İndüklenmiş Pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak ailesel hiperkolesterolemi insan karaciğer Chimeric fare modeli

Özet

Burada, ailesel hiperkolesterolemi insan indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak bir insan karaciğer chimeric fare modeli oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yeni tedaviler hiperkolesterolemi için test etmek için değerli bir modeldir.

Özet

Ailesel hiperkolesterolemi (FH) çoğunlukla düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör (LDLR) mutasyonlar neden olur ve kan LDL kolesterol (LDL-C) işaretli yükselmesi nedeniyle erken başlangıçlı kardiyovasküler hastalık riski sonuçları. Statinler, lipid düşürücü ilaçlar FH ve diger hiperkolesterolemi tedavi için ilk satırı olmakla birlikte, yeni yaklaşımlar, şimdi klinik denemeler test edilen belirli PCSK9 antikor olarak ortaya çıkıyor. Yeni tedavi yaklaşımları FH, yeni ilaçlar ya da yeni formülasyonları, keşfetmek için in vivo modelleri uygun. Ancak, farklar insanlara göre lipid metabolik profilleri FH. hayvan mevcut modellerin önemli bir sorun Bu sorunu gidermek için indüklenen FH pluripotent kök hücre (IPSC) kullanarak bir insan karaciğer chimeric fare modeli üretilip-tetkikine (iHeps) türetilmiş. Biz/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) fareler transplante insan hücreleri bağışıklık ret önlemek için ve LDLRetkisini değerlendirmek için kullanılır-eksik iHeps bir LDLR içinde null arka plan. Transplante FH iHeps insan albumini boyama dayalı LRG fare karaciğer % 5-10'u yeniden doldurmanız. Ayrıca, engrafted iHeps lipid düşürücü ilaçlara yanıt ve artan PCSK9 antikorlar statinler için karşılaştırıldığında etkinliğinin klinik gözlemleri recapitulated. İnsan karaciğer chimeric modelimiz böylece FH yeni tedavilere preklinik sınamak için yararlı olabilir. Diğer FH genetik varyantların veya devralınan diğer karaciğer hastalıkları için karşılık gelen mutasyonlar için aynı iletişim kuralını, benzer insan karaciğer chimeric fare kullanılarak da oluşturulabilir.

Giriş

Düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör (LDLR) LDL kolesterol (LDL-C) kan kolesterol sentezi karaciğer modüle yakalar. LDLR gen mutasyonlar ailesel hiperkolesterolemi (FH)¹en sık nedenidir. Statinler geleneksel FH ve diğer tip-in (kalıtsal veya edinsel) hiperkolesterolemi tedavi için ilaç ilk satırı olmuştur. Statinler 3-hidroksi-3-methylglutaryl-koenzim kolesterol sentezi karaciğer²düşürmek için bir redüktaz inhibe. Ayrıca, Statinler hepatosit yüzeyindeki plazma LDL-C izni teşvik LDLR düzeylerini artırmak. Ancak, tedavi statinler ile büyük bir ihtar aynı anda proprotein konvertaz subtilisin/hexin 9 (PCSK9), LDLR için onun yıkımı³tanıtmak için bağlar bir enzim ifade ikna etmek olduğunu. Bu etki çok hastalarda gözlenen statinler yetersiz veya bile boş yanıt sorumludur. Bu mekanizma eğitim beklenmedik bir şekilde, hiperkolesterolemi tedavi için alternatif bir yol bulma için yol açmıştır. Yakın zamanda FDA tarafından onaylanmış PCSK9 antikorlar klinik çalışmalarda kullanılmakta olan ve daha yüksek etkinlik ve Statinler⁴' ten daha iyi tolerans göstermek. PCSK9 antikor başarısı Ayrıca hiperkolesterolemi olan hastalarda (PCSK9) yanında LDLR düşmesine yol modüle için diğer tedavi olanakları olabilir anlamına gelir. Benzer şekilde, PCSK9 yeni inhibitörleri antikorlar, örneğin, siRNA oligos⁵dışında gelişmekte olan ilgi olduğunu.

FH ve hiperkolesterolemi genel olarak başka herhangi bir tür için yeni tedaviler sınamak için uygun vivo içinde modelleri gereklidir. Geçerli vivo içinde büyük bir sorun modelleri, çoğunlukla fare⁶ ve⁷, tavşan insanlarla kendi fizyolojik farklılıklar vardır. En önemlisi, bu sorunlar farklı lipid metabolizma profili içerir. İnsan karaciğer chimeric hayvanlar⁸ nesil bu uyarı üstesinden yardımcı olabilir. İnsan karaciğer chimeric fare insan tetkikine, örneğin, birincil insan tetkikine (pHH)⁹depolanmışsa, karaciğer ile "insanlaşmış" fare türüdür. Onlar hızlı bir şekilde genişletilmiş ex vivo, olamaz pHH ile ilgili bir sorun olduğunu işlevlerine yalıtım üzerine kaybetmek ve sınırlı bir kaynaktır. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) kullanımı pHH bir alternatiftir-tetkikine (iHeps)¹⁰türetilmiş. Özellikle iPSCs hastaya özgü olduğunu ve iHeps taze pHH önemli bir avantaj olan isteğe bağlı olarak üretilen bu yüzden sonsuza kadar yetiştirilir. Ayrıca, iPSCs da kolayca düzeltin veya daha sadık karşılaştırmalar¹¹izin vermek için isogenic bir arka plan mutasyonların tanıtmak için tasarımcı enzimler ile genetik olarak.

İnsan karaciğer chimeric fare ile engrafted pHH insanlarda karaciğer metabolik profilleri, uyuşturucu yanıt ve hepatit virüsü enfeksiyonu¹²duyarlılık için benzerlikler gösterir. Bu hiperlipidemi vivo içindeçalışmak için iyi bir model sağlar. En çok kullanılan fare modelleri/Fah^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (FRG) fare¹³ ve uPA transgenik fare⁸içinde hangi ilâ %95 fare karaciğer pHH tarafından değiştirilebilir, temel alır. İlginçtir, bir rapora (FRG fare bağlı olarak) bir insan FH karaciğer chimeric fare ile pHH bir homozigoz LDLR mutasyon¹⁴taşıyan bir hastadan nitelendirdi. Bu modelde, repopulated insan tetkikine hiçbir işlev LDLR vardı ama artık fare tetkikine yaptım, böylece azaltmak belgili tanımlık yarar- in vivo LDLR yolu üzerinde güvenerek ilaçların test gerçekleştirmek için.

Burada, detaylı bir protokol FH iHeps Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) fare karaciğer engrafting için bizim kısa bir süre önce iş¹⁵ temel raporu. Bu insan karaciğer chimeric fare FH modelleme ve uyuşturucu testi gerçekleştirmek için yararlıdır içinde vivo.

Protokol

Hayvanlar kullanımı dahil tüm yöntem tanımlamak burada kullanmak, canlı hayvanlar öğretim ve araştırma (CULATR) Hong Kong Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmış olması.

1. hazırlık ve fenotipik test fare

1. İmmünyetmezligi Ldlr nakavt (KO) fareler nesil.
   1. Fareler suşları Ldlr^{- / -}, Rag2^{- / -}ve Il2rg^{- / -} ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın.
   2. Rag2^{- / -} fareler oluşturmak için Rag2^{- / -} Il2rg^{- / -} fareler ile çapraz / Il2rg^{- / -} fareler, daha sonra çapraz ile Rag2^{- / - Ldlr- / - fareler} / Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) fareler¹⁵oluşturmak için Il2rg^{- / -} fareler. 3-4 hafta yaşında, genomik DNA PCR ve sıralamanın tarafından genotip belirlemek için kulak toplamak.
   3. 8-12 hafta yaşında erkek LRG fareler iHeps alıcılarına insan karaciğer chimeric fareler oluşturmak için kullanın.
2. Fareler iHep nakli hiperkolesterolemi geliştirmelerine yardımcı olması için önce 7 gün yüksek yağlı ve yüksek kolesterol (HFHC) diyet ile beslenir.
3. Karaciğer engrafted iHeps yayılması kolaylaştırır karaciğer hasarı ikna etmek için fareyi steril bir kap içine yerleştirin ve γ-ışınları, 3 Gy 24 h engraftment önce bir doz ile bir gama irradiator kullanarak ışınlatayım. O zaman, fareler için onların konut kafes dönmek. Bu radyoaktif fareler sağlıklı durumunu kendi ağırlığı ölçerek izlenebilir.  Fareler veya daha fazla % 20 kilo kaybı olan euthanized.

2. iHep farklılaşma ve ayrılma

LDLR Heterozigoz KO (+/-) ya da homozigoz KO (- / -) insan iPSCs veya FH hasta-iPSCs LDLR (FH iPSCs) Heterozigoz mutasyonların ile iHeps üretmek için kullanılır. LDLR + /-nesil veya- / - iPSCs ve FH iPSCs bizim önceki rapor¹⁵' te açıklanmıştır.

1. İPSCs yönlendirilmiş farklılaşma iHeps içine
   Not: İnsan iPSCs farklılaşma iHeps içine için yöntem--dan önceki rapor¹⁶değiştirilir.
   1. Üç gün önce farklılaşma (gün -3), tohum hücre dışı matriks üzerine iPSCs 300.000 1,5 mL (bundan sonra da) insan IPSC bakım Orta (bkz: malzemeler tablo içinde hücre/iyi bir yoğunluk itibariyle ( Tablo malzemelerigörmek) 6-şey plakaları kaplı ) 5 µM ROCK inhibitörü (Y27632) ile desteklenmiştir. Bir % 5 CO₂ oksijen kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür. Normalde, bir 6-şey plaka iHeps 5 fare engraft için yeterli.
   2. 24 saat sonra (gün -2) ve 48 saat sonra (gün -1), taze insan IPSC bakım orta ROCK engelleyici olmadan orta değiştirmek.
      Not: yüksek düzeyde OCT4 ve kantitatif RT-PCR, ayirt veya akış sitometresi tarafından incelenebilir MİCRORNAS iPSCs farklılaşma önce hızlı.
   3. Gün 0 farklılaşma, RPMI 1640 hücrelerle bir kez yıkama ve RPMI 100 ng/mL aktivin A ve 25 ng/mL WNT3a ile 1640 ekleyin.
   4. 1. gün ve gün 2 farklılaşma, orta RPMI 100 ng/mL ile aktivin a takıma 1640 için değiştirin
      Not: Bu aşamada çok fazla hücre ölümü olup olmadığını (gün 0-3), en çok % 0.5 fetal Sığır serum (FBS)-ebilmek var olmak mülhak hücre canlılık geliştirmek için orta. Ancak, biz aşırı FBS de farklılaşma etkileyebilir gibi FBS her belirli IPSC satırı için eklenecek en az miktarda test öneririz.
   5. Gün 3, DMEM hücrelerle bir kez yıkamak ve 2^nd sahne Orta (% 20 serum değiştirme, 1 x esansiyel olmayan amino asitler, 2 M L-glutamine, 0.1 M beta-mercaptoethanol ve % 1 dimetil sülfoksit DMEM orta) geçin. Orta gün 10 kadar her gün değiştirin.
      Not: 7 günde hücreleri izdiham ve ekran açık kenarları ulaşmış olmanız gerekir. Bu aşamada görünen farklılaşmamış bazı alanlarda olabilir; Bu alanların yüzde küçük ise görmezden gel. Yüzdesi yüksekse, iPSCs izdiham gün 0 saat ve farklılaşma ilk aşamasında kullanılan FBS miktarını azaltabilir.
   6. Gün 10, hepatosit bazal orta hücrelerle bir kez yıkamak ve hepatosit kültür 20 ng/mL insan karaciğer büyüme faktörü ve iHep olgunlaşma tanıtmak için 20 ng/mL oncostatin M ile desteklenmiş orta geçin. Orta her gün değiştirin.
      Not: Bu aşamada, > hücreleri yüzde 90'ını ayirt boyama veya akış sitometresi göre HNF4A için pozitif olmalıdır.
   7. Gün 15-17, engraftment için hazır hücrelerdir. İsteğe bağlı olarak, hücre kültürü süpernatant geçirilebilir ve iHeps tarafından salgılanan albumin (ALB) miktarının için-80 ° C'de depolanan.
      Not: Bu aşamada, > % 80 iHeps HNF4A, ALB ve α1-ayirt boyama göre antitripsin (AAT) için pozitif olmalıdır. Etrafında akış sitometresi tarafından gösterildiği gibi gün 17 iHeps % 60-70'i ASGPR için pozitif olmalıdır. Elimizde, bu dönemde iHeps fare karaciğer yeniden doldurmanız için en uygun kapasitesine sahip; iHeps ALB tüp bebek daha yüksek seviyelere salgılar ama aynı zamanda engraftment gecikirse senescent haline.
2. Ayrılma ve iHeps yükleme bir insülin şırınga içine
   1. Gerekli reaktifler ve malzemeleri hazırlayın:
      1. 24 saat önce engraftment, çözülme gerekli miktar (V 40 µL = * fareler numarası) hücre dışı matriks bir buz, soğuk bir odada kutu ve insülin şırınga ve bir kutu 200 µL ipuçları 4 ° C buzdolabı içine koymak.
      2. Bir saat önce engraftment, sıcak hücre ayrılma enzim takıma 50 µg/mL ile DNaz ben oda sıcaklığına ve % 20 serum yerine buz üzerinde ile takıma RPMI 1640 ortamın.
   2. Faz kontrast görüntüler (100 X ve 200 X) durumlarını hücre morfolojisi, büyüme ve hücre yoğunluğu gibi kaydetmek için iHeps al.
   3. İHeps 2 mL/iyi, oda sıcaklığında Ca^{2 +} ve Mg^{2 +}yıkama-PBS iki kez ücretsiz ve hücre ayrılma enzim 1 mL takıma 50 µg/mL ile DNaz ben her şey için ekleyin. Hücreleri kuluçka makinesi 8 – 10 dakika içine koy.
      Not: hücre ayrılma enzim hücre ayrılma artırmak için hücreleri Ca^{2 +} ve Mg^{2 +}yıkama-PBS ücretsiz. Hücre canlılığı en üst düzeye çıkarmak için toplu iş başına 6 kuyu teker teker dissociating öneririz. Ayrıca, hücre ayrılma enzim tedavisi için 10 dakikadan daha az kısıtlama öneririz.
   4. Mikroskop altında hücre morfolojisi izlemek. Hücrelerin çoğu yuvarlak olduğunda, soğuk RPMI 1640 ile her şey için % 20 serum yedek takıma eşit bir birim eklemek, yavaşça plaka ayırmak için hücreleri pipette ve hücre süspansiyon için yeni bir 15 mL tüp nakletmek.
      Not: Bu hasat hücrelerin canlılık için kritik bir adımdır. Hücreleri plaka ayırmak zor ise, bazı hücreleri bırakılırsa farketmez. Hücreleri monolayer büyük kareler olarak ayırırsanız, sonra yavaşça Santrifüjü sonra bir tek hücre süspansiyon elde etmek için pipet.
   5. Neredeyse tüm bağlantılı hücreleri de toplanan kadar 2.2.4 her için tekrarlayın. 4 ° C'de 3 min için 200 x g , santrifüj
   6. Süpernatant kaldırmak ve bir 15 mL tüp soğuk PBS 2 mL içeren hücreleri resuspend. Yavaşça bir tek hücre süspansiyon edinmek ve sonra soğuk PBS son hacmi 1 mL için eklemek için hücre pipette * Disosiye kuyu sayısı. Son olarak, hücreleri toplamları kaldırmak için bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
      Not: Normalde 1-2 x 10⁶ hücreler/iyi süzme sonra hasat edilebilir.
   7. Aliquot 20 µL hücre süspansiyon ve 20 µL % 0,4 trypan mavi çözüm ekleyin, sonra bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak ve hücre süspansiyon konsantrasyon "C" olarak kaydedin. Gerekli hacim hesaplamak (V1 = [10⁶ * (n + 1)] / C, burada n engrafted için fare sayısı) hücre süspansiyon (1 milyon/fare) intrasplenic enjeksiyon için.
   8. Aliquot hücre süspansiyon 15 mL tüpler ve 200 x g , santrifüj 4 ° C'de 3 min için gerekli hacmi
   9. Süpernatant kaldırmak için hücre süspansiyon (n + 1) birimi açmak için soğuk PBS uygun cilt hücrelerinde resuspend * 55/2 µL (n = fare sayısı) ve hücre dışı matriks hücre süspansiyon (n + 1) son hacim yapmak için eşit bir hacmi ekleyin * 55 µL.
   10. Soğuk insülin şırınga buza koyun, pistonu çıkarın, hücre süspansiyon, 55 µL şırınga aktarmak ve pistonu geri koy. Kabarcıklar dikkatli bir şekilde deşarj ve şırıngayı geri buza koy.
   11. Tüm şırınga içeren hücreleri yüklemiş olduğunuz kadar 2.3.10 yineleyin. Şırıngaları enjeksiyon için hazırsınız.
       Not: hücre canlılığı en üst düzeye çıkarmak için ayrılma sonra hücreler buz üzerinde tutulması tavsiye. Yukarıdaki adımları 2.2.4–2.2.11 için tüm reaktifler kullanılmadan önce 2-8 ° C'de tutulur emin olun.

3. intrasplenic enjeksiyon iHeps

1. Ketamin (100 mg/kg) ve intraperitoneally enjekte xylazine (10 mg/kg) ile fareler anestezi. Fareler gözleri kuruluk anestezi işlemi sırasında önlemek için veteriner merhem koymak ve gözlemleyebilirsiniz anestezi ve ağrı değerlendirmek için onların kas refleksleri izlemek.
2. Fareler kas refleks uyarılması için kaybetmiş sonra sağ yanal dekübitus getirin koyun. 5-8 dakika sol kanat kesik alanına depilatory Krem kalın bir tabaka uygulayın. Sonra depilatory kremi ve saç alan su ıslatılmış gazlı bez pad ile silerek kaldırın.
3. Sol kanat povidone-iyot ile ya da alternatif olarak, bir son povidone-iyot dezenfeksiyonunda ile ıslatarak 3 kez takip % 70 etanol ile fırçalayın.
4. Bir düzey 2 Biyogüvenlik kabini içinde sol kanat saydam olarak görüntülenmeyecektir ve cilt ve karın duvarı deşmek dalak, konumunu bulun için 0,5-1 cm. Exteriorize dalak yağ dokusu kullanarak yakınındaki yavaşça dışarı sivri çekerek forseps. Yavaşça bir bez kullanarak dalak stabilize.
5. İnsülin enjektörü 3-4 mm iğne dalak parankimi yerleştirin ve yaklaşık 50 µL hücre süspansiyon, yavaşça enjekte. İğne geri çekmek ve kanama önlemek için 1 dakika ve dökülme malzeme için enjeksiyon sitesi üzerinden bir pamuklu çubukla yerleştirin.
6. Dalak için Karın zarını dönmek ve 5-0 naylon dikiş yarayla kapatın. Daha sonra fareler bir sıcak odası/kuluçka 3-16 h onları onların normal vücut ısısı dönmek için ve onları canlandırmak için tutmak. Cerrahi undergone fareler tamamen iyileşti kadar diğer hayvanlar şirkete iade edilmez.
7. Meloksikam (26 μg/mL) içme suyu ekleyin ve buprenorfin (50 μg/kg) intramüsküler anti-inflamatuar ilaç ve ağrı kesici, sırasıyla enjekte. Monitör cerrahi herhangi bir inflamasyon önlemek için günlük yaralar.
   Not: 4-7 adımda kullanılan malzeme ve aletleri steril olduğundan emin olun.

4. test plazma LDL-C düzeyi

1. 0, 7, 14, 21 ve 28 gün sonrası engraftment, sıkı bir şekilde yan yana hareket iki elle dizginlemek yöntemini kullanarak başın en aza indirmek için LRG fareler dizginlemek, daha sonra lancet kullanarak yüz ven ponksiyon. Kan lancet çıkarıldıktan sonra akmaya başlayacak. Yaklaşık 50 µL kan EDTA 1 µL içeren 1,5 mL tüpler içine toplamak.
   Not: kavrama çok sıkı ise, toplanan kan hacmi azalabilir ve fareler zorluk nefes yüzünden ölebilir.
2. Kan karışımı yavaşça tüpler birkaç kez ters çevirme tarafından ve daha sonra 15 dakika süreyle santrifüj-950 x g , supernatants toplamak ve onları hemen-80 ° C'de depolayın.
3. Bir kez tüm örnekleri toplanır, plazma oda sıcaklığında erimek ve üretici kılavuzuna göre LDL-C algılama seti kullanarak LDL-C seviyesini test.

5. Vivo içinde uyuşturucu testi fareler Chimeric Engrafted LDLR +/-ve FH iHeps içinde

1. Hiperkolesterolemi ikna etmek için fareyi beslemek HFHC yiyecek engraftment önce 7 gün.
2. 7 gün sonrası engraftment araç (PBS, subkutan enjekte), 10 mg/kg ile fareler her grup tedavi/hafta PCSK9 antikorlar (PCSK9 monoklonal antikorlar, subkutan çok enjekte bir klinik-grade formülasyon), 10 mg/kg/gün simvastatin (40 mg/L mg / içme suyundaki mL), veya PCSK9 antikorlar ve simvastatin kombine.
3. Fare plazma, 0 (engraftment günü), 14, 21 ve 28 gün sonrası engraftment toplamak. Hemen örnekleri-80 ° C'de depolayın.
4. Tüm örnekleri mevcuttur kez bir LDL-C algılama kit kullanarak plazma LDL düzeyi üreticisinin göre sınayın.

6. endotel fonksiyon testi

Endotel işlevin erken FH etkilenir ve bizim fare modelinde önem hastalık veya farklı tedaviler ile iyileşme değerlendirmek için bir göstergesi olarak test edilebilir. Bir stereomicrocope, diseksiyon pens, makas, bir tel myograph, edinme donanım (bkz. Tablo reçetesi) ve bir bilgisayar bunun için ihtiyaç vardır.

1. Fareler 100 mg/kg phenobarbital mayi enjeksiyonu ile kurban. Böylece inen aorta için omurga paralel görünür ve dışarı makas ile birlikte bitişik doku ve kalp tarafından disseke iç organları kaldırın. İyi makas kullanarak aortae teşrih ve soğuk oksijenli Krebs çözümde koyun (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl₂, 1 MgCl₂, 25 NaHCO₃, 1.2 KH₂PO₄ve 11 D-glikoz).
2. Aortae Krebs çözüm için silikon kaplı petri kabına aktarın. PIN olmadan uzanan aort pozisyonu düzeltmek için bağ dokusu. Bir stereomicroscope, makas bahar ve çevresindeki yağ ve adventitial dokudan ücretsiz aort damar duvar zarar vermeden incelemek için iyi forseps kullanım altında sonra 1,5-2 mm uzunluğu kesimleri kes.
3. Kesilmiş bir yaklaşık 2 cm uzun ve 40 mikron kalınlığında Paslanmaz tel ve aortun Lümen ile kırmadan. Segment tel tutarak oksijenli Krebs çözüm ile dolu tel myograph odasına aktar.
4. Contractility okurken aortae kesimleri uzunluğunu ölçmek için her kesimi dik jaws ve kayıt okuma (D₁) arasında mikrometre üzerinde yerleştirin. Segment kaldırmak ve çene birlikte hareket ve okuma (D₀) kaydedin. Kesimin uzunluğu L olurdu = D₁-D₀.
5. Tel kelepçe ve çene arasında segment yerleştirerek iken tornavida ile güvenli kullanım kılavuzu izleyin ama uzatılmamış bırakın.
6. Deneme önce normalleştirme için myograph uzatılmamış konumda sıfır olarak ayarlayın. Daha sonra yavaş yavaş ayrı çene hareket ve 3 mN erişene dek değiştirmek aort gerginlik gözlemlemek. 15 dakika sonra myograph odası çözümden drenaj ve taze Krebs çözüm yerine, için 15 dakika bekleyin ve tekrar gerilim 3 mN için ayarlayın.
7. Standart Krebs çözüm 60 mM Krebs KCl içeren çözüm bir kasılma için en az 15 dk. durulama taze Krebs çözüm ile 3 kez ikna etmek için değiştirin.
8. Phenylephrine (Phe; artan konsantrasyonları Ekle Örneğin, 10 nM için 100 mikron). Standart Krebs çözüm ile yıkayın ve ~ %70--dan önceki daralma maksimal daralma Phe tek bir konsantrasyon ekleyin. Daralma stabil, asetilkolin (ACh; artan konsantrasyonları ekleyin Örneğin, üzerinden 10 veya 30 µM için 1 veya 3 nM) vazodilatasyon ikna etmek için. ACh yaklaşık 2 dk aralıklarla eklenir.
   Not: küçük Phe kaynaklı kasılması ile aort bazı kesimlerinde örneği KCl için % 30 daha küçük indüklenen kasılma, U46619 (başka bir vasoconstrictor) adlı bir konsantrasyon 1 nM 30 nM-ebilmek var olmak kullanılmış-70 %'den büyüktür istikrarlı bir daralma ikna etmek için Kasılma kCl kaynaklı.
9. Üretici kılavuzuna göre myograph temiz.
10. Veri analiz yazılımı kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), kayıt sonra uyuşturucu her ek kuvvet (F). İşaretçiyi için bazal gerginlik çizmek (F_bazal) göreli ölçüm için oku en yüksek noktaya Phe sonra F_Phetaşıyın ve sonra her ek olarak F_AChACH sonra en düşük noktasına taşıyın. ACh kaynaklı endotel bağımlı vazodilatasyon (EDV) tarafından % gevşeme hesaplamak = (F_ACh-F_bazal) / (F_Phe-F_bazal) y ekseni üzerinde. İstatistiksel yazılım log10 konsantrasyon M x ekseni üzerinde kullanarak bir konsantrasyon yanıt eğri hazırlayın.
11. İstatistiksel fark çözümlemek her segmentin bir fareden eğri altındaki alan kullanın ve tek yönlü ANOVA kullanarak grupları arasında eğri altındaki alan fark analiz. Bireysel puan da gerekirse analiz edilebilir.

7. iHep fare karaciğer Repopulation kanıtı

1. Uç noktada fareler intraperitoneally 100 mg/kg phenobarbital enjekte edilerek kurban.
2. Plazma tarafından kalp ponksiyon toplamak. Oftalmik makas kullanarak karaciğer lobları teşrih sonra karaciğerleri bir 10 cm peri yemek koymak ve iki kez salin ile yıkayın. Emici kağıt ile karaciğer yüzeyinden salin kaldırın ve sonra içine loblar etrafında 0,6 cm uzunluğunda parçalar kesin. Karaciğer lobları % 10 formalin içinde düzeltmek.
3. Parafin ve bölümünde sırasıyla, üreticinin talimatlarına göre işleme sistemi ve sürgülü bir microtome, bir mendil kullanarak sabit karaciğerleri gömün.
4. Slaytlar balmumu eritmek 1 h için 60 ° c ısı. Sonra iki kez 5 min için ksilen içindeki slaytları bırakın ve % 100, % 90 ve % 70 etanol ile doku gittikçe rehydrate.
5. Slaytları Slayt-odası yaklaşık 50 mL antijen alma çözeltisi içeren ve sonra içine düdüklü tencere, 120 ° C için hafifçe boru ile slaytlar için 5 dakika su 1,5 dk. yıkama odası koymak içine bırakın.
6. Birincil antikorlar (yaklaşık 100 µL/bölüm) insan ALB (hALB) ve insan çekirdeği antijen (hNA) hedefleme bölümlerle leke. O zaman, bir floresan etiket ya da (ki DAB algılama kiti ile reaksiyona girer) horseradish peroksidaz ile Birleşik ikincil antikorlar ile leke.
7. HALB + alanları ve hNA + hücre yüzdesini hesaplamak için anti-hALB ve anti-hNA ile lekeli ve bölüm görüntüler elde etmek için sistem tarama otomatik bir slayt kullanarak DAB ile tepki slaytlar inceden inceye gözden geçirmek.
   Not: Bütün bölüm taranan görüntüleri tarafsız bir şekilde hALB + alanları veya hNA + immünhistokimya lekeli karaciğer hücrelerinde dayalı verimlilik yeniden hesaplamak yararlıdır. İHep repopulation etkinliğini izlemek için alternatif bir yöntem plazma insan albümin düzeyi bir insan belirli ALB ELISA kiti kullanarak test edilebilir.
8. 5 X görünümü altında yazılım ile ilgilenen ilişkili dijital slayt kullanarak tüm slayt kapak için anlık görüntü fotoğraf çekmek. HALB + yüzdesi ölçmek için alanları, her anlık görüntü görüntü görüntü için düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop pozitif alan (P) ve görüntünün toplam alanı (T) hak kazanmak için kullanın ve boş alan (B) hak kazanmak için görüntü J kullanın. HALB + alanları yüzdesi P/(T-B) ifade edilir * % 100. Her grup için en az 3 fare seçilmesi gerekir. Ve her fare karaciğer farklı konumlardan en az 4 bölüm seçilmelidir.
9. HNA + yüzdesi ölçmek için hücreler, her anlık görüntü görüntü görüntü için rastgele bir görüntü işleme yazılımı ile 1/16 alan seçin ve sonra el ile toplam çekirdek (T) ve hNA + çekirdeği (N) saymak. HNA + yüzdesi N/T ifade edilir * % 100. Her grup için en az 3 fare seçilmesi gerekir. Her fare karaciğer farklı konumlardan en az 4 bölüm seçilmelidir.

Sonuçlar

Yönlendirilmiş farklılaşma insan iPSCs iHeps içine
% 70 izdiham ulaşmak zaman, iHeps bir 3-adım Protokolü¹⁶ (Şekil 1 üst paneli) ile içine insan iPSCs farklı. Endoderm farklılaşma 3 gün sonra IPSC kolonileri gevşetti ve tam izdiham (Şekil 1 alt paneli) yayıldı. Sonra 2^nd sahne orta, hepatoblasts görünür ve çoğalırlar. Bu hücreler kalabalık ama açı...

Tartışmalar

Önceki çalışmalarda iHeps kemirgen kullanarak onlar devralınan karaciğer hastalıkları¹⁷eğitim için etkili bir yoldur doğruladı. Bu teknolojinin kullanımı daha da genişletmek ve geçerli FH hayvan modelleri suboptimal olduğu için biz LRG fareler FH iHeps engrafted ve engrafted LDLR +/-veya Heterozigoz LDLRgösterdi-mutasyona uğramış FH iHeps fareler plazma LDL-C düzeyini azaltabilir ve vivo içindeyanıt lipid düşürücü ilaçlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
40 µm Cell strainer	BD	B4-VW-352340
6-Well plate	Thermofisher	140675	Extracellular matrix coated
Accutase	Millipore	SCR005
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625	Dissolve in water
Antigen retrieval solution	IHC World	IW-1100-1L
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C8106	CaCl2
Cell dissociation enzyme	Thermofisher	12604-013	TrypLE
D-glucose	Sigma Aldrich	D8270
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	D5879	DMSO
DMEM	Thermofisher	10829	Knockout DMEM
DNase I	Roche	11284932001
EDTA	USB	15694	0.5 M, PH=8.0
Extracellular matrix (for cell suspension)	Corning	354234	Matrigel
Extracellular matrix (for iHep differentiation)	Corning	354230	Matrigel
Hepatocyte basal medium	Lonza	CC-3199
Hepatocyte culture medium	Lonza	CC-3198
High-fat and high-cholesterol diet	Research Diet	D12079B
Human Activin A	Peprotech	120-14E
Human hepatocyte growth factor	Peprotech	100-39
Human iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	5850	mTeSR1
Human oncostatin M	Peprotech	300-10
Ketamine 10%	Alfasan	N/A
L-glutamine	Thermofisher	35050
LDL-C detection kit	WAKO	993-00404 and 993-00504
Magnesium chloride	VWR	P25108	MgCl2
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	NADA 141-213
Monopotassium phosphate	USB	S20227	KH2PO4
Non-essential amino acids	Thermofisher	11140
PBS	GE	SH30256.02	Calcium and magnesium-free
PCSK9 antibodies	Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals	SAR236553/REGN727	Alirocumab
Phenobarbital	Alfamedic company	013003
Phenylephrine	RBI	P-133	Dissolve in water
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333	KCl
Povidone-iodine	Mundipharma	Betadine
Recombinant mouse Wnt3a	R&D Systems	1324-WN-500/CF
ROCK inhibitor Y27632	Sigma Aldrich	Y0503-5MG
RPMI 1640	Thermofisher	21875
Serum replacement	Thermofisher	10828
Silicone coated petri dish	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Simvastatin	Merck Sharp & Dohme	ZOCOR
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6297	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653	NaCl
Trypan blue solution 0.4%	Thermofisher	15250061
U-46619	Cayman	16450	Dissolve in DMSO
Xylazine 2%	Alfasan	N/A
β-mercaptoethanol	Thermofisher	31350
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
AAT	DAKO	A0012	1:400
ALB	Bethyl Laboratories	A80-129	1:200
ASGPR	Santa Cruz	Sc-28977	1:100
HNF4A	Santa Cruz	Sc-6557	1:35
NANOG	Stemgent	09-0020	1:200
OCT4	Stemgent	09-0023	1:200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Il2rg-/-	Jacson lab	003174
Ldlr-/-	Jacson lab	002077
Rag2-/-	Jacson lab	008449
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Automated cell counter	Invitrogen	Countess
Gamma irradiator	MDS Nordion	Gammacell 3000 Elan II
Insulin syringe	BD	324911
Powerlab	ADInstruments	Model 8/30
Slides scanning system	Leica biosystems	Aperio scanScope system
Sliding Microtome	Leica biosystems	RM2125RT
Stereomicrocope	Nikon	SMZ800
Tissue processing system	Leica biosystems	ASP200S
Wire myograph	DMT	610M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Softwares
Digital slide viewing software	Leica	Aperio ImageScope Version 12.3.2
Image J	NIH	Version 1.51e
Image processing software	Adobe	Photoshop CC Version 2015
Microscope imaging software	Carl Zeiss	AxioVision LE Version 4.7