JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتوليد الأنسولين معربا عن بانكريتويدس مورين 3D من التعويم الحر e10.5 نات المتكفل البنكرياس و mesenchyme المرتبطة بها.

Abstract

البنكرياس هو جهاز معقد يتألف من العديد من أنواع الخلايا المختلفة التي تعمل معا لتنظيم التوازن جلوكوز الدم والهضم. تتضمن هذه الأنواع خلية إفراز إنزيم الخلايا أسينار، نظام الأقنية أربوريزيد مسؤولة عن نقل الإنزيمات بخلايا الأمعاء، وإنتاج هرمون الغدد الصماء.

خلايا بيتا الغدد الصماء هي نوع الخلايا الوحيدة في الجسم التي تنتج الأنسولين إلى انخفاض مستويات الجلوكوز في الدم. مرض السكري، وهو مرض يتسم بفقدان أو اختلال وظيفي في خلايا بيتا، أبعادا وبائية. وبالتالي، من الضروري وضع بروتوكولات للتحقيق في تطوير خلايا بيتا التي يمكن استخدامها لأغراض الفرز لاشتقاق المخدرات والمداواة يستند إلى الخلية. بينما التحقيق التجريبي لتطوير الماوس أساسي، في فيفو الدراسات شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. الخلايا المستزرعة توفر منصة أكثر ملاءمة للفحص؛ ومع ذلك، فغير قادر على الحفاظ على تنوع الخلوية ومنظمة المعمارية، والتفاعلات الخلوية العثور على في المجراة. ولذلك، من الضروري استحداث أدوات جديدة للتحقيق في أورجانوجينيسيس البنكرياس وعلم وظائف الأعضاء.

تطوير البنكرياس الخلايا الظهارية في ارتباط وثيق مع ميسينتشيمي من بداية أورجانوجينيسيس كخلايا تنظيم وتفرق في الجهاز الكبار المعقدة، والناحية الفسيولوجية المختصة. ميسينتشيمي البنكرياس يوفر إشارات هامة لتنمية الغدد الصماء، كثير منها ليست مفهومة جيدا حتى الآن، وبالتالي يصعب أن الخص خلال الثقافة في المختبر . هنا، نحن تصف وضع بروتوكول للثقافة أورجانويدس الماوس معقدة ثلاثية الأبعاد، والخلوية التي تحتفظ ميسينتشيمي، يسمى بانكريتويدس. برعم البنكرياس مورين e10.5 تشريح، وفصلها، ومثقف في بيئة خالية من السقالة. هذه الخلايا العائمة تجميع ذاتي مع mesenchyme تخيم بانكريتويد النامية وعدد قوية من خلايا بيتا الغدد الصماء النامية جنبا إلى جنب مع خلايا مجرى الهواء وفي أسينار. يمكن استخدام هذا النظام لدراسة التفاعلات خلية خلية خلية تحديد مصير والتنظيم الهيكلي و morphogenesis، أثناء أورجانوجينيسيس، أو للمخدرات أو جزيء صغير، أو الفحص الوراثي.

Introduction

تحديد آليات التطور الطبيعي والفسيولوجيا أمر بالغ الأهمية لفهم مسببات المرض وغرس أساليب العلاج في نهاية المطاف. حين استزراع والتفريق بين الخلايا الجذعية تمكن التحليل السريع والفائق للتنمية، فإنه مقيد بالهيئة الحالية للمعرفة فيما يتعلق بالآليات التي تنظم مصير الخلية ومصطنع ويجمل التنمية في نسبيا الدولة متجانس، ثنائي الأبعاد1،2. في فيفو التنمية تتأثر التأثيرات الخارجية، مع أنواع مختلفة من الخلايا في مكانة والوسط تقدم إشارات باراكريني والدعم التنظيمي لتوجيه أورجانوجينيسيس، بل ووظيفة هذه الخلايا يعتمد أيضا على ما المناطق المحيطة بها للإرشاد3،،من45. ونظرا لأهمية هذه الإشارات الخارجية، والقيود المفروضة على بروتوكولات التمايز، وطبيعة شاقة في فيفو نماذج الماوس، يلزم نظم جديدة للتحقيق تجريبيا في العمليات الإنمائية الأساسية وعلم وظائف الأعضاء.

ظهور البروتوكولات لتوليد أورجانويدس ثلاثي الأبعاد والمعقدة توفر نظام مريحة والمنسجمة لدراسة علم وظائف الأعضاء وفعالية المخدرات، أورجانوجينيسيس والمرضية حتى. إنشاء موريني أورجانويدس لأنظمة مختلفة مثل6 والأمعاء المعدة7 توسيع فهمنا أورجانوجينيسيس، وتوفير أداة لدراسة التعقيدات الإنمائية مع قيود أقل من فيفو ونماذج في المختبر . نظراً لأوجه التقدم هذه في أورجانويد مورين تشكيل وظهور pluripotent البشرية الجذعية الكلي10،11، الشبكية9خلايا، المعوية البشرية8، وتم إنتاج أورجانويدس الدماغي12 ، وهذا مرجع ممارسات مجلس الأمن يقتصر فقط بالمعارف القائمة بشأن آليات التنمية.

أهمية خاصة هو جيل أورجانويدس البنكرياس، كما أن عددا كبيرا من الأمراض يصيب أنواع مختلفة من خلايا البنكرياس، بما في ذلك الخلايا أسينار والقنوات في قصور إفرازات البنكرياس13، خلايا acinar في البنكرياس14، و خلايا بيتا في15من مرض السكري. اكتساب المعارف المتعلقة بتطوير هذه الأنواع المختلفة من الخلية يمكن أن تساعد في فهم هذه الأمراض ويمكن، أيضا، بمثابة منصة لفحص المخدرات شخصية أو زرع الأعضاء. سابقا، جريجيو et al. وضعت طريقة لإنشاء أورجانويدس البنكرياس مورين أن الخص في فيفو morphogenesis وتطوير هياكل المنظمة وثلاثية الأبعاد ومعقدة تتألف من جميع الخلايا الظهارية البنكرياس أنواع16،17. هذا خطوة رئيسية إلى الأمام في مجال البنكرياس، خلايا خاصة صنع في المختبر يمكن تمكين التحقيق البيولوجي لتطوير خلايا بيتا. ومع ذلك، شكلت ندرة خلايا الغدد الصماء في هذا البروتوكول إلا أورجانويدس تم زرع الأنسجة، حيث يمكن أن تتفاعل المكانة وتقديم العظة التعليمية17. Mesenchyme تشكل الجزء الأكبر من المكانة، بشدة تخيم ظهارة النامي من المراحل المبكرة من أورجانوجينيسيس إلى مراحل لاحقة، بما في ذلك تنسل الأطراف الغدد الصماء والتمايز3،4، 18. التفاعل بين ميسينتشيمي البنكرياس النامية مثال آخر الإشارات الخارجية وأهمية الحفاظ على تعقيد الخلوية في فيفو بدراسة أورجانوجينيسيس.

هنا، نحن تصف كيفية توليد ثلاثي الأبعاد أورجانويدس البنكرياس، يسمى بانكريتويدس، من أجداد البنكرياس مورين e10.5 منفصلان. هذه بانكريتويدس الاحتفاظ mesenchyme الأصلية وتجميع ذاتي في شروط التعويم الحر، وتوليد جميع أنواع الخلايا البنكرياس الرئيسية، بما في ذلك عدد قوية من خلايا بيتا الغدد الصماء19. وهذا النهج الأنسب لتحليل التنمية الغدد الصماء، والبروتوكولات السابقة تفتقر إلى التمايز الغدد الصماء قوية. ومع ذلك، استخدام البروتوكول للبنكرياس أورجانويدس كما وصفها جريجيو et al. أكثر ملاءمة لتحليل المتفرعة الظهارية البنكرياس و morphogenesis، كالتفريع هو محدودة أكثر في بانكريتويدس.

Protocol

وافق جميع التجارب على الحيوانات ووصف في هذا الأسلوب برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة من كلية بايلور للطب.

1-إعداد الماوس الجنينية اليوم 10.5 المتكفل البنكرياس

ملاحظة: هذا البروتوكول لا يلزم اتباعها تحت ظروف معقمة حتى الخطوة 2، إلا أنه لا زال المثلى تعقيم أدوات التشريح، ورذاذ مع الإيثانول 70% قبل استخدامها.

  1. لإعداد للتشريح وملء دلو الجليد ومكان حاوية للفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في الجليد. تنظيف اثنين الملقط الجميلة ذات الرؤوس ومقص التشريح مع الإيثانول 70%. يقع بالقرب من منطقة التشريح، حاوية مع ثلاثة على الأقل البورسليكات الشعرية أنابيب، فم ماصة، أخف، وتصفية 1,000 نصائح ماصة ميليلتر.
    1. إعداد على الأقل 1 مل من 1.25 ملغ/مل ديسباسي الباردة المخفف في الماء المعقم ومكان في البئر الثانية من 12 لوحة جيدا على الجليد. وضع برنامج تلفزيوني في الأول والثالث، والرابع الآبار 12 لوحة جيدا. 1 مكان مل من 0.05% أنبوب التربسين 1.5 مل على الجليد. قبل الحارة حاضنة هز إلى 37 ياجيم
  2. Euthanize e10.5 الفئران الحوامل في الوقت المناسب وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك. رذاذ في البطن مع الإيثانول 70% تنظيف المنطقة قبل إجراء شق على شكل V في منطقة الأعضاء التناسلية من الماوس باستخدام مقص وملقط ويستمر ذلك حتى الحجاب الحاجز.
    ملاحظة: يشير مظهر المكونات المهبلي في هذا البروتوكول إلى اليوم 0.5. 5-الفئران عمرها 6 في الأسبوع، باستخدام أعمال زيادة وزن أكثر من 2 جرام كتدبير ثانوي من التلقيح الناجح.
    1. عناية المكوس الرحم بإجراء شق في أجزاء الأفقي العلوي من الرحم، وسحب الجهاز إلى أعلى بعيداً عن الماوس، وفي أعقاب هذا الشق وصولاً إلى منطقة الأعضاء التناسلية قبل تكرار على الجانب الآخر. ضعه في 10 سم طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني الباردة.
      ملاحظة: من الممكن الحصول على أورجانويدس من e11.5 فصل الخلايا، لكن خلافا بانكريتويدس e10.5، أورجانويدس هذه لا تتسم حتى الآن، ومما لا يجوز الاحتفاظ بالقدرة على التمييز في جميع الأنساب البنكرياس الرئيسية الثلاثة.
  3. تحت مجهر تشريح خفيفة، ضع طبق بيتري وفتح أنسجة الرحم بعناية بوضع الملقط اثنين بين كل الأجنة وتقشير الأنسجة بعيداً عن كيس ألمح. نقل الأجنة باستيعاب الكيس صفار البيض بلطف مع الملقط ومكان في 10 سم طبق بيتري مع الطازجة، برنامج تلفزيوني الباردة. ضع طبق بيتري على الجليد.
    ملاحظة: من المهم إزالة هيدفولي الأجنة، يفضل الاحتفاظ داخل كيس ألمح، كما إزالة قوية يمكن سحب الحبل السري، تمزيق أنسجة الجنين والمساس بالسلامة الهيكلية.
  4. وضع متعددة برنامج تلفزيوني قطرات على غطاء صحن بيتري 10 سم. استخدام هذه القطرات لنقل الجنين أثناء تشريح كما تتم إزالة الأنسجة اكسترامبريونيك لضمان وضوح الرؤية. نقل جنين إلى هبوط برنامج تلفزيوني وإزالة بلطف من كيس ألمح باستخدام الملقط، بينما تبقى الأجنة المتبقية في برنامج تلفزيوني على الجليد (الشكل 1أ). إزالة الرأس قبل نقل الجنين إلى هبوط برنامج تلفزيوني جديد باستخدام الملقط باستخفاف حلج القطن الجنين، لعدم الأضرار الأنسجة (الشكل 1ب).
    ملاحظة: قد تحتاج الأنسجة ستنقل أكثر تواترا إلى قطيرات برنامج تلفزيوني جديد من الموصوفة هنا، اعتماداً على عتامة السائل.
    1. هبوط برنامج تلفزيوني جديد، قم بإزالة البراعم فوريليمب باستخدام الملقط (الشكل 1ب). ضع الملقط في فتح حيث حضر براعم أطرافهم ولطف تمزق الأنسجة الخارجية الأكثر فقط الأسفل (الشكل 1ب). تدوير الجنين وكرر في الاتجاه الخلفي، وقف في مهدها اللكتات. عند هذه النقطة، ينبغي أن يكون الجهاز الهضمي مرئية (الشكل 1ب).
    2. المنطقة الخلفية للجهاز الهضمي قد منحنى طفيف (الشكل 1F). إدراج الملقط وراء هذا منعطف في الافتتاح بين منطقة العمود الفقري لجدار الجسم والجهاز الهضمي. فصل الجهاز الهضمي، يعمل ببطء صعودا حتى يتم التوصل إلى المنطقة الأكثر الأمامي حيث يربط منطقة القلب (الشكل 1ب-E).
      اختياري: إزالة قلب البدائية وبراعم الكبد من مناطق البطني في الجهاز الهضمي، تاركة أنبوب الأمعاء المستمر فقط. في المرات القليلة الأولى التي يتم تنفيذ هذا البروتوكول قد يكون أسهل لترك القلب والكبد كما معالم البطني حتى مورفولوجية الجهاز الهضمي وبرعم البنكرياس الظهرية أكثر دراية (الشكل 1ج ود ).
    3. نقل الجهاز الهضمي إلى الحبرية برنامج تلفزيوني جديد.
    4. تأخذ الملقط ولطف قرصه الأنسجة تحت برعم بارزة والأمعاء ورفع قليلاً النسيج الخارجي قبالة (الشكل 1د-F).
      ملاحظة: برعم البنكرياس الظهرية يقع بين المعدة والأمعاء (الشكل 1ج-ز). يجب أن تشبه برعم البنكرياس تحت هيكل عقدي جولة (الشكل 1ز).
    5. ضع ملقط حيث يربط المهد إلى الأمعاء وقرصة التصاعدي لتخفيف البرعم (الشكل 1ز). أغسل مرة واحدة في فقاعة برنامج تلفزيوني جديد قبل نقل البرعم في البئر الأولى من 12 لوحة جيدا في برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد. كرر حتى يتم جمعها من الأجنة براعم جميع ووضعها في البئر الأولى من 12 لوحة جيدا.
  5. ضع الطبق جيدا 12 تحت مجهر تشريح الخفيفة. حساب عدد براعم البنكرياس تشريح بنجاح لحساب نسبة الانقسام في وقت لاحق.
    1. مكان مصفاة 1,000 ميليلتر ماصة تلميح إلى ماصة فم مع أنبوب شعري المرفقة. لهب تعقيم الأنبوبة الشعرية وإنشاء منحنى في الأنبوب لسهولة الاستخدام. استخدام شعري نقل البراعم إلى الحل الثاني تحتوي أيضا على ديسباسي الباردة لمدة 2 دقيقة قبل نقل إلى البئر الثالثة مع برنامج تلفزيوني نظيفة (الشكل 1ز).
      ملاحظة: في حين نقل البراعم من ديسباسي إلى برنامج تلفزيوني، تجنب لمس الأنسجة إلى طرف الأنبوبة الشعرية. إذا كان يحصل عالقاً في الأنسجة في طرف الأنبوب، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً أو هزة في حل برنامج تلفزيوني نظيف حتى خففت.
    2. "الماصة؛" براعم صعودا وهبوطاً، ونقل إلى البئر الرابعة مع برنامج تلفزيوني نظيفة. وأخيراً، استخدام نقل الجهاز الشعرية براعم إلى أنبوب 1.5 مل مع 0.05% التربسين. ضع الأنبوبة في شاكر 37 سج المعالجون مسبقاً ويهز في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 4 دقائق.
    3. دوامة لما يقرب من 10 s ثم فورا وضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي وتدور لمدة 5 دقائق في 200 غ. إزالة كل شيء ولكن حوالي 50 ميليلتر من الحل الحذر فيما يتعلق بعدم الإزعاج الخلايا سينتريفوجيد (الشكل 1ز).

2-استزراع المتكفل معزولة شكل بانكريتويدس

ملاحظة: التالية ينبغي إجراء في جو عقيم في غطاء زراعة الأنسجة قياسية، باستخدام إجراءات عقيمة القياسية.

  1. لكل برعم المجمعة، إضافة 400 ميليلتر organogenesis وسائل الإعلام16،17 (الجدول 1) إلى الخلايا سينتريفوجيد. نبض دوامة ثلاث مرات وكذلك لوحة لوحة 100 ميليلتر الواحدة وكذلك إرفاق منخفضا 96، تقسيم البراعم بنسبة 1:4 (الشكل 1ز).
  2. الاختيار تحت المجهر لتصور فصل الخلايا بحرية عائمة (الشكل 1ح). ضع الطبق الثقافة في حاضنة 37 سج مع 5% CO2 في الروك بسرعة متوسطة.
  3. رصد التقدم المحرز في بانكريتويدس يوميا. استبدال مع 100 ميليلتر من وسائط جديدة كل 3 أيام، وسائل الإعلام بيبيتينج بعناية تحت رقابة مجهرية في غطاء محرك السيارة لإزالة مع ترك بانكريتويد في البئر. بدلاً من ذلك، يمكن إضافة ميليلتر 100 جديدة من وسائل الإعلام إلى بئر جديدة ونقلها باستخدام بانكريتويد الأنبوبة الشعرية البورسليكات تعلق بالفم ماصة و 1000 ميليلتر تصفية نصيحة ماصة.

3-المعالجة بانكريتويدس للتصوير إيمونوفلوريسسينت

  1. أن عملية بانكريتويدس للصور إيمونوفلوريسسينت، أولاً بإعداد 4% بارافورمالدهيد/برنامج تلفزيوني، حل pH7.4 (منهاج عمل بيجين). ضع ميليلتر 50% 4 منهاج عمل بيجين في آبار 96 لوحة جيدا.
    1. استخدام أنابيب البورسليكات الشعرية والفم ماصة مع طرف ماصة المصفاة 1,000 ميليلتر، نقل بانكريتويدس من الثقافة المتوسطة مراعاة البئر الطازجة بنسبة 4 في المائة أقل من وسائل الإعلام قدر الإمكان منهاج عمل بيجين. تعيين على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. نقل بانكريتويدس من 4% روك منهاج عمل بيجين في بئر مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني جديد، في درجة حرارة الغرفة لأدنى 5-10 تكرار لمجموعة من ثلاثة يغسل برنامج تلفزيوني جديد.
      ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا، مع بانكريتويدس المخزنة في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في 4 سج لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  2. للتصوير ووليماونت (أوصى إذا الأجسام المضادة نهج بديلة مناسبة في القسم 3.3. والفحص المجهري في 3-4-)، نقل من برنامج تلفزيوني في 50 ميليلتر حمار 5% مصل في برنامج تلفزيوني 1 x مع المنظفات النطاق 0.1% (ببست) إلى كتلة. صخرة بين عشية وضحاها في 4 سج أو كبديل ح 4 في درجة حرارة الغرفة.
    1. نقل بانكريتويدس إلى بئر جديدة تحتوي على الأجسام المضادة الأساسي المخفف في 50 ميليلتر من المصل حمار 5% في 1 x PBST. على النحو الأمثل، من الصخور ح 24 في 4 سج (على الأقل 12 ح بل تصل إلى 36 ساعة).
      ملاحظة: الأجسام المضادة المدرجة في الجدول للمواد ضد شجا (1: 100) وديسيبل (1: 400)، فيم (1: 400)، Pdx1 (1: 100) هي مناسبة لتلطيخ ووليماونت؛ أجسام أخرى قد تتطلب التحسين.
    2. نقل بانكريتويدس إلى بئر تحتوي على 100 ميليلتر من ببست جديدة لغسل والصخور لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة لما مجموعة ثلاث يغسل ببست الطازجة.
    3. نقل بانكريتويدس إلى بئر جديدة تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 50 ميليلتر من المصل حمار 5% في 1 x PBST. حماية اللوحة من الضوء والمكان في 4 سج، هزاز لأمثل 24 ساعة (على الأقل 12 ح بل تصل إلى 36 ساعة).
      ملاحظة: جميع الأجسام المضادة الثانوية المذكورة في كونتيرستين النووية الجدول للمواد و DAPI مناسبة لتلطيخ ووليماونت.
    4. نقل بانكريتويدس إلى بئر جديدة تحتوي على 100 ميليلتر من 1 × ببست والصخور في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 30 تكرار لمجموعة من يغسل ثلاث في 1 x PBST. في الغسيل الثالثة والنهائية، بإضافة 300 نانومتر DAPI.
    5. وأخيراً، ضع في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ومخزن في 4 سج محمية من الضوء لتصل إلى أسبوع قبل التصوير بالفحص المجهري [كنفوكل]، على الرغم من أن أفضل النتائج تأتي من التصوير مباشرة بعد تلطيخ نظيفة. لمنع حركة بانكريتويدس أثناء التصوير ولكن منع الجفاف، ضع كل بانكريتويد إلى معالجة تجميعية 20 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. إذا كانت لا تزال لا تزال بانكريتويدس، تقليل حجم برنامج تلفزيوني.
  3. للمقاطع المجمدة، نقل بانكريتويدس من برنامج تلفزيوني في محلول السكروز 30% بين عشية وضحاها في 4 ياجيم
    1. إضافة وسائط التضمين في فقاعة تحت مجهر تشريح. استخدام الملقط تحت رقابة مجهرية، نقع بانكريتويدس عن طريق دفع من خلال وسائط الإعلام التضمين بلطف عدة مرات لإزالة السكروز المتبقية قبل نقل إلى كتلة أنسجة مع وسائل الإعلام التضمين المجمدة.
    2. وضع كتلة الأنسجة على الثلج الجاف حتى المجمدة والقسم على كريوستات في 8 ميكرومتر.
      ملاحظة: الأقسام يمكن تخزينها في سج-80 أو إيمونوستينيد فورا.
    3. يسمح بوجود مقاطع من-80 سج لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تقريبا حتى الجاف. رسم حاجزاً مسعور استخدام القلم pap مسعور حول الأنسجة وكتلة باستخدام 5% حمار المصل المخفف في 1 x PBST لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بإزالة الوسائط واستبدالها فورا مع الأجسام المضادة الأساسي المخفف في المصل حمار 5% المخفف في x 1 ببست بين عشية وضحاها في 4 ياجيم
    5. إزالة الحل الأساسي وتغسل الأنسجة ثلاث مرات مع 1 x PBST لمدة 10 دقائق. وفي أعقاب ذلك، إضافة حل جسم الثانوي المخفف في المصل حمار 5% المخفف في 1 x PBST ح 1 في درجة حرارة الغرفة وحماية الشرائح من الضوء.
    6. إزالة الحل الثانوي وتغسل شرائح ثلاث مرات في 1 x PBST لمدة 10 دقائق. في الغسيل النهائي، إضافة 300 نانومتر DAPI.
    7. قم بإزالة الوسائط وإضافة وسائل الإعلام المتزايدة وساترة. تخزين الشرائح بعيداً عن الضوء في 4 سج حتى جاهزة الصورة.

4-عزل الحمض النووي الريبي من بانكريتويدس لتحليل نص

  1. جمع بانكريتويدس استخدام البورسليكات الشعرية المرفقة إلى ماصة فم مع تلميح ماصة ميليلتر 1,000 التي تمت تصفيتها للعقم ومكان إلى 500 ميليلتر من حمض جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم الحل في أنبوب 1.5 مل. تخزين في-80 سج أو الشروع فورا في عزل الحمض النووي الريبي.
  2. لعزل الحمض النووي الريبي، إذابة العينات في الثلج إذا لزم الأمر وإضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم. دوامة جيدا والمكان في 4 سج عن 15 دقيقة قبل كول من أجهزة الطرد مركزي إلى 4 سجيم
    1. ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي وتدور لمدة 20 دقيقة في 12,000 ز في 4 ياجيم
    2. بعناية إزالة أنابيب عدم الإزعاج الفصل بين الطبقات. استخدام 200 ميليلتر ماصة، جمع المحلول واضحة ووضع في أنبوب 1.5 مل جديدة، مخلفين وراءهم كمية صغيرة إلى المخزن المؤقت من طبقة البروتين الأبيض والوردي طبقة الحمض النووي. لا تلمس طرف الماصة لأي شيء في هذه العملية ولا تلمس جدران الأنبوب 1.5 مل.
    3. إضافة 500 ميليلتر من الايزوبروبانول 100% للأنبوب الجديد الذي يتضمن الطبقة المائية ودوامه. السماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، أطول على الجليد، أو إجازة هطول الأمطار القصوى بين عشية وضحاها في-20 ياجيم
    4. الطرد المركزي في ز 12,000 لمدة 15 دقيقة في 4 سج لبيليه الجيش الملكي النيبالي. إزالة رأسا دون إزعاج بيليه.
      ملاحظة: كما بانكريتويدس الصغيرة، فمن المحتمل بيليه لن تكون مرئية.
    5. إضافة الباردة، 75% إيثانول وعكس الأنبوبة عدة مرات. في أجهزة الطرد المركزي وتدور في 9,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 سإزالة جيم الإيثانول وتدور لمدة 2 دقيقة في 9,000 س ز.
    6. استخدام ماصة 200 ميليلتر لإزالة أي الإيثانول المتبقية في الأنبوب، دون الاتصال بمنطقة يتواجد بيليه في. ترك الغطاء مفتوحة على أنبوب لمدة 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لضمان تبخر الإيثانول المتبقية.
    7. ريسوسبيند بيليه في طريق فورتيكسينج في 20 ميليلتر من مياه نظيفة وخالية من نوكلاس.
      اختياري: الحرارة الجيش الملكي النيبالي في 65 سج لمدة 3 دقائق وعلى الفور العودة إلى الجليد. يمكن تخزينها في ج-80 سرنا أو استخدامها فورا للنسخ العكسي و qPCR.

النتائج

تشريح دقيق لاجنة الفأر في e10.5 من القرن الأفريقي الرحم ينبغي أن تسفر عن الأجنة غير التالفة في برنامج تلفزيوني لمواصلة تشريح (الشكل 1أ). يمكن إزالة الجهاز الهضمي كفاءة من الجنين (الشكل 1ب)، تسمح بتمييز برعم البنكرياس الظهرية...

Discussion

تطور نماذج ثقافة الخلية أمر بالغ الأهمية لتطوير النموذج بشكل صحيح، إنتاج أنواع الخلايا ذات الصلة سريرياً أو اختبار المخدرات فعالية زرع حتى للمرضى. بيد مصطنع أتصدى التنمية في طبق تتحدى كما أننا لا نزال بعيدين عن فهم آليات organogenesis وفسيولوجيا المجراة في. وهكذا الخلايا في المختبر ال...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر جولانتا تشميلوويك لمناقشة مفيدة بشأن البروتوكول والمخطوطة. ونشكر أيضا بنيامين أرينكيل للوصول إلى مجهر [كنفوكل]. هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة (P30-DK079638 إلى M.B.) و T32HL092332-13 إلى ماس و M.B.، ومؤسسة طبية ماكنير (إلى م)، والأساسية [كنفوكل] في مركز أبحاث العاهات الخلقية والفكرية بليون متر مكعب (المعاهد الوطنية للصحة U54 HD083092 من أونيس كينيدي شريفر المعهد الوطني للطفل الصحة والتنمية البشرية).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary PipettesSigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free waterThermoFisherD119
Borosilicate Capillary TubesSutter InstrumentsGB1007515O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2Sigma-AldrichC5080
Cell-Repellent 96-Well MicroplateGreiner Bio-One650970U-bottom
Centrifuge 5424 REppendorf5401000013
ChloroformSigma-Aldrich233306
Chromogranin-A antibodyAbcamab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60Leica
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10310
Countess Cell Counter SlidesInvitrogenC10312
CryoStar NX70ThermoFisher957000L
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride)Roche10 236 276 001Powder
DBA antibodyVector LabRL-1032
Dispase II, PowderGibco17105041
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-100.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor)Sigma-AldrichE9644
Ethanol, 200 ProofDecon Laboratories2716
Forma Steri Cycle CO2 IncubatorsThermoFisher370
Fluoromount-GSouthern BiotechOB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 AntibodySanta Cruz BioTechnologysc-271408Polyclonal Mouse IgG
IsopropanolFishera4164
Isothesia Isoflurane, USPHenry Schein11695-6776-2
Insulin AntibodyDakoA056401Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST UniversalKAPA BiosystemsKK4618
KClKaryoMax10575090
KnockOut Serum ReplacementInvitrogen10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral ConfocalLeica
MgCl2Sigma-Aldrich442615
Mouse C-Peptide ELISAALPCO80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISAALPCO80-INSMSU-E01
MX35 Microtome BladesThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS3817
NaH2PO4Sigma-Aldrich
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS 1XCorning21-040-CV
Pdx1 antibodyDSHBF6A11Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsVWR15160-157
Penicillin-Streptomycin SolutionCorningMT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)Sigma-AldrichP1585
Protein LoBind Microcentrifuge TubesEppendorf224310811.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 ProteinR&D Systems345-FG
Recombinant Human FGF-AcidicPeprotech100-17A
Recombinant Human R-Spondin I ProteinR&D Systems4546-RS
BenchRocker 2DBenchmarkBR2000
Sucrose 500gSigma-AldrichS0389
SuperFrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Super Pap PenElectron Microscopy Sciences71310
Thermomixer REppendorf05-412-401
Tissue Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
TrypLE ExpressInvitrogen12604039(1x), no Phenol Red
Trypan Blue StainInvitrogen15250061For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200072Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well PlateCorning3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-WellCorning4520
Vimentin AntibodyEMD MilliporeAB5733Polyclonal Chicken IgY
Vortex GenieBioExpresS-7350-1
Y-27632 DihydrochlorideR&D Systems1254Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeiss

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 Mesenchyme 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved