العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

Summary

التفريق بين adipocytes أبيض وبيج من الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية موروث يحمل إمكانات لتحسين التمثيل الغذائي في السمنة. يصف لنا البروتوكولات CD34 + CD31 + عزل الخلية البطانية من الدهون البشرية والتوسع اللاحق في المختبر ، والتمايز في adipocytes بيج وأبيض. وتناقش عدة تطبيقات المتلقين للمعلومات.

Abstract

ويرافق البدانة إعادة عرض واسعة من الأنسجة الدهنية في المقام الأول عن طريق تضخم adipocyte. نتائج النمو adipocyte المتطرفة في ضعف استجابة للأنسولين، ونقص المحلية، والتهاب. بحفز التفريق بين adipocytes البيضاء الفنية من فروعه، يمكن منع تضخم جذرية للسكان adipocyte، ونتيجة لذلك، يمكن تحسين صحة التمثيل الغذائي للأنسجة الدهنية جنبا إلى جنب مع تخفيض التهاب. أيضا، عن طريق تنشيط ريق adipocytes بيج/براون، نفقات الطاقة الجسم الكلي يمكن زيادة، مما يؤدي إلى فقدان الوزن. هذا النهج يمكن أن تحول دون تطور المراضات المشارك السمنة مثل داء السكري من النوع 2، وأمراض القلب والأوعية الدموية.

وتصف هذه الورقة العزلة والتوسع، والتفريق في adipocytes أبيض وبيج من مجموعة فرعية خلايا الأنسجة الدهنية البشرية بطانية المشترك تعبر عن علامات CD31 و CD34. الطريقة رخيصة نسبيا وليست كثيفة العمالة. يتطلب الوصول إلى الأنسجة الدهنية البشرية ومستودع تحت الجلد ومناسبة لأخذ العينات. لهذا البروتوكول، عينات الأنسجة الدهنية الطازجة من مواضيع السمنة سقيم [مؤشر كتلة الجسم (BMI) > 35] يتم جمعها خلال إجراءات جراحات. باستخدام إيمونوسيباريشن متسلسلة من الكسر الأوعية الدموية stromal، يتم إنتاج ما يكفي من خلايا من أقل من 2-3 غرام الدهون. هذه الخلايا يمكن توسيعها في ثقافة أكثر من 10-14 يوما، ويمكن cryopreserved، والاحتفاظ بممتلكاتهم أديبوجينيك مع باساجينج حتى سن 5-6. وتعامل الخلايا لمدة 14 يوما مع أديبوجينيك كوكتيل باستخدام مزيج من الأنسولين البشري ومؤثر-روزيغليتازون PPARγ.

يمكن أن تستخدم هذه المنهجية للحصول على دليل على مفهوم التجارب على الآليات الجزيئية التي تدفع ردود أديبوجينيك في الخلايا الدهنية بطانية، أو لفحص العقاقير الجديدة التي يمكن أن تعزز أديبوجينيك الرد موجها أما نحو الأبيض أو التفريق بين adipocyte بيج/براون. باستخدام عينة صغيرة تحت الجلد، يمكن استخدام هذه المنهجية لحجب المواضيع غير المستجيب للتجارب السريرية ويهدف إلى حفز adipocytes بيج/البنى والأبيض لعلاج السمنة والمراضات المشارك.

Introduction

وتبين الأدلة الأخيرة أن الفئران والبشر، يمكن أن تكون متباينة مجموعة فرعية خلايا يقطنون المفرج الأنسجة الدهنية إلى أما أبيض أو بيج/بني adipocytes^1،2،3. النمط الظاهري لهذه الخلايا موضوع الخلاف، مع الأدلة المؤيدة لخلايا بطانية أو العضلات الملساء/بيريسيتي، أو طائفة من وسيطة تعمل^4،5،،من⁶⁷. وكان نطاق تطوير هذه المنهجية لاختبار إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + غشائي الخلايا المعزولة من مستودعات الدهون المختلفة من البشر يعانون من السمنة المفرطة. وتركز دراسات أخرى في الأدب على أديبوجينيك المحتملة في كسر الأوعية الدموية stromal مجموع أو adipocyte المعروفة المتكفل^2،،من⁸⁹. منذ التكنولوجيات الموجودة حاليا يمكن أن تستهدف على وجه التحديد خلايا الأنسجة الدهنية بطانية للمخدرات تسليم¹⁰، فهم إمكانات هذه الخلايا للخضوع أديبوجينيك توجيهي نحو adipocytes أبيض أو بيج من المهم العلاجات المستهدفة مستقبلا.

وذكرت مجموعات مختلفة مزيج علامات CD31 و CD34 كالأمهات البديلات عزل خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية البشرية^11،،من¹²¹³. عادة، يتم العزل استخدام اثنين من الخطوات المتسلسلة وتشكيله إيجابية باستخدام الخرز المغناطيسي. واستخدمت في هذا التقرير، إيمونوسيباريشن استخدام CD34 + الخرز المغناطيسي جنبا إلى جنب مع الخرز البلاستيك CD31. وجدنا هذا الأسلوب متفوقة على إيمونوسيباريشن المغناطيسي متسلسلة فيما يتعلق بالحفاظ على مورفولوجيا غشائي حصاة كبيرة نموذجية. أيضا، كنا قادرين على توليد ما يكفي من خلايا المطلوبة لتحريض التوسع وأديبوجينيك بدءاً من أقل من 1-2 غرام الدهون. خزعة عينة صغيرة من الدهون تحت الجلد ما يكفي لإنتاج الكمية المطلوبة من الخلايا للتطبيقات المتلقين للمعلومات. هذا الجانب يحتمل أن تكون هامة، لا سيما إذا كان هذا الأسلوب سوف تستخدم للكشف عن استجابة لتحريض أديبوجينيك في البشر.

خلافا لأنظمة أخرى ذكرت في الأدبيات، يستخدم هذا الأسلوب فقط هما مكونان لتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + الخلايا: مؤثر PPARγ – روزيغليتازون – والإنسولين البشري. الأهم من ذلك، كمية الأنسولين المستخدمة يقع ضمن النطاق العادي/عالية لتعميم بوستابسوربتيفي الأنسولين في البشر¹⁴. درجة القدرة على الاستجابة للأنسولين من الخلايا في المختبر، تقاس الفسفرة Akt، ترتبط بمدى قدرتها على الاستجابة لتحريض كوكتيل. من المثير للاهتمام، استخدام هذه الشروط التعريفي كوكتيل والتجريبية، مزيج خلايا البيضاء والبيج/براون تم الحصول عليها كما تحدد حجم وعدد قطرات داخل الخلايا الدهنية والتعبير عن المؤشرات الجزيئية. يسمح هذا البروتوكول تعريفية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة إلى جانب التقييم الكمي للنمط الظاهري لخلايا المستجيب (الأبيض مقابل بيج) لفحص العوامل التي يمكن أن يحتمل أن يغير موازين متباينة بيج : الأبيض adipocytes.

كما يوفر هذا الأسلوب نهجاً متعدية لفهم الآليات الكامنة أديبوجينيسيس فروعه غشائي الأوعية الدموية في الأنسجة الدهنية للإنسان. باستخدام هذه التقنية المحددة العزلة/التمايز، يمكن استجواب المحققين المسارات المختلفة المسؤولة عن أديبوجينيسيس في مجموعة فرعية خلايا البطانية الوعائية من شتى مخازن الدهون في البشر الهزيل والسمنة المفرطة.

Protocol

وافقت "لجنة استعراض المجلس المؤسسية" في مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية بالأبحاث وجمع عينات الأنسجة الدهنية البشرية المستخدمة في هذه الدراسة. وجمعت من المرضى موافقة خطية مستنيرة.

1-إعداد المخازن المؤقتة، ووسائط الإعلام، والصكوك

1. إعداد حل Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (كربس): 135 ملم كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 5 مم، سلفات المغنيزيوم 1 مم، 0.4 مم بوتاسيوم فوسفات مائي، الجلوكوز 5.5 ملم، الادينوسين 1 مم، مزيج المضادات الحيوية/فطري 0.01 ٪ (50 ميكروغرام/مل من البنسلين، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 30 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين، 15 نانوغرام/مليلتر من الامفوتريسين) و 10 ملم حبيس (pH = 7.4). هذا الحل هو أعدت طازجة كل الوقت لجمع الأنسجة والهضم.
2. تعد حلاً كولاجيناز طازجة: 1 ملغ/مل كولاجيناز، اكتب 1، في كربس؛ جعل 3 مل/غرام الدهون. قبل الحارة الحل كولاجيناز عند 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل هضم الأنسجة.
3. إعداد المخزن مؤقت عزل الخلايا CD34: 2% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1 مم يدتا في المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS).
4. تعد وسائل الإعلام أديبوجينيسيس: DMEM/F12، 5% FBS، 50 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين و 1.25 ميليلتر/مل من الأنسولين البشري (5 ميكروغرام/مل أو 144 mU/mL) 0.36 ميليلتر/مل من 2.8 مم روزيقليتازون (1 ميكرومتر).
5. تحضير حل أسهم س أحمر نفط (أورو) 0.3% (وزن/حجم) بتذويب 0.3 غرام الذهب إلى 100 مل الكحول.

2-الدهنية كسر الأوعية الدموية Stromal العزلة

ملاحظة: شملت الدراسة مجموعة مستعرضة سقيم البدناء النوع 2 السكري (T2D) والمواضيع غير مرضى السكري، الذين تتراوح أعمارهم بين 18 65 عاماً، تشهد جراحات في سينترا الأيض ومركز جراحة فقدان الوزن (المجموعة الطبية سينترا، نورفولك، فرجينيا). وتشمل معايير الاستبعاد أحد أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك السكري من النوع 1، الظروف التي تتطلب المعالجة الكابتة للمناعة المزمنة أو الأدوية المضادة للالتهابات، ثيازولينينديونيس، وتعاطي التبغ النشطة، الالتهابات الحادة أو المزمنة أو تاريخاً خبيثة تعامل خلال الأشهر ال 12 الماضية. وعرف أنه بلازما جلوكوز أثناء صوم من 126 ملغ/دل أو أكثر، جلوكوز من 200 mg/dL أو أكثر بعد اختبار تحمل جلوكوز ح 2، أو استخدام الأدوية antidiabetic T2D.

1. جمع أومينتال البشرية (OM) والأنسجة الدهنية (SC) تحت الجلد (AT) من البشر تمر جراحات.
2. الاحتفاظ باوم وفي اتفاقية استكهولم في قنينات منفصلة تتضمن "الحل" هانك الملح مخزنة مع 50 ميكروغرام/مل من البنسلين/ستربتوميسين في درجة حرارة الغرفة مباشرة بعد استخراج الأنسجة.
3. عناية تنظيف وإزالة المقاطع تليفية وكوتيريزيد للنسيج باستخدام مقص ممسوح الإيثانول 70% وملاقط عند وصول العينة إلى المختبر بعد استخراج الأنسجة.
4. وزن الأنسجة الدهنية وقسم تكنولوجيا المعلومات في 5 غ (أو أقل) مختبرين لهضم كولاجيناز.
5. فرم ناعما 5 غ AT في 5 مل من حل كولاجيناز في قنينة التﻷلؤ في درجة حرارة الغرفة، باستخدام اثنين من أزواج من المقص.
6. إضافة 10 مل إضافية لحل كولاجيناز للأنسجة مفروم لمجموع 15 مل.
7. هضم العينات ح 1، في 37 درجة مئوية، في حمام مائي مع الرج المستمر.
8. قطع بلاغ المحاقن 20 مل لجعل وضع نهاية غير حادة.
9. قص مربع 9 × 9 سم من شبكة 250 µm ويدفع به في منتصف الطريق في أنبوب 50 مل مخروطية استخدام المحاقن نهاية غير حادة.
10. صب العينات في محقنة 20 مل نهاية حادة وتصفية من خلال 250 ميكرون النايلون في أنبوب 50 مل المخروطية لفصل adipocytes وخلايا الأوعية الدموية stromal من الأنسجة عسر الهضم.
    ملاحظة: لا تستخدم أكثر من 5 غ ات الواحدة 50 مل الأنبوبة المخروطية، كما سيتم الحصول على انسداد الشبكة نظراً لفائض المواد تليفية عسر الهضم.
11. تغسل القنينة التﻷلؤ مع 10 مل كربس ومن أجل ذلك من خلال عامل التصفية لجمع الخلايا المتبقية.
12. احتضان هذه العينات التي تمت تصفيتها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للسماح adipocytes إلى تعويم في الجزء العلوي من الأنبوب وبعض الخلايا والأوعية الدموية stromal ليستقر على الجزء السفلي من الأنبوب.
13. الاستفادة من حقنه 20 مل و 20 × 6 في إبرة بيبيتينج إزالة طبقة كسر الأوعية الدموية stromal وتحويلها إلى أنبوب مخروطي نظيف 50 مل.
14. أضف 10 مل كربس وتسمح العينات للجلوس على مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
15. كرر الخطوات من 2، 12 – 2.14 مرتين.
    ملاحظة: هذه الخطوات سوف تضمن أنه لا يوجد أي تلوث من خلايا الأوعية الدموية stromal مع adipocytes العائمة.
16. تبقى كسور الأوعية الدموية stromal من كلا مستودعات على الجليد لمزيد من المعالجة، كما هو موضح في الخطوات التالية.
    ملاحظة: لا تترك الخلايا على الجليد لأكثر من ح 1، كما قد يؤثر على بقاء الخلية. يمكن أن تكون مجمدة فلاش في النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل adipocytes أو المستخدمة طازجة للتجارب.

3-عزل خلايا الأنسجة الدهنية بطانية

1. تدور الكسور الأوعية الدموية stromal (SVF) في 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
2. إزالة العينات من أجهزة الطرد المركزي وعناية من أجل إيقاف المادة طافية؛ تبقى بيليه تحتوي على خلايا صندوق التبرعات الخاص.
3. بلطف ريسوسبيند الكريات الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: إذا تمت معالجة أكثر من 5 غ مستودع ات إلى مختبرين متعددة (راجع الخطوة 2، 4)، تجمع الكريات الخلايا معا.
4. تدور العينات من 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
5. إزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني، وحساب الخلايا.
   ملاحظة: استخدمت عداد تلقائي خلية هنا، لخلية العد. تم الحصول على بقاء الخلية بخلط 12 ميليلتر من تعليق خلية مع 12 ميليلتر محلول يوديد propidium البرتقالي/(AO/PI) أكريديني (انظر الجدول للمواد). متوسط عدد الخلايا في الغرام ات لكل مستودع: (أ) "مستودع أوم": 1.69 بوصة × 10⁵ ± 4.51 x 10⁴؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 1.24 س ± 6، 45 × 10⁵ 10⁴. كان بقاء الخلايا من كلا مستودعات > 90%.
6. بيليه العينات من 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: بروتوكول اختيار إيمونوماجنيتيك CD34 (انظر الجدول للمواد) تم تكييفها للخطوات 3.7 – 3.15.
7. ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر CD34 عزلة المخزن المؤقت.
   ملاحظة: عدد خلايا مجموع تتطلب إعادة تعليق وحدات التخزين التالية: (أ) < 2 × 10⁷ الخلايا: ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر؛ (ب) 2 x 10⁸–5 x 10⁸ خلايا: ريسوسبيند بيليه في 1 مل. في خطوات 3.9 – 3.16، وحدات تخزين الكواشف المستخدمة تم تقليصها < 2 × 10⁷ الخلايا.
8. إضافة 10 ميليلتر من CD34 كوكتيل واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
9. إضافة 5 ميليلتر من حبات مغناطيسية واحتضان العينة لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
10. إضافة 2.5 مل CD34 عزلة المخزن المؤقت لكل عينة ووضع العينات في المغناطيس، لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
11. عكس المغناطيس ل 5 ق صب إيقاف المخزن المؤقت العزلة.
12. إزالة العينات من المغناطيس وكرر الخطوتين 3، 10 و 3.11 x 4.
13. إزالة الأنبوب من المغناطيس وإضافة 2 مل CD34 عزلة المخزن المؤقت.
14. بيليه الخلايا في 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
15. ريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لعزل CD34 وحساب الخلايا.
    ملاحظة: هنا، متوسط عدد الخلايا كل غرام في: (أ) "مستودع أوم": 4.75 × 10⁴ ± 3.36 × 10⁴؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 1.06 × 10 ± 9.53 x 10^{4 3}. بروتوكول إيمونوبيد بلاستيك CD31 تم تكييفها للخطوات 3.16 – 3.34 (انظر الجدول للمواد).
16. بيليه الخلايا عند 500 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه في 250 ميليلتر من "المخزن المؤقت ب" و 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
17. دقة ريسوسبيند الخرز CD31 من فورتيكسينج الأنبوبة.
18. إضافة 20 ميليلتر من الخرز CD31.
    ملاحظة: بسبب خلية إجمالي حساب > 1 × 10⁶وحدة التخزين تم تقليصها وفقا للإدخال الخاص بالشركة المصنعة.
19. احتضان العينة مع هزاز مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
20. إرفاق مصفاة لأنبوب مخروطي عقيمة 50 مل.
    ملاحظة: يجب أن تكون افتتاح أكبر مصفاة الأعلى.
21. قبل فصل الخلية، قم بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي حجته المصفاة. تطبيق الخليط التي تم إنشاؤها ضمن الخطوة 3.16 إلى المصفاة.
22. أغسل المصفاة مع 5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في حركة دائرية لإجمالي حجم 20 مل. توصيل الموصل بأنبوب مخروطي عقيمة 50 مل وإغلاق نظام القفل.
23. إرفاق المصفاة للموصل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي على طول الجدار المصفاة. أضف 1 مل من المخزن المؤقت المنشط د على طول الجدار المصفاة. دوامة العينة بلطف واحتضان عليه لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
24. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. فصل الخلايا من الخرز من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 x.
    ملاحظة: تجنب توليد فقاعات الهواء.
25. فتح قفل اللوير والسماح بالتدفق في أنبوب 50 مل المخروطية الخلايا المنفصلة. أغسل مصفاة 10 x مع 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في كل مرة.
26. تجاهل موصل ومصفاة والطرد المركزي العينات من 300 x ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من "الوسائط" الغير عادية-2 كاملة للثقافة.
    ملاحظة: متوسط عدد الخلايا في الغرام ات عند هذه النقطة: (أ) "مستودع أوم": 5.92 × 10³ ± 4.27 × 10³؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 4.12 × 10 ± 2.1 × 10^{3 3}. صلاحية الخلايا من مستودعات على حد سواء كان أكثر من 90%.

4-تنظيم دورات تعريفية أديبوجينيسيس في خلايا بطانية معزولة

1. تنمو الخلايا الموجودة في لوحات المعالجة بزراعة الأنسجة 6-جيدا مع الوسائط الغير عادية-2 كاملة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة. استبدال وسائط الإعلام كل 3 – 4 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80 – 90%.
   ملاحظة: تضاعف السكان ما بين 2-3 أيام.
2. توسيع نطاق الخلايا بالطلاء لهم على أطباق بيتري 100 مم وتقسيم الخلايا مرة واحدة في 1:3. وفي هذه المرحلة، الخلايا على المرور 2.
3. عد الخلايا باستخدام خلية تلقائية مكافحة (انظر الجدول للمواد).
4. خلايا البذور حوالي 100 – 200,000 في لوحات 6-كذلك ضمان آبار المكررة لكل مستودع والثقافة لهم في إكمال وسائط EGM-2 لمدة يومين.
5. نضح إيقاف أي وسائط النمو واستبدله مع 2 مل من DMEM/F12 مع 5% FBS و 50 ميكروغرام/مل من البنسلين/ستربتوميسين للسيطرة على الخلايا واستبدله مع 2 مل من أديبوجينيسيس وسائل الإعلام (راجع الخطوة 1، 4) لعلاج الخلايا.
6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO₂ حاضنة لمدة 13 يوما، الاستعاضة عن وسائل الإعلام كل منهما كل 3 إلى 4 أيام.
   ملاحظة: سوف تبدأ الخلايا تتراكم الدهون بعد 4 أيام علاج.
7. إجراء أورو والنيل الأحمر تلطيخ وفقا لأساليب نشر^15–17.
8. لعزل الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، قم بإزالة الوسائط من لوحات تعريفية 6-جيدا وغسله مع 1 مل PBS العقيمة.
9. إضافة 350 ميليلتر من حل ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم جوانيديوم (انظر الجدول للمواد) لكل خير واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 – 10 دقائق.
10. تتخلص من الخلايا خارج اللوحة مكشطة خلية باستخدام ونقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في الثلاجة-80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي ومزيد من المعالجة في وقت لاحق.
11. استخراج مرناً من العينات باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي تكييف البروتوكول (انظر الجدول للمواد).
12. القيام الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) لتقييم التعبير الجيني باستخدام المسابر التالية: الاديبونكتين، الأعراف والممارسات الموحدة-1، وسيدة (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: هنا، إجراءات RT-PCR نفذت باستخدام بروتوكول القياسية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية؛ 15 s)، الصلب، وملحق (60 درجة مئوية؛ 1 دقيقة) لدورات 40. العينات التي أعرب عنها الجينات مع قيم ج_T > 35 اعتبرت غير قابلة للكشف.

النتائج

لدينا بروتوكول يهدف إلى توفير نهج في المختبر لتحديد إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا الأوعية الدموية من مستودعات مختلفة من الأنسجة الدهنية البشرية. ويبين الشكل 1Aرسم تخطيطي انسيابي مبسطة. الخطوة الأولى استخدام تحديد إيجابي CD34 معربا عن الخلايا يؤدي >...

Discussion

تركز هذه الورقة تقديم منهجية للعزل والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من مستودعات الحشوي وتحت الجلد من الأنسجة الدهنية البشرية.

وقد تم الإبلاغ عن المنهجيات لعزل خلايا بطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة من القوارض أو البشر التي تنطوي أساسا على تقنيات استخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484