JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור microdissection לכידה לייזר לשחזור (LCM) לבידוד meshwork trabecular (TM) לניתוח RNA במורד הזרם. היכולת לנתח שינויים בביטוי הגנים ב ה-TM יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מחלות עינית הקשורות TM.

Abstract

לייזר לכידת microdissection (LCM) מותר ניתוח ביטוי גנטי של תאים בודדים, מועשר תא אוכלוסיות בסעיפים רקמות. LCM הוא כלי נהדר עבור חקר המנגנונים המולקולריים שבבסיס תאית התמיינות ואת פיתוח ההתקדמות של מחלות שונות, כולל גלאוקומה. גלאוקומה, אשר כוללת משפחה של מחלות עצבים אופטית מתקדמת, היא הסיבה השכיחה ביותר לעיוורון בלתי הפיך ברחבי העולם. שינויים מבניים ונזק בתוך meshwork trabecular (TM) יכול לגרום לחץ תוך-עיני מוגבר (IOP), המהווה גורם סיכון עיקרי לפתח גלאוקומה. עם זאת, המנגנון המולקולרי מדויק מעורבים הם הבינו עדיין כהלכה. היכולת לבצע ניתוח ביטוי גנטי תהיה מכרעת בהשגת עוד תובנות הפונקציה של תאים אלה ותפקידו בוויסות IOP ופיתוח גלאוקומה. כדי להשיג זאת, שיטה ישימה עבור בידוד גבוהה מועשר TM ממקטעים קפוא של העכבר ואת שיטת ניתוח ביטוי גנטי במורד הזרם, כגון RT-qPCR ו- RNA-Seq נדרש. השיטה המתוארת במסמך זה מפותח כדי לבודד TM מאוד טהור עיניים העכבר PCR דיגיטלי במורד הזרם וניתוח microarray. בנוסף, טכניקה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של תאים עינית מועשר אחרים, עבורן תא היה קשה לבודד מעיני העכבר. השילוב של הפונקציה LCM וניתוח RNA יכול לתרום להבנה מקיפה יותר של האירועים הסלולר שבבסיס גלאוקומה.

Introduction

גלאוקומה היא קבוצה של מחלות המאופיינת נוירופתיה אופטית, רטינופתיה שמוביל בסופו של דבר לעיוורון בלתי הפיך1,2. ההערכה היא כי על ידי 2020 נגמר אגור 70 מיליון אנשים ברחבי העולם עם צורה כלשהי של המחלה3,4,5,6,7. ראשי פתוח גלאוקומה (POAG), הסוג הנפוץ ביותר של גלאוקומה, מאופיינת בירידת יצוא aqueous הומור (AH) שמוביל מוגברת לחץ תוך-עיני (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. IOP אינה מטופלת כראוי, באופן כרוני מוגברות השמאלי מוביל לנזק הדרגתיים ובלתי הפיכים הרשתית ואת ראש עצב הראייה גרימת עיוורון רדיאלי1,2,19. כל השיטות הקיימות עבור להאט את ההתקדמות של גלאוקומה דגש על צמצום IOP, או על ידי הפחתת קצב הייצור של AH על ידי הגוף ריסי או שיפור זה תזרים1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. meshwork trabecular (TM) ממלא תפקיד חיוני בוויסות באופן פעיל את השביל הראשי של יצוא AH אשר תפקידה לא תקין הוא גורם סיבתי עבור לחץ דם גבוה גלאוקומה1,2,19. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הקשורים בתפקוד TM איך זה מווסת AH ניקוז אינם עדיין לגמרי מובנים, נמצא כעת והמוקד העיקרי של גלאוקומה מחקר1,2,19, 20. בזמן הגנום כולו האגודה מספר מחקרים (GWAS) יש מקושרים מספר גנים גלאוקומה, עמידות מוגברת למתקן יצוא AH-ה-TM, המנגנונים המולקולריים המדויק להוביל המחלה אינם עוד מובן במלואו21 , 22 , 23 , 24 , 25.

מודלים בעלי חיים יש שיפור משמעותי שלנו הידע הנוכחי של התקדמות המחלה ב גלאוקומה (בהרחבה שבתוך3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). פותחו מספר שיטות חלוצית ללמוד TM34,35,36 , שיטות אלה היה בשימוש נרחב כדי לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של רקמה נורמלית וחולים. תחום אחד כי לא היה חקר בהרחבה הוא השימוש של מודלים מהונדס גנטית עכבר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של כשל TM. הטרנסגניים טוק-in ו העכבר מעלף מחקרים של גנים TM הקשורים, כגון Myocilin (Myoc)37,38 , Cyp1b139, כבר הכלים הראשי עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של TM פונקציה. מובן, גודל קטן של ה-TM בעכברים מייצג משוכה רצינית שחייבים להכריעו על מנת להתחיל ללמוד הרקמה הזאת. העכבר דגמים מייצגים כלי רב עוצמה עבור ללמוד את הגנטיקה ואת המנגנונים המולקולריים של המחלה, כאשר ההתקדמות בטכנולוגיות LCM לספק את הכלים הדרושים כדי להעצים את המחקר של הרקמות הקטן ביותר ועדינים ביותר, כולל ה-TM.

בדו ח זה, מתוארת שיטה לשחזור ועמיד עבור LCM של TM מועשר מעיני העכבר יחד עם עוקבות בידוד RNA ו הגברה לניתוח ביטוי במורד הזרם. שיטות דומות שימשו בהצלחה בעכברים כדי לבודד סוגים אחרים של העין רקמות40,41,42,43,44, המתודולוגיה דיווח בזאת ניתן ליישם את השני רקמות דיסקרטית של העין ללמוד RNA, microRNA, DNA, חלבונים. חשוב לציין, טכניקה זו מאפשרת את השימוש עכברים מהונדסים כדי להבין טוב יותר בפתוגנזה מולקולרית של ליקוי TM גלאוקומה, מחלה עינית3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. היכולת לבודד את ה-TM של העכבר עיניים על ידי אופנת LCM יהיה טכניקה שימושית בהשגת עוד תובנות המנגנונים המולקולריים של מספר מחלות עינית.

Protocol

הלאומית המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) אישר כל מתודולוגיה של מחקר זה תחת NIEHS החיה ללמוד את ההצעה IIDL 05-46.

1. אוסף רקמה אופטימלית עבור לייזר Microdissection

  1. להשיג 2 לעכברים בת 3 חודשים, זכר או נקבה C57BL/6. המתת חסד עם CO2 למשך תקופה מינימלית של 1 דקות או עד להפסקת נשימה. הסר את החיה לכלוב ולהבטיח מוות על-ידי נקע צוואר, עריפת ראש, או ניקור חזה.
  2. לפני ניתוח, לוודא שכל כלי חיתוך פשוטים ונקיים מעוקר.
    הערה: עבור הסרת העיניים מעוקל מספריים וחדים עם קצה משונן (העדיפו גודל קצה: 0.5 x 0.4 מ מ) יהיה צורך.
  3. הנח את העכבר על משטח שטוח על צידה כך העין הינו נגיש בקלות. להתפס על canthus (בפינה של העין) עם המלקחיים לייצב את העכבר, ואז בעזרת המספריים מעוקל, מול העיקול מן העין, חתך סביב העין באמצעות ארובת העין כמדריך עד גלגל העין יכול להילקח בקלות מהשקע (השתמש העקומה לא טיפים של המספריים).
  4. משוך בעדינות וחותכים, בעזרת המספריים מעוקל, עצב הראייה, אשר משחרר את העין מהשקע מסלולית. הסר בזהירות את הרקמה הלא-העינים מן העין שטיפה 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). חזור על 1.3-1.4 עבור העין contralateral.
  5. כתם העין עם מגבון רקמות להסרת לחות לפני הטבעה. המקום העין לתוך הדגימה עובש (25 x 20 x 5 מ מ3) כך העדשה ואת עצב הראייה מקבילים לפסגה ספסל על מנת לקבל חלקים הווריד. להטביע את העיניים ב אופטימלית חיתוך טמפרטורה (O.C.T.) מתחם ומניחים על הקרח היבש להקפיא. לאחר קפוא, אחסן את רחובות ב-80 מעלות צלזיוס.

2. סעיף. מוקפאים הכנה לייזר Microdissection

  1. לפני השימוש דגירה פוליאתילן terephthalate (PET) ממברנה שקופיות ב- UV מחדש בעוצמה מקסימלית למשך 45 דקות.
  2. תרסיס RNase פתרון טיהור על המברשת, מלקחיים, צימוד צנצנות, והרכבה צ'אק. נגב ביסודיות. לשטוף עם מים ללא נוקלאז ויבש. לנקות את cryostat עם אתנול 100% כדי למנוע זיהום צולב.
  3. להתאים את cryostat ל-18 מעלות צלזיוס. להסיר אחת בלוק קפוא במקפיא-80 ° C בכל פעם ולספק cryostat עם קרח יבש. לאפשר בלוק קפוא equilibrate עם הטמפרטורה של cryostat למשך תקופה מינימלית של 10 דקות.
  4. מחצי כמות קטנה של O.C.T. על גבי גוש הרכבה (איור 1 א'), להסיר את גוש רקמות העובש ומניחים בזהירות את הבלוק על הצ'אק הרכבה (איור 1B). לאחר הרחוב רקמות על הרכבה הצ'אק קפואה, להוסיף על גבי הדגימה האוחז cryostat (איור 2 א).
  5. להתאים את cryostat כדי לחתוך סעיפים 8 מיקרומטר, סעיף בזהירות דרך הרחוב O.C.T. להגיע דגימת הרקמות. ברגע הרקמה נצפית, להפסיק חלוקתה, לקצץ את רחובות קפוא מכל הצדדים באמצעות סכין גילוח נקי ומשאירים 3-4 מ מ O.C.T. את הרקמה שמסביב כדי לאפשר טיפול עם מברשת צבע (איור 2B). השתמש מכחול נקי חדש במקום הצלחת לגלגל בין כל שינוי הדגימה כדי למנוע זיהום צולב את הדגימה.
  6. חתך דרך העין עובדת במהירות. הכתם בכל החלק השלישי על ידי הצפה של השקופית עם hematoxylin בשלב אחד מהיר, אאוזין (H & E) כתם 60 s, לשטוף עם מים מהברז, אוויר יבש, ברור בסוכן סליקה והר על משטח זכוכית טעון עם coverslip. הצג תחת המיקרוסקופ ולהמשיך חלוקתה עד ה-TM מתבטא בסעיפים לחתוך.
  7. לאחר ה-TM מתחיל להופיע, לחתוך 2 סעיפים והר על זכוכית טעונה עבור השגרה H & E מכתים כדי ליצור מפה לצורך חיתוך עם הפונקציה LCM.
    הערה: ראה סעיף 3 מפה ופרטים מוכתמים.
  8. אחרי הראשון H & E למפות שקופיות, לחתוך, בשורה 6 מקטעים בעובי 8-מיקרומטר טורי cryostat והר בו זמנית על גבי השקופית ממברנה PET (איור 3 א, ב'). דבקים הרקמה על ידי הזזה בקצרה בכפפה האגודל לאורך הגב של הקרום. לאחר הרכבה, מקם את השקופית ממברנה חיית המחמד ישר לתוך תיבת שקופיות על קרח יבש.
    הערה: סעיפים פחות עשוי להיות מותקן, עם זאת, הרכבה מספר מקטעים אותן לשקופית בבת אחת מומלץ להפחית RNA השפלה על-ידי הגבלת משך הזמן שכל חלק חשוף לאוויר בטמפרטורת החדר.
  9. המשך סעיף העין, אחרי כל שתי שקופיות ממברנה של PET עם 6 מקטעים, לאסוף שני קטעים על משטח זכוכית טעון כדי ליצור מפה לשקופית אחרת עבור H & E מכתים. המשך חלוקתה, כ 100 8 סדרתי-מיקרומטר עבה מקטעים, עד TM אינה גלויה. אשר על-ידי במהירות מכתים מקטע אחד על משטח זכוכית טעון (2.6 רואה).
  10. אחסן את כל השקופיות ממברנה PET ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש LCM מאוחר יותר.

3. H & E מפה לשקופית מכתים פרוטוקול וסקירה מורפולוגי

  1. כדי להמחיש ולסקור את מפת השקופיות בשקופיות זכוכית טעונה, תיקון הרקמה על ידי העברת מיד לתוך צנצנת מכתימים מלא עם 100 מ של הפתרון תיקון מהיר עבור שטיפה ס' 7 השקופית בטבילת זה לתוך מים מזוקקים 10 - 20 פעמים , ואז להעביר את השקופית צנצנת צימוד עם מים מזוקקים נקיים.
  2. הסר את השקופית של מים, כתם יבש בקצוות עם טישו לנגב. פיפטה 200 µL ששינה מסונן האריס Hematoxylin על כל סעיף, תקופת דגירה של 30 s בטמפרטורת החדר. לשטוף היטב השקופית תחת ברז מים זורמים עד המים זורמים ברורה. כתם בסוף השקופית עם מגבון רקמות בין שלב לשלב (חשופה בין שלב לשלב מ- 3.2-3.5) כדי להסיר את עודפי הנוזלים.
  3. המקום שקופיות ב- 1 x PBS בטמפרטורת החדר במשך 30 s. לאחר מכן, לשטוף בקפידה השקופית תחת ברז מים ל 30 s.
  4. טובלים את השקופית 3 - 4 פעמים לתוך אמבט אתנול 95%. להחיל פתרון לצבוע מספיק אאוזין Y מכסה את הרקמה בשקופית, תקופת דגירה של 15 s בטמפרטורת החדר.
  5. יש לשטוף את השקופית באמבטיה אתנול 95% פעמיים עם 10-20 מהיר מטבלים בכל. יש לשטוף את השקופית באמבטיה אתנול 100% פעמיים עם 10-20 מהיר מטבלים בכל. לאחר מכן, לשטוף שקופית פעמיים באמבטיה קסילן (10-20 מהיר מטבלים כל).
  6. טעינה על-ידי החלת שרפי הרכבה בינונית הרקמה, להוסיף coverslip בקפידה כדי למנוע בועות אוויר והנח לו להתייבש בשכונה בין לילה.
  7. סקירה H & E שקופיות באופן חזותי או באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי. לזהות מפה שקופיות עם TM בבירור לגלוי ונגיש לחיתוך. להשתמש את חיית המחמד ממברנה שקופיות בין אלה למפות שקופיות עבור הפונקציה LCM.

4. פוליאתילן Terephthalate (PET) ממברנה שקופיות פרוטוקול עיבוד וצביעת

  1. לפני הסרת שקופיות חיית המחמד מן המקפיא קודם להכין cresyl, ויולט פתרון מניות על ידי המסת אצטט cresyl, ויולט 0.3 g ב- 20 מ של 75% אתנול ומניחים על גבי שייקרס עבור 2 ח' מסנן הפתרון עם יחידת מסנן סטרילי מיקרומטר וחנות 0.22 ב 4 ° C לא יותר מאשר 6 ב' ths.
  2. להכין אאוזין Y בתמיסה אלכוהולית עם אתנול טריים 75% ביחס של 1:4. להכין קיבעון (75% אתנול) ופתרונות התייבשות (75%, 95% & 100% אתנול) נקי, נטול נוקלאז, 50 מ ל חרוט צינורות פוליפרופילן על קרח. להוסיף RNase המדכא כל פתרון.
  3. הסר את תיבת שקופיות המכילה רקמות קפוא קטעים מ-80 מעלות צלזיוס מקפיא ומניחים אותו על קרח יבש. תהליך שקופית אחת בזמן. לתקן את השקופיות על-ידי הצבת השקופית מיד אל תוך קר 75% אתנול ל 30 s.
  4. בעדינות לטבול את השקופית במים נטולי נוקלאז למשך 10-15 s כדי להמיס O.C.T. ללא הפרעה עם הסעיפים רקמות.
  5. פיפטה 300 µL של 1.5% cresyl סגול אצטט פתרון ישירות על הסעיפים ובזהירות תקופת דגירה של 45 s בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף פעם אחת על-ידי הצבתו לאמבט אתנול 75% לפתרון 30 ס' 200 פיפטה µL אאוזין Y על הסעיפים, תקופת דגירה של 3-5 s.
  6. מייבשים רקמות על-ידי הצבת לשקופית ולאחר מכן ב 75% אתנול, 95% אתנול, ואמבט בסופו של דבר, 100% אתנול ל 30 s כל. כתם בסוף השקופית עם מגבון רקמות בין כל שלב כדי להסיר עודפי נוזלים. תנו לאוויר שקופית להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע למשך 5 דקות. ברגע יבש, לבצע LCM מייד לאחריו.
    הערה: מומלץ להימנע משימוש של קסילן בשלב זה, היא עלולה לגרום מקטעי רקמת להתחבר כראוי אל השקופית ממברנה, מפחית את היעילות של רקמות לכידת.

5. לייזר Microdissection עם לייזר UV

  1. הפעל את המחשב ולאפשר לאתחול. הפעל את אספקת החשמל אור לבן מיקרוסקופ. הפעל את מפתח לייזר UV ואת צהוב LED דולקת. להפעיל את התוכנה LCM, לאפשר זה לטעון באופן מלא ווידאו חי יציג. לחץ על התיבה בקר לחצן לייזר, נורית LED ירוקה דולקת.
  2. לטעון שקופית זכוכית חדשה לבמה מיקרוסקופ ולאחר מכן מקם את השקופית ממברנה חיית המחמד עם הצד רקמות מוכתם כלפי מטה ישירות על השקופית זכוכית. ודא שאת הקרום והחלק זכוכית משויכים בחוזקה על הבמה מיקרוסקופ.
  3. LCM התחל על-ידי הראשון הגדרת הגבולות לשקופיות. לבחור את 4 הנמוך X ההגדלה בחלונית ' ' אובייקטיבית (איור 4). ואז מגדירים את אזור העבודה של השקופית קרום על-ידי הזזת מיקרוסקופים xy-הבמה עד לפינה השמאלית העליונה שבו נפגשים מתכת, ממברנה מוצגת בוידאו חי להאכיל, הקש על לחצן "מגבלת 1" מלבן אדום יופיעו על הדרכים. בשלב הבא, לעבור xy-הבמה לכיוון הפינה הנגדית, לחץ על לחצן "הגבלת 2". לחץ על הכפתור "סרוק" כדי ליצור תמונה של מפת הדרכים של קרום ורקמות בין קביעת מגבלות.
  4. לחץ פעמיים על יד ה-TM של אחד המקטעים העין בתוך הדרכים, ה-TM יכול להיות ממוקם ליד קדקוד הזווית iridocorneal (איור 5A). לאחר ה-TM זוהתה, להגדיל את רמת ההגדלה 10 X וצוות באופן ידני ה-TM. חזור עם 20 X ויעדים X 40. כאשר ה-TM בפוקוס עם המטרה X 40 (איור 5B), לנווט לתוך אזור ריק סמוך (המוקד ייתכן שיהיה עליך להתאימם במקצת), בחר את "כלי ציור ביד חופשית", לצייר קו ארוך על אזור ריק של רקמות.
  5. להגדיר את הפרמטרים לייזר כך "המהירות לחתוך" הוא 34%, "פוקוס" הוא 58% ו- "כוח" 70% (איור 4), ואז לחץ על הלחצן "קאט". לבצע התאמות לייזר בסדר מהירות, מיקוד ופרמטרים כוח עד קו חיתוך ברור וקנס נצפית (ראה איור 5C). לחיתוך מדויק, ודא חיתוך פעולה עוקב אחר קו שצויר.
  6. טען את המכסה צינור בידוד בעל כיפה ופתח הצינור. לצרף את קאפ-מחזיק למעלית קאפ וודא כי הצינור היא הפוכה. מבטיח כי החומר דבק כיפה בולטת מעבר לקצה המכסה כדי להבטיח כי הרקמה הרצויה נלכד כראוי.
  7. בחר את מצב לנתיחה "ידני" בחלונית ' תוכנה '. בעיון זה ה-TM (איור 5B) ישירות מתחת צינור בידוד. להגדיר את האיזון הלבן וכוונן את הבהירות לרכוש איכות מיטבית (איור 4).
  8. כדי להתחיל לחתוך, ידנית להתאים את המוקד, לצייר קו באמצעות הכלי ביד חופשית, ודא כי הכיפה אוסף נשאר במצב למעלה עדיין לא לגעת הקרום. לצייר עיגולים חלקית ליד שם ה-TM פוגש את sclera (איור 5C), ואז הקש "חתוך" ברגע הראשון החתכים נעשים, מקם את הכובע לתוך מטה, מחדש להתאים את המוקד ולאחר מכן לצייר שני קווים בחלל פתוח או חינם כדי לחבר את שני העיגולים חלקית משלים את המעגל סביב ה-TM, ולאחר מכן הקש "חתוך" ולאסוף את רקמת מהסעיף , ודא כי ה-TM נאסף על ידי הכיפה microdissection (איור 5 D-F).
  9. מקם את הכובע בחזרה למצב למעלה וחזור (5.2-5.8) על הסעיפים הנותרים. מעט לכוונן את מיקום הכובע כך כל הדגימות מבודד להתאים אל הכיפה, אינם חופפים (איור 5G). עקביות, חלון הזמן עבור שקופית אחת היא 20 הגבלת שימוש בסעיפים פחות לחיית מחמד להחליק אם עוד פעם יש צורך לבידוד TM של כל המקטעים. עבור ממברנה חיית המחמד הבאה, הכנס צינור בידוד וחזור על סעיף 5.

6. פירוק רקמת TM Microdissected

  1. טרי להכין מאגר פירוק RNA ל lyse LCM מבודד רקמות. להוסיף 10 µL β-mercaptoethanol לכל 1 מ"ל של המאגר פירוק. אחסן את המאגר פירוק עם β-mercaptoethanol בטמפרטורת החדר במשך חודש לא יותר.
  2. הסר את צינור בידוד מחזיק כובע בתוך 20 דקות מתחילת microdissection. דמיינו השטח כובע לפי העין כדי להבטיח לכידת TM.
  3. בזהירות פיפטה 10 מאגר פירוק µL על גבי המכסה של הצינור אוסף הבטחת המאגר פירוק מכסה לחלוטין את microdissected TM. בעדינות לסגור מכסה דבק, דגירה אוסף שפופרת הפוך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר דגירה, צנטריפוגה ב g x 800 למשך 2 דקות ומניחים lysate על קרח יבש. חנות lysates ב-80 מעלות צלזיוס טיהור וניתוח מאוחר יותר.

7. RNA בידוד וניתוח של איכות

  1. לנתח את איכות ה-RNA ידי מפשיר דגימות בטמפרטורת החדר. בריכת יחד כל דוגמאות מבודד עכבר אחת לתוך נטולת RNase שפופרת microfuge של 1.5 mL אחת.
    הערה: לדוגמה, עבור כל שכפול ביולוגי, 10-12 צינורות עם כמוסות microdissected ב 10 µL lysate נוצרו, lysates כל הועברו לתוך צינור יחיד עבור כל שכפול ביולוגי (100-120 µL lysate).
  2. להוסיף אמצעי אחסון אחד של אתנול 70% טריות (עשוי במים נטולי RNase) כל פתרון lysate. לאחר מכן, לטהר RNA סה כ לבצע את ההנחיות משתמש RNA ערכת בידוד. ודא את ההסרה של DNA גנומי כל מדגם ה-RNA.
    הערה: הדנ א הגנומי יכול להתערב עם ניתוח RNA במורד הזרם.
  3. מודדים את האיכות של RNA מבודד מן ה-TM על ידי איגוד יחד דגימות העכבר כל וניתוח תקינות ribosomal RNA (איור 6A).
    הערה: בשל גודלו הקטן של ה-TM, פסגות ribosomal RNA לא יהיה נצפות (איור 6B) בפרופיל איכות RNA (שתי פסגות שנצפה בין 1000-4000 bp ב 6A איור, ג) אשר משמש כדי לחשב את המספר שלמות של RNA (RIN) 47.
    1. להשיג מדד מדויק יותר של RNA שלמות על-ידי בידוד RNA מתוך הרקמה הנותרת שופע יותר בשקופית ממברנה. כדי להשיג נציג רין, RNA ולבודד מן הרקמה העינים בשקופית הממברנה על ידי pipetting 10 µL פירוק מאגר לתוך מקטע אחד רקמות ולבצע בידוד ה-RNA. לנתח איכות RNA ולחשב רין (איור 6C).
  4. ליישומים RNA במורד הזרם, שימוש ערכת ה-RNA קלט נמוך לדור ספריית רצף ו- cDNA להניב לשחזור נובעת מעט ככל 80 קטעים של הפונקציה LCM מבודדים TM.

8. ניתוח

  1. כדי לוודא כי הרקמה שנאספו למעשה מועשר גנים הקשורים TM, לאסוף RNA נוספות מרובות לעין כל microdissected בסקלרה, איריס, רשתית, קרנית, עדשה של 3 עכברים נפרדים. שימוש זה RNA בשילוב עם הפונקציה LCM שנאספו RNA מ מבודדים TM וגוף ciliary שנאסף 4 עכברים נפרדים.
  2. המר שהרנ א בין דגימות microdissected היה cDNA באמצעות ערכת cDNA שעתוק במהופך. להגביר את הרנ א מדגימות LCM מבודדים, להמיר cDNA באמצעות קלט נמוך רנ א cDNA לקיט.
  3. לנתח כל RNA על ביטוי גנים, myocilin (MYOC) ואלפא-אקטין-2 (ACTA2), meshwork trabecular, לנרמל באמצעות הגן משק HSP90a1 על ידי ה-PCR דיגיטלי (איור 7 א-ב).

תוצאות

LCM שנאסף RNA ה-TM, גוף ריסי בלבד עכברים שונים 4 היה מבודד כדי להיות מסוגל לנתח ביטוי גנים ולהשוות את הביטוי עם זה בעין כל בסקלרה, איריס, רשתית, קרנית, עדשה מבודד שלושה עכברים נפרדים. TM ביטוי הגנים, MYOC48 ו ACTA249 נותחו על כל רקמות שנאספו כדי לאשר כי...

Discussion

ה-TM ממלא תפקיד חיוני בשמירה באופן פעיל homeostatic IOP, תפקוד שלה מקובל כגורם סיבתי מרכזי עבור לחץ דם גבוה גלאוקומה1,2,19. מספר של נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים מספר גנים המזוהה על-ידי ניתוח GWAS היה קשור בסיכון מוגבר גלאוקומה עמידות מוגברת למתקן יצו?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)BioRad10031252FAM
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kitAgilent Technologies5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR SystemBioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope SlideThermo scientific4951PLUS-001
Cresyl Violet AcetateSigma AldrichC5042
Curved Scissors
Eosin Y dyeThermo scientific71204
Ethanol
ForcepsCurved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCenAmerican MasterTechSTHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)BioRad10031255VEX
Leica CM1850 CryostatLeica
Millex-GS filter unitEMD MilliporeSLGS033SB0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting ModelMolecular Machines & IndustriesLCM intrument
MMI CellTools SoftwareMolecular Machines & Industries50202LCM software
Sample Tube for Laser Capture MicrodisssectionASEE ProductsST-LMD-M-500Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)Molecular Machines & Industries
modified Harris HematoxylinThermo scientific7211FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)BioRad10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase FreeASEE ProductsFS-LMD-M-50rPolyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)Molecular Machines & Industries50102
Rapid FixThermo scientific6764212H&E staining
RLT BufferQiagen79216lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZapSigmaR2020RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse InhibitorSigma AldrichR7397
RNeasy Micro KitQiagen74004RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA KitTakara Clontech634888low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP)BioRad1863023digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Stratalinker UV CrosslinkerStratagene400075
XyleneMacron8668

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136trabecular meshworkmicrodissectionmicrodissectionRNALCMLMD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved