قد فقدت الفئران العضلات منعكس للتحفيز، مكان لهم في الحق في وضع استلقاء جانبية. تطبيق طبقة سميكة من كريم مزيل الشعر لمنطقة شق في الجهة اليسرى لمدة 5 – 8 دقائق. ثم إزالة كريم مزيل الشعر والشعر بمسح المنطقة بوسادة شاش مبلل من الماء.
3. فرك الجناح الأيسر مع بوفيدون، أو بدلاً من ذلك، مع الإيثانول 70% تليها 3 مرات امتصاص النهائي مع بوفيدون للتطهير.
4. في مستوى 2 السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تحديد موقع الطحال، التي يمكن تصور شفافية في الجناح الأيسر ومن ثم جداً الجلد وجدار البطن ل 0.5 – 1 سم. اكستيريوريزي الطحال بسحب الأنسجة الدهنية بلطف بالقرب من استخدام مدبب ملقط. استقرار الطحال استخدام مسحه بلطف.
5. أدخل إبرة حقنه الأنسولين 3 – 4 مم في حمة الطحال وضخ ما يقرب من 50 ميليلتر من تعليق خلية بلطف. سحب الإبرة ووضع مسحه القطن على موقع الحقن لدقيقة واحدة منع النزيف وانسكاب المواد.
6. العودة الطحال إلى الصفاق، وإغلاق الجرح بخيوط النايلون 5-0. ثم، الحفاظ على الفئران في دائرة/حاضنة دافئة ح 3 – 16 لإعادتها إلى قياس درجة حرارة الجسم الطبيعية وإحياء منهم. لم يتم إرجاع الفئران التي خضعت لعملية جراحية لشركة الحيوانات الأخرى حتى شُفي تماما.
7. إضافة ميلوكسيكام (26 ميكروغرام/مل) لمياه الشرب، وحقن البوبرينورفين (50 ميكروغرام/كغ) عضليا كالعقاقير المضادة للالتهابات ومسكن، على التوالي. مراقبة العمليات الجراحية الجروح يوميا لمنع أي التهاب.
   ملاحظة: تأكد من جميع الأدوات واللوازم المستخدمة في الخطوات 4-7 عقيمة.

4-اختبار مستوى LDL-C البلازما

1. في انجرافتمينت بعد انتهاء أيام 0، 7، 14 و 21 و 28، كبح جماح الفئران lrg صندوق محكم لتقليل حركة الرأس باستخدام أسلوب كبح جماح اليدين جنبا إلى جنب، ثم ثقب الوريد الوجه تستخدم في مجلة لانسيت. سوف يبدأ الدم بالتدفق بعد إزالة مجلة لانسيت. تجمع حوالي 50 ميليلتر من الدم في أنابيب 1.5 مل يحتوي على 1 ميليلتر يدتا.
   ملاحظة: إذا القبضة ضيقة جداً، وربما يتم تخفيض حجم الدم التي تم جمعها والفئران قد يموت بسبب صعوبة في التنفس.
2. خلط الدم بلطف بعكس الأنابيب عدة مرات وثم أجهزة الطرد المركزي في 950 x ز 15 دقيقة لجمع في supernatants وتخزينها مباشرة في-80 درجة مئوية.
3. حالما يتم تجميع جميع العينات، ذوبان الجليد البلازما في درجة حرارة الغرفة واختبار مستوى LDL-C استخدام مجموعة أدوات كشف LDL-C وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.

5. في فيفو "اختبار المخدرات" في "الفئران تشيميريك انجرافتيد" مع لدلر +/-وعبس FH

1. للحث على الكوليستيرول، إطعام الفئران حمية هفهك 7 أيام قبل انجرافتمينت.
2. في انجرافتمينت بعد 7 أيام، تعامل كل مجموعة من الفئران بمركبة (برنامج تلفزيوني، حقن تحت الجلد)، 10 مغ/كغ/الأسبوع PCSK9 الأجسام المضادة (صيغة السريرية الصف للأجسام المضادة PCSK9، حقن تحت الجلد جداً)، 10 مغ/كغ/يوم سيمفاستاتين (ملغ 40 مغ/لتر/ مل في مياه الشرب)، أو الجمع بين الأجسام المضادة PCSK9 وسيمفاستاتين.
3. جمع البلازما الماوس في انجرافتمينت بعد انتهاء أيام 0 (يوم انجرافتمينت)، 14 و 21 و 28. تخزين العينات في-80 درجة مئوية فورا.
4. حالما تتوفر جميع العينات، اختبار مستوى LDL البلازما باستخدام مجموعة أدوات كشف LDL-C، وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.

6. اختبار وظيفة بطانية

يتأثر في أوائل FH الدالة بطانية ويمكن اختبارها في نموذجنا الماوس كمؤشر لشدة المرض أو لتقييم التحسن مع العلاجات المختلفة. ستيريوميكروكوبي، ملقط تشريح، مقص، ميوجراف الأسلاك، واقتناء الأجهزة (انظر الجدول للمواد)، وهناك حاجة إلى جهاز كمبيوتر هذا.

1. التضحية الفئران بحقن داخل فينوباربيتال 100 مغ/كغ. إزالة الأعضاء الداخلية حيث الابهر تنازلي موازية للعمود الفقري مرئياً ويمكن تشريح خارجاً من قبل مقص جنبا إلى جنب مع النسيج المجاور والقلب. تشريح أورتاي استخدام مقص الجميلة ووضعها في البرد حل كريبس اﻷوكسيجين (مم: 119 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل و 2.5 كاكل₂، 1 MgCl₂, 25 NaHCO₃، 1.2 خ₂ص₄و 11 د-الجلوكوز).
2. نقل عورتا في حل كريبس إلى طبق بتري المغلفة بالسيليكون. رقم التعريف الشخصي لتحديد موقف الشريان الاورطي دون تمتد من النسيج الضام. تحت ستيريوميكروسكوبي، استخدام الملقط غرامة الربيع المقص وتشريح الشريان الاورطي خالية من الأنسجة المحيطة أدفينتيتيال والدهون دون إلحاق الضرر بجدار الوعاء، ثم يقتطع من 1.5 إلى 2 مم شرائح طول.
3. قطع حوالي 2 سم طويلة و 40 ميكرومتر سميكة غير القابل للصدأ الأسلاك ووضعها بلطف من خلال التجويف الشريان الاورطي. نقل هذا الجزء إلى الدائرة ميوجراف سلك مليئة بالاوكسيجين كريبس الحل بعقد السلك.
4. لقياس طول الأجزاء عورتا عند دراسة contractility، ضع كل قطعة عمودياً بين الفكين وسجل القراءة (د₁) في الميكرومتر. إزالة الجزء وتحريك الفكين معا وتسجيلها في القراءة (د₀). وسيكون طول الجزء لام = د₁-د₀.
5. اتبع دليل المستخدم المشبك الأسلاك وتأمينه مع مفك البراغي حين وضع الجزء ما بين فكي، ولكن ترك الأمر أونستريتشيد.
6. بالنسبة للتطبيع قبل التجربة، تعيين ميوجراف إلى الصفر في موقف أونستريتشيد. ثم ببطء التحرك في الفك وبصرف النظر ومراقبة التوتر الشريان الاورطي تغيير حتى وصلت إلى 3 mN. بعد 15 دقيقة، استنزاف الحل من قاعة ميوجراف، واستبدال مع الطازجة كريبس الحل والانتظار لمدة 15 دقيقة وضبط التوتر إلى 3 mN مرة أخرى.
7. تغيير الحل كريبس القياسية إلى 60 مم حل يتضمن بوكل كريبس للحث على حدوث انكماش لمالا يقل عن 15 دقيقة شطف مع الطازجة كريبس الحل 3 مرات.
8. إضافة التركيزات المتزايدة من فينيليفريني (Phe؛ مثلاً، من 10 نانومتر إلى 100 ميكرومتر). تغسل مع معيار كريبس الحل وتضاف بتركيز واحد من الفنيل ألانين في ~ 70% انكماش القصوى من الانكماش السابقة. عند الانكماش مستقرة، إضافة التركيزات المتزايدة من أستيل (منظمة العمل ضد الجوع؛ مثلاً، من شمال البحر الأبيض المتوسط 1 أو 3 إلى 10 أو 30 ميكرومتر) للحث على توسع الأوعية. يتم إضافة منظمة العمل ضد الجوع في فترة 2 دقيقة تقريبا.
   ملاحظة: في بعض قطاعات الابهر مع الانكماش الناجم عن Phe الصغيرة، على سبيل المثال أقل من 30% من بوكل الناجم عن الانكماش، U46619 (آخر مضيق للأوعية) بتركيز من 1 نانومتر إلى 30 نانومتر يمكن استخدامها لحفز انكماش استقرارا أكبر من 70% من الانكماش التي يسببها بوكل.
9. تنظيف ميوجراف وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.
10. باستخدام برنامج تحليل البيانات (انظر الجدول للمواد)، سجل القوة (F) بعد إضافة كل من المخدرات. رسم العلامة على التوتر القاعدي (و_{القاعدية}) للقياس النسبي، تحرك السهم إلى أعلى نقطة بعد الفنيل ألانين و_{الفنيل ألانين}، ومن ثم الانتقال إلى أدنى نقطة لها بعد إضافة كل من منظمة العمل ضد الجوع و_{منظمة العمل ضد الجوع}. حساب فعل منظمة العمل ضد الجوع البطانة تعتمد على توسع الأوعية (ادف) بالاسترخاء % = (و_{منظمة العمل ضد الجوع}--و_{القاعدية})/(_Phe-F و_{القاعدية}) على المحور الصادي. إعداد منحنى استجابة تركز على البرامج الإحصائية باستخدام قيمة log10 التركز في م على المحور س.
11. لتحليل الفرق الإحصائي، استخدام المنطقة تحت المنحنى لكل قطعة من الماوس واحدة، وتحليل فرق المنطقة الواقعة تحت المنحنى بين الجماعات التي تستخدم ANOVA في اتجاه واحد. يمكن أيضا أن تحلل نقاط منفردة إذا لزم الأمر.

7-دليل على إيهيب إعادة تعمير في "الكبد الماوس"

1. في النهاية، التضحية الفئران عن طريق حقن إينترابيريتونيلي فينوباربيتال 100 مغ/كغ.
2. جمع البلازما من خلال ثقب القلب. تشريح فصوص كبد باستخدام مقص العيون، ثم وضعت 10 سم المحيطة-طبق كبد ويغسل مرتين مع المالحة. إزالة الملوحة من سطح الكبد مع ورقة ماصة، ثم قطع الفصوص إلى حوالي 0.6 سم-طول قطعة. إصلاح الفصوص الكبد في الفورمالين 10%.
3. تضمين كبد الثابتة في البارافين والمقطع باستخدام أنسجة تجهيز النظام ومبضع انزلاق، على التوالي، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
4. الحرارة الشرائح إلى 60 درجة مئوية ح 1 لإذابة الشمع. ثم تزج الشرائح في زيلين نفط لمدة 5 دقائق مرتين، وترطيب الأنسجة مع الإيثانول 100%، 90% و 70% على التوالي.
5. تزج الشرائح في قاعة الشريحة التي تحتوي على حوالي 50 مل من مستضد استرجاع الحل، ومن ثم وضع الدائرة في طنجرة ضغط، 120 درجة مئوية ليغسل دقيقة 1.5 الشرائح بلطف مع أنابيب المياه لمدة 5 دقائق.
6. وصمة عار المقاطع مع الأجسام المضادة الأساسي (حوالي 100 ميليلتر في القسم) تستهدف القلب البشري (هلب) ونوى البشرية مستضد (حنا). ثم، وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع تسمية الفلورسنت أو الفجل البيروكسيديز (الذي يتفاعل مع عدة الكشف عن البث الإذاعي الرقمي).
7. لحساب النسبة المئوية لمناطق هلب + وحنا + الخلايا، مسح الشرائح ملطخة بمكافحة-هلب وحنا المضادة وتجاوب مع البث الإذاعي الرقمي باستخدام شريحة الآلي تفحص النظام للحصول على الصور قسم كامل.
   ملاحظة: كل الصور الممسوحة ضوئياً القسم مفيدة لحساب الكفاءة repopulated بطريقة غير منحازة على أساس هالب + المناطق أو حنا + الخلايا في الكبد إيمونوهيستوتشيميستري الملون. كأسلوب بديل لرصد كفاءة إعادة تعمير إيب، يمكن اختبار مستوى الزلال البشري البلازما باستخدام مجموعة محددة "أليسا القلب" البشري.
8. التقاط صور اللقطة لتغطية الشريحة كاملة باستخدام الشريحة الرقمية المرتبطة بها عرض البرمجيات تحت عرض X 5. لتحديد النسبة المئوية من هلب + المناطق، لكل صورة لقطة، استخدام المجهر برامج التصوير لتأهيل المنطقة إيجابية (P) والمساحة الإجمالية (T) للصورة، واستخدم "ي صورة" لتأهيل منطقة فارغة (ب). يعبر عن النسبة المئوية هلب + المناطق ك P/(T-B) * 100%. لكل مجموعة، وينبغي اختيار الفئران 3 على الأقل. وينبغي أن يمكن تحديدها لكل الماوس، على الأقل 4 أقسام من المواقف المختلفة للكبد.
9. لتحديد النسبة المئوية من حنا + الخلايا، لكل صورة لقطة، عشوائياً حدد 1/16 المنطقة مع برامج معالجة صور، وثم يدوياً حساب عدد الأنوية الكلي (T)، وحنا + نوى (ن). يعبر عن النسبة المئوية حنا + ك N/T * 100%. لكل مجموعة، وينبغي اختيار الفئران 3 على الأقل. لكل الماوس، يجب تحديد المقاطع 4 على الأقل من المواقف المختلفة للكبد.

النتائج

إيبسكس "تمايز الإنسان" الموجهة إلى عبس
عند التوصل إلى التقاء 70%، ميزت إيبسكس البشرية إلى عبس مع بروتوكول 3-الخطوة¹⁶ (الشكل 1 اللوحة العلوية). بعد 3 أيام تمايز الأنسجة، تصبح خففت المستعمرات اللجنة التوجيهية وامتدت إلى التقاء كامل (

Discussion

وقد أكدت دراسات السابقة باستخدام إيهيبس في القوارض فوسيلة فعالة لدراسة أمراض الكبد الموروثة¹⁷. لزيادة التوسع في استخدام هذه التكنولوجيا، ونظرا للنماذج الحيوانية FH الحالية دون المستوى الأمثل، ونحن انجرافتيد إيهيبس FH في الفئران lrg صندوق، وأظهرت أن انجرافتيد لدلر +/--أو متخ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
40 µm Cell strainer	BD	B4-VW-352340
6-Well plate	Thermofisher	140675	Extracellular matrix coated
Accutase	Millipore	SCR005
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625	Dissolve in water
Antigen retrieval solution	IHC World	IW-1100-1L
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C8106	CaCl2
Cell dissociation enzyme	Thermofisher	12604-013	TrypLE
D-glucose	Sigma Aldrich	D8270
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	D5879	DMSO
DMEM	Thermofisher	10829	Knockout DMEM
DNase I	Roche	11284932001
EDTA	USB	15694	0.5 M, PH=8.0
Extracellular matrix (for cell suspension)	Corning	354234	Matrigel
Extracellular matrix (for iHep differentiation)	Corning	354230	Matrigel
Hepatocyte basal medium	Lonza	CC-3199
Hepatocyte culture medium	Lonza	CC-3198
High-fat and high-cholesterol diet	Research Diet	D12079B
Human Activin A	Peprotech	120-14E
Human hepatocyte growth factor	Peprotech	100-39
Human iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	5850	mTeSR1
Human oncostatin M	Peprotech	300-10
Ketamine 10%	Alfasan	N/A
L-glutamine	Thermofisher	35050
LDL-C detection kit	WAKO	993-00404 and 993-00504
Magnesium chloride	VWR	P25108	MgCl2
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	NADA 141-213
Monopotassium phosphate	USB	S20227	KH2PO4
Non-essential amino acids	Thermofisher	11140
PBS	GE	SH30256.02	Calcium and magnesium-free
PCSK9 antibodies	Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals	SAR236553/REGN727	Alirocumab
Phenobarbital	Alfamedic company	013003
Phenylephrine	RBI	P-133	Dissolve in water
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333	KCl
Povidone-iodine	Mundipharma	Betadine
Recombinant mouse Wnt3a	R&D Systems	1324-WN-500/CF
ROCK inhibitor Y27632	Sigma Aldrich	Y0503-5MG
RPMI 1640	Thermofisher	21875
Serum replacement	Thermofisher	10828
Silicone coated petri dish	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Simvastatin	Merck Sharp & Dohme	ZOCOR
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6297	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653	NaCl
Trypan blue solution 0.4%	Thermofisher	15250061
U-46619	Cayman	16450	Dissolve in DMSO
Xylazine 2%	Alfasan	N/A
β-mercaptoethanol	Thermofisher	31350
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
AAT	DAKO	A0012	1:400
ALB	Bethyl Laboratories	A80-129	1:200
ASGPR	Santa Cruz	Sc-28977	1:100
HNF4A	Santa Cruz	Sc-6557	1:35
NANOG	Stemgent	09-0020	1:200
OCT4	Stemgent	09-0023	1:200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Il2rg-/-	Jacson lab	003174
Ldlr-/-	Jacson lab	002077
Rag2-/-	Jacson lab	008449
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Automated cell counter	Invitrogen	Countess
Gamma irradiator	MDS Nordion	Gammacell 3000 Elan II
Insulin syringe	BD	324911
Powerlab	ADInstruments	Model 8/30
Slides scanning system	Leica biosystems	Aperio scanScope system
Sliding Microtome	Leica biosystems	RM2125RT
Stereomicrocope	Nikon	SMZ800
Tissue processing system	Leica biosystems	ASP200S
Wire myograph	DMT	610M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Softwares
Digital slide viewing software	Leica	Aperio ImageScope Version 12.3.2
Image J	NIH	Version 1.51e
Image processing software	Adobe	Photoshop CC Version 2015
Microscope imaging software	Carl Zeiss	AxioVision LE Version 4.7