JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن وصف بروتوكول ميكروديسيكشن التقاط ليزر استنساخه (LCM) لعزل trabecular ميشوورك (TM) لتحليل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات. القدرة على تحليل التغيرات في التعبير الجيني في TM سوف تساعد في فهم الآليات الجزيئية الكامنة لأمراض العين المتعلقة بالخرائط المواضيعية.

Abstract

ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) يسمح بتحليل التعبير الجيني للخلايا المفردة وأثرى السكان خلية في أقسام الأنسجة. LCM أداة عظيمة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تمايز الخلايا والتنمية والتقدم لمختلف الأمراض، بما في ذلك المياه الزرقاء. الزرق، التي تضم أسرة من اعتلالات الأعصاب البصرية التدريجي، السبب الأكثر شيوعاً للعمى لا رجعة فيها في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي زيادة الضغط داخل مقلة العين (IOP)، وعامل خطر رئيسي لتطوير الزرق التغييرات الهيكلية والأضرار داخل ميشوورك ترابيكولار (TM). ومع ذلك، هي لا تزال غير مفهومة الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك. القدرة على إجراء تحليل التعبير الجيني سيكون حاسما في الحصول على المزيد من رؤى في وظيفة هذه الخلايا ودورها في تنظيم التنمية IOP والزرق. لتحقيق هذا الهدف، إثراء أسلوب استنساخه لعزل عالية TM من المقاطع المجمدة عيون الماوس وطريقة لتحليل التعبير الجيني المتلقين للمعلومات، مثل كما هو مطلوب RT-قبكر وتسلسل الحمض النووي الريبي. تم تطوير الطريقة الموضحة هنا لعزل TM نقية جداً من عيون الماوس PCR المتلقين للمعلومات الرقمية وتحليل ميكرواري. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لعزل خلايا العين التخصيب والمقصورات الخلية التي كان من الصعب على عزل من عيون الماوس الأخرى. أن الجمع بين التحليل LCM والجيش الملكي النيبالي يمكن أن تسهم في فهم أكثر شمولاً للأحداث الخلوية الكامنة وراء الزرق.

Introduction

الزرق هو مجموعة من الأمراض التي تتميز باعتلال الأعصاب البصرية واعتلال الشبكية الذي يؤدي في النهاية إلى العمى لا رجعة فيه1،2. ومن المقدر أن يعيش قبل عام 2020 ما يزيد على 70 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع بعض أشكال المرض3،4،5،،من67. زاوية مفتوحة الابتدائي الزرق (باغ)، النوع الأكثر شيوعاً من الزرق، تتميز بانخفاض في التدفق المائي الفكاهة (AH) مما يؤدي إلى زيادة الضغط داخل مقلة العين (IOP)8،،من910، 11،13،،من121415،3،16،،من1718. غادر IOP غير المعالجة، وارتفاع مزمن يؤدي إلى الضرر التدريجي والذي لا رجعة فيه للشبكية والعصب البصري رئيس تسبب العمى شعاعي،1،2،19. جميع الأساليب الحالية لتباطؤ التقدم من الزرق التركيز على تخفيف IOP، أما عن طريق خفض معدل إنتاج AH بالجسم الهدبي أو تعزيز أنها تدفق1،،من89، 10 , 11 , 12 , 13 , 14-ميشوورك ترابيكولار (TM) يلعب دوراً حيويا في تنظيم نشاط في مسار تدفق آه الأولية ووظيفتها غير السليمة أحد عوامل مسببة لفرط ضغط الدم الزرق1،2،19. ومع ذلك، الآليات الجزيئية المرتبطة بخلل TM وكيف ينظم آه الصرف ليست بعد تماما مفهومة وحاليا محورا أساسيا الزرق البحوث1،2،19، 20-في حين ربطت العديد من الدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جوس) عددا من الجينات الزرق، وزيادة المقاومة لمرفق تدفق آه في TM، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تؤدي إلى المرض لم يفهم بعد تماما21 , 22 , 23 , 24 , 25.

نماذج حيوانية عززت إلى حد كبير معارفنا الحالية من تطور المرض في الزرق (استعراض على نطاق واسع في3،15،،من1626،،من2728، 29،،من3031،،من3233). تم وضع عدة طرق رائدة لدراسة ال35،،من34TM36 وقد استخدمت هذه الأساليب على نطاق واسع لتعزيز فهمنا الحالي للأنسجة المريضة وطبيعية. واحد المجالات التي لم تستكشف على نطاق واسع هو استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا دراسة الآليات الجزيئية لفشل TM. وقد تدق المعدلة وراثيا في والماوس المغلوب دراسات الجينات TM المرتبطين بها، مثل ميسلين (ميوك)37،38 و39من Cyp1b1، الأدوات الأساسية لدراسة الآليات الجزيئية للخرائط المواضيعية الدالة. ومن المفهوم أن حجم TM في الفئران الصغيرة يمثل عقبة خطيرة يجب التغلب عليها من أجل البدء بدراسة هذا النسيج. نماذج الماوس تمثل أداة قوية لدراسة علم الوراثة والآليات الجزيئية للمرض، بينما التقدم في تكنولوجيات LCM توفير الأدوات اللازمة لتمكين دراسة الأنسجة أصغر وأدق، بما في ذلك TM.

في هذا التقرير، يرد طريقة قوية واستنساخه ل LCM ل TM التخصيب من عيون الماوس جنبا إلى جنب مع عزل الحمض النووي الريبي اللاحقة، وتضخيم لتحليل التعبير المتلقين للمعلومات. أساليب مماثلة قد استخدمت بنجاح في الفئران لعزل أنواع أخرى من العين الأنسجة40،41،42،،من4344، ويمكن تطبيق المنهجية التي ذكرت هنا للآخر منفصلة من أنسجة العين لدراسة الحمض النووي الريبي، ميكرورنا والحمض النووي والبروتينات. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا لتحسين فهم الآلية المرضية الجزيئية للعاهات TM في الزرق، وأمراض العين3،،من1516،17 ،،من1826،31،،من4546. وستكون القدرة على عزل TM عيون الفأر من LCM تقنية مفيدة في الحصول على المزيد من رؤى في الآليات الجزيئية لعدة أمراض العين.

Protocol

رعاية الحيوان الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (نييهس) واستخدام اللجنة (أكوك) وافقت جميع منهجية هذه الدراسة تحت "إييدل اقتراح دراسة الحيوان نييهس" 05-46.

1-جمع الأنسجة الأمثل لليزر ميكروديسيكشن

  1. الحصول على 2 للفئران عمرها 3 أشهر، ذكرا كان أو أنثى C57BL/6. Euthanize مع CO2 لحد أدنى من 1 دقيقة أو حتى توقف التنفس. إزالة الحيوان من القفص وأؤكد الوفاة قبل خلع عنق الرحم أو قطع الرأس، أو ثوراكوتومي.
  2. قبل التشريح، تكفل جميع تشريح أدوات نظيفة ومعقمة.
    ملاحظة: لإزالة العيون منحنى المقص والملقط مع تلميح مسنن (يفضل حجم تلميح: 0.5 x 0.4 مم) ستكون هناك حاجة.
  3. تضع الماوس على سطح مستو في الجانب الخاص بها حيث أن العين يتم الوصول إليها بسهولة. فهم على كانثوس (زاوية العين) مع ملقط لتثبيت الماوس، ثم استخدام مقص منحنى، تواجه منحنى بعيداً عن العين، وقطع حول العين باستخدام محجر العين كدليل حتى يمكن بسهولة اتخاذ مقلة العين من مأخذ التوصيل (استخدام المنحنى لا نصائح المقص).
  4. اجذب، واستخدام مقص منحنى، قطع العصب البصري، الذي تصدر العين من مأخذ التوصيل المداري. بعناية إزالة أنسجة غير العين من العين والشطف في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). كرر 1.3-1.4 للعين كونترالاتيرال.
  5. لطخة العين مع مسح أنسجة لإزالة أي رطوبة قبل الدمج. مكان العين في عينة العفن (25 × 20 × 5 مم3) حتى العدسة والعصب البصري موازية لأعلى هيئة المحكمة بغية الحصول على أبواب السهمي. تضمين العيون في الأمثل خفض درجة الحرارة (O.C.T.) مجمع ومكان على الجليد الجاف لتجميد. بمجرد تجميد تخزين الكتل في-80 درجة مئوية.

2. إعداد القسم المجمدة لليزر ميكروديسيكشن

  1. قبل استخدام احتضان البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) غشاء الشرائح في كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية في الحد الأقصى من الطاقة لمدة 45 دقيقة.
  2. رش محلول تطهير رناسي على الفرشاة، الملقط، اقتران الجرار، وتصاعد تشاك. مسح شامل. شطف مع الماء خالية من نوكلاس والجافة. مسح أسفل كريوستات مع الإيثانول 100% لتجنب التلوث المتبادل.
  3. ضبط كريوستات إلى-18 درجة مئوية. إزالة كتلة واحدة المجمدة من الثلاجة-80 درجة مئوية في وقت واحد وتسليم إلى كريوستات مع الثلج الجاف. تسمح كتلة المجمدة حجته مع درجة حرارة كريوستات للحد أدنى من 10 دقيقة.
  4. الضغط على كمية صغيرة من O.C.T. على القطعة المتصاعدة (الشكل 1A) وإزالة كتلة الأنسجة من العفن بعناية وضع الكتلة في تصاعد تشاك (الشكل 1B). حالما يتم تجميد كتلة الأنسجة على تشاك متصاعدة صلبة، بإدراجه في صاحب العينة كريوستات (الشكل 2A).
  5. ضبط كريوستات قطع 8 ميكرومتر الفروع والفرع بعناية من خلال الكتلة O.C.T. للتوصل إلى عينة الأنسجة. حالما يتم ملاحظة الأنسجة، وقف تمزيقها وتقليم كتل مجمدة على جميع الجوانب باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وترك 3-4 مم O.C.T. في الأنسجة المحيطة لتمكين معالجة مع فرشاة الطلاء (الشكل 2). استخدام فرشاة طلاء نظيفة جديدة بدلاً من لوحة لفة بين كل تغيير العينة لتجنب التلوث عبر عينة.
  6. قسم عن طريق العين وتعمل بسرعة. وصمة عار وصمة عار كل القسم الثالث بسبب الفيضانات الشريحة باستخدام الهيماتوكسيلين خطوة واحدة سريعة وويوزين (H & E) 60 s، الشطف بماء الصنبور والهواء الجاف، واضحة في وكيل التخليص وجبل على شريحة زجاج مشحونة ساترة. عرض تحت المجهر، ويواصل تمزيقها حتى يتضح TM في أقسام قطع.
  7. حالما يبدأ TM لتظهر، قطع المقاطع 2 وجبل إلى شريحة زجاج مشحونة لروتين ح & ه تلطيخ لتشكيل خريطة للقطع مع LCM.
    ملاحظة: انظر القسم 3 للخريطة وتفاصيل المصبوغة.
  8. بعد أول ح & ه تعيين الشريحة، قص وحتى 6 أقسام سميكة المسلسل 8-ميكرومتر في كريوستات خط وفي نفس الوقت جبل على شريحة غشاء الحيوانات الأليفة (الشكل 3 أ، ب). التقيد الأنسجة بإيجاز انزلاق القفاز الإبهام على طول الجزء الخلفي الغشاء. بعد التركيب، ضع الشريحة غشاء الحيوانات الأليفة فورا إلى مربع الانزلاق على الثلج الجاف.
    ملاحظة: قد شنت أقسام أقل، ومع ذلك، ينصح تركيب أقسام متعددة على الشريحة في وقت واحد للحد من تدهور الجيش النيبالي الملكي بقصر المدة الزمنية التي يتعرض لها كل قسم في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
  9. يواصل الفرع العين، بعد كل شريحتين غشاء الحيوانات الأليفة مع كل 6 أقسام، جمع قسمين على شريحة زجاج مشحونة إنشاء شريحة خريطة أخرى لتلطيخ ح & ه. يواصل تمزيقها، حوالي 100 ميكرومتر 8 المسلسل سميكة المقاطع، حتى لم يعد مرئياً TM. تأكيد تلطيخ بسرعة مقطع واحد على شريحة زجاج مشحونة (انظر 2.6).
  10. تخزين كافة الشرائح غشاء الحيوانات الأليفة في-80 درجة مئوية لاستخدامها LCM لاحقاً.

3-ح & ه خريطة الشريحة تلطيخ البروتوكول واستعراض الخصائص المورفولوجية

  1. تصور واستعراض الشرائح خريطة على الشرائح الزجاجية المشحونة، إصلاح الأنسجة بنقل فورا إلى جرة المصبوغة شغلها مع 100 مل من تحديد الحل السريع شطف س. 7 الشريحة بالغمس في ماء مقطر 10-20 مرات ، ثم بنقل الشريحة إلى جرة اقتران مع الماء المقطر نظيفة.
  2. إزالة الشريحة من المياه ولطخة الحواف الجافة مع مسح الأنسجة. ماصة 200 ميليلتر تعديل تصفية هاريس توضع على كل قسم، واحتضان لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. أشطف بعناية الشريحة تحت حنفية الماء الجاري حتى يتم تشغيل المياه واضحة. لطخة نهاية الشريحة مع مسح أنسجة بين كل خطوة (وصمة عار بين كل خطوة من 3.2 إلى 3.5) لإزالة السائل الزائد.
  3. مكان الشريحة في برنامج تلفزيوني 1 x في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. ثم أشطف بعناية الشريحة تحت إدارة مياه الحنفية لمدة 30 ثانية.
  4. تراجع الشريحة 3-4 مرات في حمام الإيثانول 95%. تطبيق حل صبغ ويوزين Y ما يكفي لتغطية الأنسجة على الشريحة واحتضان لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  5. شطف الشريحة في مرتين مع 10-20 سريعة الانخفاضات كل حمام الإيثانول 95%. شطف الشريحة في مرتين مع 10-20 سريعة الانخفاضات كل حمام الإيثانول 100%. ثم شطف الشريحة مرتين في حمام زيلين نفط (10-20 سريعة الانخفاضات كل).
  6. جبل بتطبيق المتوسطة التركيب راتنجية للأنسجة، وإضافة ساترة بعناية لتجنب فقاعات الهواء وأتركها تجف في هود بين عشية وضحاها.
  7. استعراض الشرائح ح & ه بصريا أو باستخدام ماسح ضوئي شرائح رقمية. تحديد الشرائح خريطة مع TM مرئية بوضوح وموجودا لعدة قطاعات. استخدام الحيوانات الأليفة خريطة الشرائح غشاء بين هذه الشرائح ل LCM.

4-البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) غشاء الشرائح المصبوغة والمعالجة البروتوكول

  1. قبل إزالة الشرائح الحيوانات الأليفة من الثلاجة أولاً إعداد حل كريسيل البنفسجي الأسهم بتذويب 0.3 g البنفسجي كريسيل خلات في 20 مل إيثانول 75% ووضع على شاكر ل 2 حاء تصفية الحل مع 0.22 ميكرومتر وحدة تصفية العقيمة ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة لا من 6 مون ths.
  2. إعداد حل ويوزين Y الكحولية مع الطازجة الإيثانول 75% بنسبة 1:4. إعداد وتثبيت (الإيثانول 75%)، وحلول الجفاف (الإيثانول 95%، 75% و 100%) في أنابيب البولي بروبلين المخروطية نظيفة وخالية من نوكلياسي، 50 مل على الجليد. إضافة "رناسي مثبط" لكل حل.
  3. إزالة مربع الشريحة التي تحتوي على مقاطع الأنسجة المجمدة من الثلاجة-80 درجة مئوية ووضعه على الثلج الجاف. عملية شريحة واحدة في المرة. تحديد الشرائح عن طريق وضع الشريحة فورا إلى إيثانول 75% الباردة لمدة 30 ثانية.
  4. وتراجع بلطف الشريحة في المياه خالية من نوكلاس عن 10-15 ثانية حل O.C.T. دون أن تتدخل مع أقسام الأنسجة.
  5. "الماصة؛" 300 ميليلتر من 1.5% كريسيل خلات البنفسجي الحل مباشرة على المقاطع بعناية واحتضان ل 45 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل مرة واحدة بوضعه في حمام الإيثانول 75% عن 30 س. ماصة 200 ميليلتر ويوزين Y الحل على المقاطع واحتضانها ل s 3-5.
  6. يذوي الأنسجة عن طريق وضع الشريحة في وقت لاحق في الإيثانول 75%، الإيثانول 95%، وأخيراً، حمام الإيثانول 100% لمدة 30 ثانية كل. لطخة نهاية الشريحة مع مسح أنسجة بين كل خطوة لإزالة السائل الزائد. واسمحوا الهواء الشريحة جاف تماما تحت غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق. وبمجرد جفاف، أداء LCM بعد ذلك على الفور.
    ملاحظة: من المستحسن تجنب استخدام زيلين نفط لهذه الخطوة، فإنه يمكن أن يسبب أقسام الأنسجة السندات غير كافية للشريحة الغشاء ويقلل من كفاءة التقاط الأنسجة.

5-ليزر ميكروديسيكشن مع الليزر الأشعة فوق البنفسجية

  1. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر والسماح للتمهيد. قم بتشغيل إمدادات الطاقة الضوء الأبيض المجهر. قم بتشغيل المفتاح الليزر الأشعة فوق البنفسجية وأصفر سوف يضيء مصباح LED. بدء تشغيل البرنامج LCM، السماح سيتم عرض لتحميل كامل وفيديو حية. اضغط على زر الليزر في المربع وحدة التحكم وسوف تضيء الصمام خضراء.
  2. تحميل شريحة زجاج جديد على خشبة المسرح المجهر، ثم ضع الشريحة غشاء الحيوانات الأليفة مع الجانب النسيج الملون أسفل مباشرة على الجزء العلوي من الشريحة الزجاجية. تأكد من الغشاء والشريحة الزجاجية يتم إقران مشددة على المسرح المجهر.
  3. LCM ابدأ بأول تعيين حدود الشريحة. اختر 4 أدنى X التكبير في لوحة موضوعية (الشكل 4). قم بتعريف مساحة العمل من الشريحة الغشاء بتحريك مجاهر xy-المرحلة حتى الزاوية اليسرى العليا التي تلتقي فيها المعادن والغشاء مرئياً في شريط الفيديو لايف آر، اضغط الزر "حد 1" ومستطيل أحمر سوف تظهر على خارطة الطريق. بعد ذلك، الانتقال إلى المرحلة-س وص للركن المقابل واضغط على الزر "تحديد 2". اضغط على الزر "مسح" لإنشاء صورة خارطة طريق بالأغشية والأنسجة بين حدود تعيين.
  4. انقر نقراً مزدوجاً فوق قرب TM لأحد أقسام العين ضمن خارطة الطريق، TM يمكن أن يقع بالقرب من قمة الزاوية إيريدوكورنيل (الشكل 5A). مرة واحدة وقد تم تحديد TM، قم بزيادة التكبير إلى 10 X والتركيز على TM يدوياً. كرر مع 20 X و 40 س الأهداف. عندما TM في التركيز بهدف X 40 (الشكل 5B)، انتقل إلى مساحة فارغة القريبة (التركيز قد تحتاج إلى تعديل طفيف)، حدد "أداة الرسم اليدوي الحر"، ورسم خط طويل على منطقة فارغة من الأنسجة.
  5. تعيين المعلمات الليزر حيث هو "سرعة قطع" 34% "التركيز" هو 58% و "السلطة" هي 70% (الشكل 4)، ثم اضغط على الزر "قص". إجراء تعديلات الليزر غرامة على السرعة والتركيز، ومعلمات السلطة حتى يتم ملاحظة خط قطع واضحة ودقيقة (انظر الشكل 5). لقطع دقيقة، وضمان عمل القطع يلي السطر مرسومة.
  6. تحميل غطاء أنبوب العزلة في حامل كاب وفتح الأنبوب. إرفاق صاحب كاب كاب-المصعد وتأكد من الأنبوب هو مقلوب. أؤكد أن مادة لاصقة كاب يبرز خارج غيض من هذا الغطاء لضمان أن يتم التقاط النسيج المطلوب بشكل صحيح.
  7. حدد وضع "دليل" تشريح في لوحة البرنامج. تستعرض بعناية أن TM (الشكل 5B) مباشرة أسفل الأنبوبة العزلة. ضبط توازن اللون الأبيض، وضبط السطوع للحصول على جودة الصورة المثلى (الشكل 4).
  8. للبدء في قطع وضبط التركيز يدوياً ورسم خط باستخدام أداة يدوية، تأكد من أن يظل سقف جمع في الموضع لم لمس الغشاء. رسم الدوائر الجزئية القريبة حيث يلتقي TM الصلبة (الشكل 5)، ثم اضغط "قص". حالما تتم التخفيضات الأولى، ضع الغطاء في الموضع إلى الأسفل وإعادة ضبط التركيز، ثم رسم خطين في الفضاء المفتوح أو مجاناً للاتصال اثنين من الدوائر الجزئية إكمال الدائرة حول TM، ثم اضغط "قص" وجمع الأنسجة من قسم ، ضمان أن TM التقطت كاب ميكروديسيكشن (الشكل 5 د-F).
  9. ضع الغطاء مرة أخرى إلى الموضع وكرر (5.2-5.8) على الأقسام المتبقية. ضبط الموضع كاب قليلاً حتى جميع العينات المعزولة سوف تناسب على عملية النداءات الموحدة وعدم تداخل (الشكل 5). للاتساق، هو الإطار الزمني لشريحة واحدة 20 دقيقة استخدام المقاطع أقل للحيوان الأليف الشريحة إذا كان يلزم مزيد من الوقت لعزل TM من جميع الأقسام. للغشاء الحيوانات الأليفة القادمة، إدراج أنبوب عزلة جديدة وتكرار المقطع 5.

6-تحلل الأنسجة TM ميكروديسيكتيد

  1. إعداد طازجة العازلة تحلل الحمض النووي الريبي للأنسجة LCM معزولة. إضافة 10 ميليلتر β-ميركابتوثانول لكل 1 مل من تحلل المخزن المؤقت. تخزين المخزن المؤقت تحلل مع β-ميركابتوثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد على شهر واحد.
  2. إزالة أنبوب العزلة من غطاء حامل خلال 20 دقيقة من بداية ميكروديسيكشن. تصور سطح غطاء العين لضمان القبض على TM.
  3. بدقة "الماصة؛" 10 ميليلتر تحلل العازلة على غطاء أنبوب جمع تأمين المخزن المؤقت تحلل تماما يغطي ميكروديسيكتيد TM. بلطف بإغلاق غطاء لاصق واحتضان أنبوب جمع رأسا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة، الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 2 دقيقة ثم ضع ليستي على الثلج الجاف. تخزين ليساتيس في-80 درجة مئوية لتنقية وتحليل لاحق.

7-الجيش الملكي النيبالي العزلة وتحليل لنوعية

  1. تحليل نوعية الجيش الملكي النيبالي بتذويب العينات في درجة حرارة الغرفة. تجمع معا جميع العينات المعزولة من ماوس واحدة إلى 1.5 مل رناسي خالية واحدة [ميكروفوج] أنابيب.
    ملاحظة: على سبيل المثال، لكل تكرار البيولوجية، 10-12 أنابيب مع قبعات ميكروديسيكتيد في 10 ميليلتر ليساتي تم إنشاؤها وتم نقل جميع ليساتيس في أنبوب واحد لكل تكرار البيولوجية (100-120 ميليلتر ليساتي).
  2. إضافة وحدة تخزين واحدة طازجة الإيثانول 70% (أدلى بمياه خالية من رناسي) لكل حل ليستي. ثم تنقية الحمض النووي الريبي مجموع اتباع إرشادات المستخدم عدة عزل الحمض النووي الريبي. ضمان التخلص من الحمض النووي من كل عينة من الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: الحمض النووي يمكن أن تتداخل مع تحليل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات.
  3. قياس نوعية الحمض النووي الريبي معزولة عن TM بتجميع عينات من كل الماوس وتحليل الحمض النووي الريبي الريباسي السلامة (الشكل 6A).
    ملاحظة: نظراً لصغر حجم TM، قمم الرنا الريباسي قد لا يمكن ملاحظته (الشكل 6B) على التشكيل الجانبي نوعية الحمض النووي الريبي (قمم اثنين بين شركة بريتيش بتروليوم 1,000-4,000 في الشكل 6 أ، ج) الذي يستخدم لحساب عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) 47.
    1. الحصول على مقياس أكثر دقة لسلامة الجيش الملكي النيبالي بعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة المتبقية أكثر وفرة في الشريحة الغشاء. للحصول على ممثل رين، وعزل الحمض النووي الريبي من العين-الأنسجة على الشريحة غشاء بيبيتينج 10 ميليلتر تحلل المخزن المؤقت على قسم واحد من الأنسجة وأداء عزل الحمض النووي الريبي. تحليل الحمض النووي الريبي الجودة وحساب رين (الشكل 6).
  4. طلبات الجيش الملكي النيبالي المصب، معزولة استخدام نتائج مجموعة الحمض النووي الريبي إدخال منخفضة لجيل مكتبة التسلسل وكدنا أن تسفر عن استنساخه من أقسام 80 أقل قدر من LCM TM.

8-تحليل

  1. للتحقق من أن الأنسجة التي تم جمعها في الواقع هو إثراء في الجينات المرتبطة بالخرائط المواضيعية، جمع الحمض النووي الريبي إضافية متعددة من ميكروديسيكتيد العين كله والصلبة والقزحية، الشبكية، والقرنية والعدسة من الفئران منفصلة 3. استخدام هذا الجيش الملكي النيبالي في تركيبة مع LCM جمعت الجيش الملكي النيبالي من عزل TM وهيئة الهدبية التي تم جمعها من 4 الفئران منفصلة.
  2. تحويل الجيش الملكي النيبالي من عينات ميكروديسيكتيد وكان استخدام مجموعة نسخ عكسي كدنا كدنا. تضخيم الحمض النووي الريبي من عينات LCM معزولة وتحويل باستخدام أحد مدخلات منخفضا الحمض النووي الريبي طقم كدنا كدنا.
  3. تحليل جميع الجيش الملكي النيبالي ل trabecular ميشوورك التعبير عن الجينات، ميوسيلين (ميوك) وألفا-أكتين-2 (ACTA2)، وتطبيع استخدام الجينات HSP90a1 التدبير المنزلي ببكر الرقمية (الشكل 7 أ-ب).

النتائج

LCM جمعت الجيش الملكي النيبالي من TM والجسم الهدبي من الفئران مختلفة 4 معزولة من أجل أن تكون قادرة على تحليل التعبير الجيني ومقارنة التعبير مع ذلك في العين كلها والصلبة والقزحية، الشبكية، والقرنية والعدسة المعزولة من الفئران منفصلة ثلاثة. TM التعبير عن الجينات، ميوك

Discussion

TM يلعب دوراً حيويا في الحفاظ على نشاط IOP التماثل الساكن وبه خلل مقبول على نطاق واسع كالعامل الرئيسي المسبّب لارتفاع ضغط الدم الزرق1،2،19. قد تم ربط عدد من النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة في عدة جينات حددها تحليل جوس الزرق زيادة ال...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)BioRad10031252FAM
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kitAgilent Technologies5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR SystemBioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope SlideThermo scientific4951PLUS-001
Cresyl Violet AcetateSigma AldrichC5042
Curved Scissors
Eosin Y dyeThermo scientific71204
Ethanol
ForcepsCurved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCenAmerican MasterTechSTHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)BioRad10031255VEX
Leica CM1850 CryostatLeica
Millex-GS filter unitEMD MilliporeSLGS033SB0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting ModelMolecular Machines & IndustriesLCM intrument
MMI CellTools SoftwareMolecular Machines & Industries50202LCM software
Sample Tube for Laser Capture MicrodisssectionASEE ProductsST-LMD-M-500Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)Molecular Machines & Industries
modified Harris HematoxylinThermo scientific7211FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)BioRad10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase FreeASEE ProductsFS-LMD-M-50rPolyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)Molecular Machines & Industries50102
Rapid FixThermo scientific6764212H&E staining
RLT BufferQiagen79216lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZapSigmaR2020RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse InhibitorSigma AldrichR7397
RNeasy Micro KitQiagen74004RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA KitTakara Clontech634888low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP)BioRad1863023digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Stratalinker UV CrosslinkerStratagene400075
XyleneMacron8668

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 LCM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved