דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

Marissa A. Scavuzzo; Jessica Teaw; Diane Yang; Malgorzata Borowiak

doi:10.3791/57599

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

Abstract

הלבלב הוא שאיבר מורכב מורכב רבים לסוגי תאים שונים לעבוד יחד כדי לווסת הומאוסטזיס הגלוקוז הדם והעיכול. סוגי תאים אלה כוללים מפריש אנזימים תאים acinar, מערכת ductal arborized אחראי להובלה של אנזימי התאים האנדוקריניים במעיים, הורמונים.

בטא-תאים אנדוקריני הם סוג התא היחיד בגוף המייצרים אינסולין כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם. סוכרת, מחלה המאופיינת על ידי לאובדן או את תפקוד תאי בטא-מגיע לממדים של מגיפה. לכן חיוני להקים פרוטוקולים כדי לחקור את התפתחות תאי בטא יכול לשמש לסינון למטרות להפיק את התרופה ואת מבוססת תא הרפוי. בעוד חקירה ניסויית של פיתוח העכבר הוא חיוני, אין ויוו מחקרים הם מפרך ולגזול. תאים בתרבית מספקים פלטפורמה נוחה יותר להקרנה; עם זאת, הם אינם מסוגלים לשמור על גיוון הסלולר, ארגון אדריכלי, אינטראקציות סלולרי נמצאו ויוו. לכן חיוני לפתח כלים חדשים לחקור organogenesis הלבלב ופיזיולוגיה.

תאים אפיתל הלבלב לפתח בשיתוף הדוק עם מזנכימה מראשית organogenesis תאים לארגן, להבדיל לתוך האיבר למבוגרים מורכבות, כשיר מבחינה פיזיולוגית. הלבלב מזנכימה מספק אותות חשוב לפיתוח האנדוקרינית, שרבים מהם אינם מובנים היטב, ולכן קשה לסכם במהלך התרבות במבחנה . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול organoids תלת מימדי, תאי עכבר מורכבים תרבות לשמור מזנכימה, הנקרא pancreatoids. ניצן הלבלב מאתר e10.5 גזור, חלופה מועדפת, תרבותי בסביבה נטולת לגרדום. אלו צפים תאים בעצמם עם מזנכימה עוטף את pancreatoid המתפתח ומספר תאי הבטא האנדוקרינית לפתח את acinar, את התאים צינור חזקים. מערכת זו ניתן ללמוד את האינטראקציות תא-תא תא גורל נחישות הארגון מבניים, מורפוגנזה, במהלך organogenesis, או על סמים, מולקולה קטנה, או בדיקה גנטית.

Introduction

המופקע על מנגנוני להתפתחות תקינה של הפיזיולוגיה הוא בעל חשיבות עליונה להבין מחלה אטיולוגיה ולטפח בסופו של דבר שיטות טיפול. בעוד culturing, המבדילים תאי גזע מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ומהירה של פיתוח, הוא מוגבל על ידי הגוף קיים הידע בנושא מנגנוני ויסות גורל, באופן מלאכותי recapitulates פיתוח יחסית מדינה הומוגנית, מימדי¹^,². לא רק ויוו פיתוח מושפע השפעות חיצוני, עם סוגי תאים שונים נישה, וחשש מספקת paracrine אותות ותמיכה ארגונית כדי להנחות organogenesis, אלא הפונקציה של תאים אלה מסתמך גם על שלהם הסביבה עבור הדרכה³^,⁴^,⁵. לאור החשיבות של אלה סימנים חיצוניים, המגבלות של בידול פרוטוקולים, מהות מפרך ויוו העכבר מודלים, מערכות חדשות נדרשים לחקור השפעול של תהליכים התפתחותיים בסיסיים ופיזיולוגיה.

הופעתה של פרוטוקולים ליצירת תלת מימדי, מורכבים organoids מספק מערכת קונגרואנטי ונוח ללמוד organogenesis, פיזיולוגיה, יעילות התרופה ו פתוגנזה אפילו. הקמת organoids מאתר עבור מערכות שונות כגון הקיבה⁶ ו המעי⁷ הרחיבו את ההבנה שלנו של organogenesis, מתן כלי ללמוד המורכבות התפתחותית עם מגבלות מועטות יותר מאשר ויוו ומודלים במבחנה . עקב ההתפתחויות הללו בתוך תא צורב מאתר היווצרות, כניסתו של אדם pluripotent גזע תאים אנושיים מעיים⁸, רשתית⁹, כליות¹⁰^,¹¹, מוחי¹² organoids הופקו, ואת זה רפרטואר מוגבל רק על-ידי הידע הקיים לגבי מנגנוני התפתחות.

עניין מיוחד הוא הדור של הלבלב organoids, כמו מספר עצום של מחלות המכות סוגי התאים בלבלב, כולל תאים acinar וצינורות אי ספיקה הלבלב אקסוקרינית¹³, acinar תאי לבלב¹⁴ו תאי ביתא סוכרת¹⁵. רכישת ידע לגבי הפיתוח של סוגי התאים הללו יכול לסייע להבנת הפתולוגיה שלהם, גם, משמשים כפלטפורמה אישית והתרופות הקרנה או השתלת. בעבר, Greggio. ואח פיתח שיטה ליצירת organoids הלבלב מאתר זה מסכם את הדברים ויוו מורפוגנזה ולפתח מבנים מאורגנים, תלת מימדי, מתחם המורכב וכל השברים תא אפיתל הלבלב סוגי¹⁶^,¹⁷. זהו צעד חשוב בשטח הלבלב, במיוחד כמו עשיית תאים במבחנה ניתן לאפשר חקירה הביולוגי של התפתחות תאי בטא. עם זאת, המחסור תאים אנדוקריני שהוקמה ב פרוטוקול זה אלא אם כן organoids היו מושתלים לתוך רקמות, איפה הנישה יכול אינטראקציה ולספק רמזים הדרכה¹⁷. מזנכימה מהווה את החלק הגדול ביותר של הגומחה, בכבדות כעוטפת האפיתל מתפתח מן בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי בשלבים מאוחרים יותר, כולל delamination האנדוקרינית ובידול³^,⁴^, ¹⁸. האינטראקציה של מזנכימה הקל המתפתח עדיין דוגמה נוספת של איתות חיצוני ואת החשיבות של שמירה על ויוו המורכבות הסלולר ללמוד organogenesis.

כאן, אנו נתאר כיצד לייצר organoids הלבלב תלת מימדי, הנקרא pancreatoids, מ e10.5 הפומבית מאתר אבות הלבלב. Pancreatoids אלה שומרים על מזנכימה מקורית, בעצמם בתנאים לתרשים ולהפיק כל סוגי תאי הלבלב העיקריים, כולל מספר חזקים של תאי הבטא האנדוקרינית¹⁹. גישה זו היא המתאימה ביותר עבור הניתוח של פיתוח האנדוקרינית, כמו פרוטוקולים הקודמים חוסר בידול האנדוקרינית חזקים. עם זאת, המשתמשים בפרוטוקול עבור organoids הלבלב כפי שתואר על ידי Greggio et al. מתאים יותר לניתוח של הסתעפות אפיתל הלבלב, מורפוגנזה, בתור הסתעפות יותר מוגבל ב- pancreatoids.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בשיטה זו אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ביילור לרפואה.

1. הכנת העכבר מתחלקים היום 10.5 אבות הלבלב

הערה: פרוטוקול זה לא צריך להיות בעקבות בתנאים סטריליים עד שלב 2, אולם זה אופטימלי לחטא כלי ניתוח, לרסס עם אתנול 70% לפני השימוש.

כדי להגדיר עבור ניתוח, למלא דלי קרח ומניחים מכולה של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) בתוך הקרח. נקה שני שקצהו בסדר. מלקחיים ומספריים הקרע עם 70% אתנול. מיכל עם פחות שלושה בורוסיליקט נימי שוכן בסמוך לאזור לנתיחה, צינורות, על פיפטה בפה, מצית, ומסונן 1,000 טיפים פיפטה µL.
1. להכין לפחות 1 מ"ל של 1.25 מ"ג/מ"ל dispase קר סטיריליים למהול במים ולשתות, מקום הבאר השנייה של צלחת טוב 12 על קרח. להכניס PBS הראשונה, השלישית, הרביעית בארות 12 טוב צלחת. מקום 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב mL 1.5 צינור על קרח. לחמם של חממה חזק כדי 37 ^oC.
המתת חסד e10.5 עכברים בהריון-מתוזמן בהתאם להנחיות IACUC. לרסס את הבטן עם 70% אתנול כדי לנקות את האזור לפני ביצוע בצורת V חתך באזור איברי המין של העכבר באמצעות מלקחיים ומספריים ולהמשיך אותו עד הסרעפת.
הערה: הופעת פקק בנרתיק בתוך פרוטוקול זה מציינת היום 0.5. באמצעות 5 - 6 בת עכברים, עלייה במשקל של יותר מ 2 g פועלת כאמצעי משני של הספגה מוצלחת.
1. בזהירות לסלק את הרחם על ידי ביצוע חתך על החלקים לרוחב מעייניו של הרחם, מושך את האיבר כלפי מעלה מן העכבר, ובעקבות החתך עד באזור איבר המין לפני חוזר בצד הנגדי. מקום זה 10 ס מ צלחת פטרי עם PBS קר.
  הערה: זה אפשרי להשיג organoids של תאים e11.5 הפומבית, אולם בניגוד pancreatoids e10.5, organoids אלה עדיין לא מאופיינים ובכך עשויים לא לשמור את היכולת להבדיל לתוך כל שלוש שושלות הלבלב הגדולות.
תחת מיקרוסקופ אור לנתיחה, מניחים על צלחת פטרי ופתח בזהירות את רקמת הרחם על ידי הצבת שני מלקחיים בין כל העובר קילוף רקמות מן שק החלמון. העברת העוברים על ידי האוחז שק החלמון בעדינות עם מלקחיים, במקום 10 ס מ פטרי טריים PBS קר. מניחים על צלחת פטרי על קרח.
הערה: חשוב heedfully להסיר את העוברים, רצוי ויתוחזקו שק החלמון, כמו הסרת כוחני יכול למשוך את חבל הטבור, לקרוע טישו של העובר ולחשוף את השלמות. המבנית.
במקום מספר PBS טיפות על מכסה פטרי 10 ס מ. להשתמש אלה טיפות להעביר את העובר במהלך ניתוח כמו רקמות extraembryonic יוסרו כדי להבטיח ניראות. להעביר את העובר טיפה PBS ולהסיר בעדינות שק החלמון באמצעות מלקחיים, בעוד העוברים הנותרים נשאר PBS על קרח (איור 1א'). הסר את הראש לפני העברת העובר טיפה PBS חדש באמצעות מלקחיים להגיש בקלות ראש העובר, לא נזק לרקמת (איור 1B).
הערה: הרקמה ייתכן שתצטרך להעביר בתדירות גבוהה יותר טיפות PBS צח מזו המתוארת כאן, בהתאם לאטימות של הנוזל.
1. בטיפה PBS חדשים, להסיר בלוטות forelimb באמצעות מלקחיים (איור 1B). להכניס מלקחיים בתוך הפתח שבו האיבר באד היה נוכח ונפרק בעדינות רק הרקמה החיצוני ביותר anteriorly (איור 1B). סיבוב העובר וחזור לכיוון אחורי, ועוצרים ניצן hindlimb. בשלב זה, מערכת העיכול צריך להיות גלוי (איור 1B).
2. האזור האחורי של מערכת העיכול יש עיקול קטן (איור 1F). הכנס מלקחיים מאחורי העיקול הזה הפתח בין האזור בעמוד השדרה של קיר הגוף של מערכת העיכול. ניתוק של מערכת העיכול, עובד לאט כלפי מעלה עד האזור הקדמי ביותר איפה אזור הלב מתחבר (איור 1B-E).
  אופציונלי: להסיר את הלב הקדמוני ניצנים כבד מהאזורים הגחון של מערכת העיכול, להשאיר רק את הצינור בטן רציף. בפעמים הראשונות פרוטוקול זה מבוצע שיהיה קל יותר לעזוב את הלב והכבד כמו ציוני הגחון עד המורפולוגיה של מערכת העיכול ואת ניצן הלבלב הגבי הם יותר מוכר (איור 1C ו- D ).
3. העברה של מערכת העיכול ה-droplet PBS טריים.
4. לקחת מלקחיים בעדינות לצבוט את הרקמה מתחת באיבו בולטות המעי, להרים מעט את הרקמה החיצונית את (איור 1D-F).
  הערה: ניצן הלבלב הגבי ממוקם בין הקיבה והמעי (איור 1C-G). ניצן הלבלב מתחת צריך להיראות כמו מבנה עגול, הכפתוריים (איור 1G).
5. במקום מלקחיים איפה הניצן מתחבר המעי, קמצוץ כלפי מעלה כדי לשחרר את הניצן (איור 1G). רחץ פעם אחת בתוך בועה PBS חדש לפני העברת הניצן לתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12 ב- PBS קר על קרח. חזור עד ניצנים כל שנאסף עוברי והניח בתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12.
המקום ה-12 מגישים גם במיקרוסקופ אור לנתיחה. לספור את מספר בלוטות הלבלב בהצלחה גזור מאוחר יותר לחשב את יחס פיצול.
1. המקום מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה לתוך פיפטה בפה עם צינור קפילרי מצורף. להבה לעקר את צינור קפילרי וליצור עיקול בצינור כדי להקל על השימוש. להשתמש את נימי כדי להעביר ניצנים הפתרון השני dispase קר טוב המכיל למשך 2 דקות לפני העברת הבאר השלישית תסיים נקי (איור 1G).
  הערה: בעת העברת ניצנים dispase PBS, להימנע מלגעת הרקמה עד הקצה של הצינור נימי. אם הרקמה נתקע על קצה הצינור, פיפטה למעלה ולמטה או לנער בפתרון PBS נקי עד השתחררו.
2. פיפטה ניצנים למעלה ולמטה, ולהעביר אל הבאר הרביעית עם PBS נקי. לבסוף, באמצעות העברת המכשיר נימי ניצנים כדי ברכבת התחתית 1.5 mL עם 0.05% טריפסין. למקם את הצינור שייקר 37 ^oC מראש ומחוממת ומנערים במהירות של 1,500 סל ד במשך 4 דקות.
3. מערבולת במשך כ 10 s ואז מיד למקם את הצינור צנטריפוגה ספין בשביל 5 דקות ב- 200 g. להסיר את הכל אלא כ 50 µL של פתרון בזהירות כדי לא להפריע את התאים centrifuged (איור 1G).

2. חלופה מועדפת אבות כדי ליצור Pancreatoids culturing

הערה: הבאות צריכה להתבצע באווירה סטרילית בשכונה תרביות רקמה רגיל, באמצעות הליכים סטנדרטיים סטרילי.

עבור כל ניצן אסף, להוסיף 400 µL organogenesis מדיה¹⁶^,¹⁷ (טבלה 1) התאים centrifuged. דופק מערבולת שלוש פעמים, µL צלחת 100 לכל טוב של קובץ מצורף נמוך 96 טוב צלחת, פיצול ניצנים ביחס של 1:4 (איור 1G).
בדוק תחת המיקרוסקופ לדמיין חלופה מועדפת תאים באופן חופשי צף (איור 1H). מקם את המנה תרבות חממה 37 ^oC עם 5% CO₂ על כיסא נדנדה במהירות בינונית.
עקוב אחר ההתקדמות של pancreatoids מדי יום. להחליף 100 µL של מדיה טריים כל 3 ימים, מדיה pipetting בקפידה תחת בקרה מיקרוסקופית בשכונה כדי להסיר תוך השארת pancreatoid הבאר. לחלופין, טרי 100 µL של התקשורת ניתן להוסיף באר חדשה ו pancreatoid מועברים באמצעות בורוסיליקט קפילר המצורפת פיפטה בפה, 1000 µL מסונן פיפטה עצה.

3. עיבוד Pancreatoids עבור הדמיה Immunofluorescent

כדי לעבד pancreatoids לתמונות immunofluorescent, יש להכין תחילה 4% paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) פתרון. במקום 50 µL של 4% PFA בבארות של 96 ובכן צלחת.
1. באמצעות צינורות קפילר בורוסיליקט פיפטה בפה עם קצה פיפטה המסוננות 1,000 µL, להעביר pancreatoids בינוני תרבות לוקח מדיה קטנה ככל האפשר לתוך הבאר טריים עם 4% מחברים. ממוקם על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
2. להעביר pancreatoids מ- 4% PFA לבאר עם µL 100 ל- PBS טריים, רוק בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דק חוזר עבור סכום של שלושה שוטף PBS טריים.
  הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן, עם pancreatoids המאוחסן µL 100 ל- PBS ב 4 ^oC עד לשבוע אחד.
עבור הדמיה wholemount (מומלץ אם הם מתאימים, חלופית הגישה בסעיף 3.3. ואת מיקרוסקופ ב- 3.4.), להעביר מהערוץ סרום חמור 5% µL 50 ב- PBS 1 x עם חומר ניקוי nonionic 0.1% (PBST) כדי לחסום. סלע בן לילה בבית 4 ^oC או לחילופין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
1. להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים העיקרי מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. הסלע בצורה אופטימלית, 24 שעות בבית 4 ^oC (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות).
  הערה: נוגדנים המופיעים בטבלה של חומרים נגד Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), Pdx1 (1: 100) מתאימים wholemount מכתימה; נוגדנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה.
2. העברת pancreatoids לבאר, המכיל 100 µL של PBST טריים לשטוף את סלע במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שלושה שוטף PBST טריים.
3. להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים משניים מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. להגן על הבסיס מפני האור ולמקם 4 ^oC, נדנדה עבור בצורה אופטימלית 24 שעות (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות).
  הערה: כל נוגדנים משניים המופיעים counterstain גרעיני הטבלה של חומרים , דאפי מתאימים wholemount מכתים.
4. להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה 100 µL 1 x PBST ורוק בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות חוזר עבור סכום של שלושה שוטף 1 x PBST. בכביסה השלישי והאחרון, להוסיף 300 ננומטר דאפי.
5. לבסוף, למקם את µL 100 של PBS ונקייה בחנות 4 ^oC מוגן מפני אור במשך שבוע לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, למרות התוצאות הטובות ביותר של הדמיה מיד לאחר מכתים. כדי למנוע תנועה של pancreatoids במהלך דימות אך למנוע ייבוש, למקם את כל pancreatoid droplet 20 µL ל- PBS. אם pancreatoids אינם נשארים עדיין, להפחית את נפח PBS.
עבור מקטעים קפוא, להעביר pancreatoids מהערוץ בתוך 30% תמיסת סוכרוז למשך הלילה בבית 4 ^oC.
1. הוסף מדיה ההטבעה בבועה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים תחת בקרה מיקרוסקופית, משרים pancreatoids בדחיפה בעדינות דרך התקשורת ההטבעה מספר פעמים כדי להסיר שאריות סוכרוז לפני העברת גוש רקמה עם מדיה ההטבעה קפוא.
2. מניחים את רקמת בלוק על קרח יבש עד קפואים והמקטע על cryostat ב 8 מיקרומטר.
  הערה: סעיפים שניתן לאחסן ב-80 ^oC או immunostained מיד.
3. מאפשר מקטעים מ-80 ^oC להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 5 דקות עד יבש. לצייר מחסום הידרופובי באמצעות העט pap הידרופובי סביב הרקמה ולחסום את השימוש סרום חמור 5% בדילול 1 x PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
4. להסיר מדיה ולהחליף מיד עם נוגדנים העיקרי מדולל 5% חמור בסרום מדולל ב- x 1 PBST לילה בבית 4 ^oC.
5. הסר את הפתרון העיקרי ולשטוף רקמות שלוש פעמים עם 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בעקבות זאת, הוספת נוגדנים משניים פתרון מדולל בנסיוב חמור 5% בדילול 1 x PBST לשעה בטמפרטורת החדר להגן על שקופיות מפני אור.
6. הסר את הפתרון המשני ולשטוף שקופיות שלוש פעמים ב 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בכביסה הסופי, להוסיף 300 ננומטר דאפי.
7. להסיר מדיה ולהוסיף מדיה הרכבה של coverslip. חנות שקופיות מן האור 4 ^oC עד מוכן תמונה.

4. בידוד של RNA מ Pancreatoids לניתוח התעתיק

לאסוף את pancreatoids באמצעות נימי בורוסיליקט המצורפת פיפטה בפה עם מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה בשביל בעקרות ומקום לתוך µL 500 של חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון צינור 1.5 מ. ב-80 ^oC או פנה/י מיד לבידוד RNA.
לבידוד RNA, להפשיר דוגמאות על קרח במידת הצורך, להוסיף 100 µL של כלורופורם. מערבולת טוב והמקום ב 4 ^oC במשך 15 דקות מראש מגניב צנטריפוגה כדי 4 ^oC.
1. מניחים צינורות לתוך צנטריפוגה, ספין בשביל 20 דקות ב g 12,000 בבית 4 ^oC.
2. הסר בזהירות את צינורות כדי לא להפריע ההפרדה של שכבות. באמצעות פיפטה 200 µL, לאסוף את הפתרון ברור מימית ולמקם לתוך צינור 1.5 mL החדש, משאיר מאחור כמות קטנה אל מאגר חלבון לבן שכבה, שכבת ה-DNA ורוד. לא לגעת בקצה פיפטה לכל דבר בתהליך זה, אל תיגע דפנות הצינור 1.5 mL.
3. להוסיף 500 µL של 100% אלכוהול איזופרופיל הצינור החדש המכילות את שכבה מימית ואת מערבולת. בסדר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, עוד על הקרח, או עבור מרבית המשקעים להשאיר למשך הלילה ב-20 ^oC.
4. צנטריפוגה ב 12,000 g למשך 15 דקות בבית 4 ^oC כדי הצניפה את הרנ א. הסר את אלכוהול איזופרופיל מבלי להפריע בגדר.
  הערה: כמו pancreatoids הם קטנים, סביר שבגדר לא יהיו גלויים.
5. הוסף קר, 75% אתנול, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. מקום בצנטריפוגה, ספין ב 9,000 g x 10 דקות בבית 4 ^oC. הסר את אתנול וביו -ספין למשך 2 דקות ב 9,000 x g.
6. להשתמש על פיפטה 200 µL כדי להסיר כל אתנול שנותרו בצינור, ללא פנייה אל האזור שבגדר שוכן. להשאיר את הכיפה פתוח על המסך למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להבטיח אידוי של אתנול שיורית.
7. Resuspend צנפה על ידי vortexing ב 20 µL של מים נקיים, ללא נוקלאז.
  אופציונלי: חום הרנ א-65 ^oC למשך 3 דקות ומיד להחזיר הקרח. RNA יכול להיות מאוחסן ב-80 ^oC או השתמשו מיד שעתוק במהופך, qPCR.

תוצאות

ניתוח זהיר של העכבר עוברי-e10.5 מן הקרן הרחם אמור להניב העוברים תקינים ב- PBS עבור ניתוח נוסף (איור 1א'). מערכת העיכול ניתן להסיר ביעילות של העובר (איור 1B), המתיר הבחנה של ניצן הלבלב הגבי בצומת של המעי, הקיבה (איור 1

Discussion

ההתקדמות של מודלים התרבות התא חיוני כראוי מודל פיתוח, לייצר סוגי תאים הרלוונטית קלינית, בדיקת תרופות יעילות או אפילו להשתלת לחולים. עם זאת, באופן מלאכותי recapitulating פיתוח בקערה הוא מאתגר כמו שאנחנו עדיין רחוק מלהיות הבנת המנגנונים של organogenesis, פיזיולוגיה ויוו. כך הם במבחנה התאים שנוצ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים Jolanta Chmielowiec לדיון מועיל לגבי פרוטוקול ו כתב היד. אנו מודים גם בנג'מין Arenkiel לגישה מיקרוסקופ קונפוקלי. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (P30-DK079638 ל מ ב) ו- T32HL092332-13 M.A.S. ו מ ב מקנייר רפואי לקרן (מ ב), ליבת קונאפוקלית רוחני BCM, מרכז מחקר התפתחותיות (NIH U54 HD083092 מ יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי של הילד בריאות והתפתחות האדם).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes	Sigma-Aldrich	A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water	ThermoFisher	D119
Borosilicate Capillary Tubes	Sutter Instruments	GB1007515	O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate	Greiner Bio-One	650970	U-bottom
Centrifuge 5424 R	Eppendorf	5401000013
Chloroform	Sigma-Aldrich	233306
Chromogranin-A antibody	Abcam	ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60	Leica
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10310
Countess Cell Counter Slides	Invitrogen	C10312
CryoStar NX70	ThermoFisher	957000L
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride)	Roche	10 236 276 001	Powder
DBA antibody	Vector Lab	RL-1032
Dispase II, Powder	Gibco	17105041
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
Dnase I	Invitrogen	18068-015
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor)	Sigma-Aldrich	E9644
Ethanol, 200 Proof	Decon Laboratories	2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators	ThermoFisher	370
Fluoromount-G	Southern Biotech	OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
INSM1 Antibody	Santa Cruz BioTechnology	sc-271408	Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol	Fisher	a4164
Isothesia Isoflurane, USP	Henry Schein	11695-6776-2
Insulin Antibody	Dako	A056401	Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal	KAPA Biosystems	KK4618
KCl	KaryoMax	10575090
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal	Leica
MgCl2	Sigma-Aldrich	442615
Mouse C-Peptide ELISA	ALPCO	80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA	ALPCO	80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades	ThermoFisher	3052835
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S3817
NaH2PO4	Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS 1X	Corning	21-040-CV
Pdx1 antibody	DSHB	F6A11	Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	VWR	15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution	Corning	MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)	Sigma-Aldrich	P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22431081	1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein	R&D Systems	345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic	Peprotech	100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein	R&D Systems	4546-RS
BenchRocker 2D	Benchmark	BR2000
Sucrose 500g	Sigma-Aldrich	S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Super Pap Pen	Electron Microscopy Sciences	71310
Thermomixer R	Eppendorf	05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
TrypLE Express	Invitrogen	12604039	(1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain	Invitrogen	15250061	For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200072	Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate	Corning	3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well	Corning	4520
Vimentin Antibody	EMD Millipore	AB5733	Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie	BioExpres	S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride	R&D Systems	1254	Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss

References

Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 Organoids 3D Pancreatoids

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: