Изоляция, расширение и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от человека сальниковый и подкожной жировой ткани

Резюме

Дифференциация белых и бежевых адипоцитов из жировой ткани сосудистой прародителями медведи потенциал повышения метаболизма ожирения. Мы описываем протоколы для CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток изоляции из человеческого жира и последующих в vitro расширения и дифференцировку в белом и бежевом адипоцитов. Обсуждаются несколько нисходящие приложения.

Аннотация

Ожирение сопровождается обширной реконструкции жировой ткани главным образом через Адипоцит гипертрофия. Экстремальные Адипоцит роста приводит к плохой ответ на инсулин, местные гипоксии и воспаления. Стимулируя дифференциация функциональных белый адипоцитов из прародителей, радикальные гипертрофия Адипоцит населения могут быть предотвращены, и, следовательно, метаболически здоровье жировой ткани могут быть улучшены наряду с сокращением воспаление. Кроме того стимулируя дифференциация бежевый/коричневый адипоциты, расходование энергии всего тела может быть увеличена, что приводит к потере веса. Этот подход может предотвратить развитие ожирения сопутствующие заболевания, такие как тип 2 диабет и сердечно-сосудистых заболеваний.

Этот документ описывает изоляции, расширение и дифференциации белых и бежевых адипоцитов из подмножества жировых тканях человека эндотелиальных клеток, которые совместно Экспресс CD31 и CD34 маркеров. Метод является относительно дешевым и не является трудоемким. Она требует доступа к человека жировой ткани и подкожные депо подходит для выборки. Для этого протокола, свежие жировой ткани образцов из morbidly ожирением предметы [индекс массы тела (ИМТ) > 35] собраны во время процедур бариатрической хирургии. Использование последовательных immunoseparation стромальные сосудистой фракции, достаточно клетки производятся из всего лишь 2-3 g жира. Эти клетки могут быть расширены в культуре в течение 10-14 дней, может быть криоконсервированных и сохраняют свои свойства адипогенном с пассированый до прохождения 5-6. Клетки обрабатываются в течение 14 дней с адипогенном коктейль, используя сочетание человеческого инсулина и PPARγ агонист Росиглитазон.

Эта методология может использоваться для получения доказательство концепции экспериментов на молекулярные механизмы, которые управляют адипогенном ответы в жировых клетках эндотелия, или для скрининга новых лекарств, которые могут повысить адипогенном ответ направлена либо на белый или бежевый/коричневый Адипоцит дифференциации. С помощью небольших подкожной биопсий, эта методология может использоваться для экрана-ответчик предметам для клинических испытаний, направленных на стимулирование бежевый/коричневый и белый адипоциты для лечения ожирения и сопутствующие заболевания.

Введение

Последние данные показывают, что в мышей и людей, подмножество ячеек, проживающих в сосудистую жировой ткани могут быть продифференцированы в белый или бежевый/коричневый адипоцитов^1,2,3. Фенотип таких клеток является предметом споров, с подтверждающей эндотелиальных клеток, гладкие мышцы/перицит или спектр промежуточных фенотипов^4,5,6,7. Область разработки этой методологии было проверить адипогенном потенциал CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток, изолированных от различных жировых отложений из тучных людей. Другие исследования в литературе сосредоточены на адипогенном потенциал всего стромальные сосудистой дроби или известных Адипоцит прародителями^2,8,9. Поскольку в настоящее время существующих технологий можно ориентировать конкретно эндотелиальные клетки жировой ткани для доставки наркотиков¹⁰, понимание потенциал таких клеток пройти адипогенном индукции к белый или бежевый адипоцитов имеет важное значение для будущее целевой терапии.

Различные группы сообщили сочетание CD31 и CD34 маркеры как суррогаты изолировать эндотелиальных клеток от жировых тканях человека^11,12,13. Как правило изоляция выполняется с использованием двух последовательных шагов и положительный выбор с помощью магнитной бусины. В настоящем докладе была использована immunoseparation с помощью CD34 + магнитные шарики в сочетании с CD31 пластиковые бусины. Мы нашли этот метод превосходит последовательный магнитные immunoseparation в отношении сохранения типичных булыжником эндотелиальной морфологии. Кроме того мы были способны генерировать достаточно клеток, необходимых для расширения и адипогенном индукции, начиная от всего лишь 1 – 2 g жира. Небольшой пример биопсии подкожного жира достаточно производить необходимое количество клеток для нисходящие приложения. Этот аспект является потенциально важным, особенно, если этот метод будет использоваться для скрининга для оперативности адипогенном индукции в человеке.

В отличие от других систем, в литературе о, этот метод использует только два ингредиенты для индукции адипогенном CD34 + CD31 + клеток: агонист PPARγ — Росиглитазон — и человеческого инсулина. Важно отметить, что количество инсулина используются попадает в диапазон нормальный/высокий циркулирующих post-absorptive инсулина в людях¹⁴. Степень реагирования на инсулин клетки в пробирке, измеряется Akt фосфорилирование, не коррелирует с их способность реагировать на индукции коктейль. Интересно, что используя этот индукции коктейль и экспериментальных условиях, смесь белый и бежевый/коричневый клетки были получены как определяется размер и количество внутриклеточной липидного капель и проявление молекулярных маркеров. Этот простой и экономически индукции протокол наряду с количественной оценки фенотипа клетки ответчика (белый и бежевый) позволяет для скрининга агентов, которые потенциально могут изменить баланс дифференцированных бежевый : белый адипоцитов.

Этот метод также предоставляет поступательного подхода для понимания основных механизмов adipogenesis сосудистого эндотелия прародителей в жировых тканях человека. Используя эту технику конкретных изоляции/дифференциация, следователи могут допросить различных путей, ответственный за adipogenesis в подмножестве сосудистой эндотелиальных клеток от различных жировых отложений в худой и тучных людей.

протокол

Организационного комитета Правления обзор Восточной Вирджинии медицинской школы одобрил исследований и сбора образцах адипозных тканей человека, используемые в исследовании. Обоснованное письменное согласие была собрана из пациентов.

1. Подготовка буферов, средств массовой информации и инструментов

1. Подготовить раствор Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 мм натрия хлорида, 5 мм хлорид калия, магния сульфата 1 мм, 0,4 мм калия фосфат двухосновной, 5,5 мм глюкозы, 1 мм аденозина, 0,01% антибиотик/противогрибковое микс (50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 30 мкг/мл гентамицина, амфотерицин 15 нг/мл) и 10 мм HEPES (рН = 7,4). Этот раствор готовят свежий каждый раз для сбора ткани и пищеварение.
2. Приготовить свежие коллагеназы раствор: 1 мг/мл коллагеназы, тип 1, в KRBSS; Сделайте 3 мл/г жира. Предварительно теплой коллагеназы решение при 37 ° C на водяной бане до ткани пищеварение.
3. Подготовить CD34 ячейки изоляции буфера: 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 мм ЭДТА в стерильных фосфат амортизированное saline (PBS).
4. Подготовить Adipogenesis СМИ: В среде DMEM/F12, 5% FBS, 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина, 1,25 мкл/мл человеческого инсулина (5 мкг/мл или 144 му/мл) и 0,36 мкл/мл Росиглитазон 2,8 мм (1 мкм).
5. Подготовьте O красный нефти (Оро) Стоковый раствор 0,3% (вес/объем), растворяя 0,3 г в 100 мл изопропанола Оро.

2. жировой стромальные сосудистой фракция изоляции

Примечание: Исследование включало кросс-секционное когортное morbidly ожирением тип 2 диабетом (T2D) и не диабетиков предметов, в возрасте 18 – 65 лет, проходят бариатрической хирургии в Sentara метаболических и центр хирургии потери веса (Sentara медицинская группа, Норфолк, VA). Критерии исключения включали аутоиммунных заболеваний, включая сахарный диабет типа 1, условия, требующие хронический иммуносупрессивной терапии, противовоспалительные препараты, thiazolinendiones, активный табака, хронических или острых инфекций или история злокачественности лечение в течение последних 12 месяцев. T2D был определен как поста глюкозы плазмы 126 мг/дл или более, глюкозы, 200 мг/дл или больше после того, как тест толерантности к глюкозе 2 h или использование антидиабетических препаратов.

1. Соберите человека сальниковый (ом) и подкожной жировой клетчатки (SC) (AT) от человеческих субъектов, переживает бариатрической хирургии.
2. Держите ом и SC AT в отдельных флаконах, содержащих Хэнка буфер солевой раствор с 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина при комнатной температуре сразу же после извлечения тканей.
3. Тщательно очистить и удалить разделы фиброзных и прижигание ткани с помощью 70% этанол обработанных тампонами ножницы и щипчики, когда образец прибывает в лаборатории после извлечения тканей.
4. Весят жировой ткани и разделов аликвоты ИТ в 5 g (или меньше) для переваривания коллагеназы.
5. Мелко фарш 5 g AT в 5 мл коллагеназы раствора во флаконе мерцания при комнатной температуре, используя две пары ножниц.
6. Добавьте дополнительные 10 мл раствора коллагеназы фарш из ткани для всего 15 мл.
7. Дайджест образцы за 1 ч, при 37 ° C, на водяной бане с непрерывной тряски.
8. Отрежьте кончик от 20 мл шприц сделать тупой конец.
9. Вырезать квадрат 9 х 9 см от 250 мкм сетки и вставьте его на полпути в 50 мл Конические трубки с помощью шприца тупой конец.
10. Полейте образцы в 20 мл шприц тупой конец и процеживают через 250 мкм нейлоновая сетка в 50 мл Конические трубки отделить адипоциты и стромальных клеток сосудистой от непереваренных ткани.
    Примечание: Не используйте более чем 5 g на за 50 мл Конические трубки, как сетка будет получить забиты из-за избыточного фиброзных непереваренных материала.
11. Промыть сцинтилляционные флакон с 10 мл KRBBS и полить его через фильтр для сбора остаточной клетки.
12. Инкубируйте отфильтрованных проб для 5 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Этот шаг имеет важное значение для адипоцитов плавать в верхней части трубки и некоторые из стромальных клеток сосудистой поселиться в нижней части трубки.
13. Используйте 20 мл шприц и 20 G x 6 в дозирования иглой, чтобы удалить слой стромы сосудистой дроби и передаче его на чистую 50 мл Конические трубки.
14. Добавить 10 мл KRBBS и позволяют образцы сидеть на скамейке за 5 мин, при комнатной температуре.
15. Повторите шаги 2.12 – 2.14 дважды.
    Примечание: Эти шаги будет гарантировать, что нет никакого загрязнения стромальных клеток сосудистой с плавающей адипоцитов.
16. Держите стромальные сосудистой дроби от обоих складов на льду для дальнейшей обработки, как описано ниже.
    Примечание: Не оставляйте клетки на льду для более чем 1 h, как это может иметь влияние на жизнеспособность клеток. Адипоцитов может быть флэш замороженные в жидком азоте для длительного хранения или свежие для экспериментов.

3. изоляция эндотелиальных клеток жировой ткани

1. Спиновые стромальные сосудистой фракций (СФДВ) в 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
2. Удаление примеров из центрифуги и тщательно слейте супернатант; Держите гранулы, содержащие клетки СФДВ.
3. Нежно ресуспензируйте клетки окатышей в 5 мл ФСБ.
   Примечание: Если в несколько аликвоты (см. шаг 2.4) было обработано более чем 5 g в депо, объединения клеток окатышей.
4. Спиновые образцов 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
5. Удалить супернатант, Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS и подсчитать количество ячеек.
   Примечание: Здесь, счетчик автоматически клеток был использован для подсчета клеток. Жизнеспособность клеток был получен путем смешивания 12 мкл суспензии клеток с 12 мкл раствора акридин оранжевый/пропидий йодидом (AO/PI) (см. Таблицу материалы). Среднее количество клеток на грамм на для каждого склада: (a) ом депо: 1.69 x 10⁵ ± 4,51 x 10⁴; (b) SC депо: 1,24 x 10⁵ ± 6.45 x 10⁴. Жизнеспособность клеток от обоих депо было > 90%.
6. Пеллет образцы на 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
   Примечание: Выбор протокола CD34 иммуномагнитная (см. Таблицу материалы) был адаптирован для шагов 3.7 – 3,15.
7. Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл буфера CD34 изоляции.
   Примечание: Общая клеток требуют следующие тома ресуспендирования: (a) < ячейки 2 x 10-⁷ : Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл; (b) 2 x 10 – 5 x 10⁸⁸ клеток: Ресуспензируйте гранулы в 1 мл. В шагах 3,9-3.16, были сокращены объемы реагентов, используемых для < ячейки 2 x 10-⁷ .
8. 10 мкл CD34 коктейль и Проинкубируйте образцы для 15 мин, при комнатной температуре.
9. 5 мкл магнитной бусины и Проинкубируйте образцы для 10 мин при комнатной температуре.
10. Добавить 2,5 мл буфера CD34 изоляции для каждой пробы и образцы в магнит, за 5 мин, при комнатной температуре.
11. Инвертировать магнитом для 5 s, чтобы слить изоляции буфера.
12. Удаление образцов из магнита и повторите шаги 4 x 3.10 и 3.11.
13. Снять трубку из магнита и добавить 2 мл CD34 изоляции буфера.
14. Пелле клетки на 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
15. Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл CD34 изоляции буфера и подсчитать количество ячеек.
    Примечание: Здесь, это среднее количество клеток на грамм на: (a) ом депо: 4,75 x 10⁴ ± 3,36 x 10⁴; (b) SC депо: 1,06 х 10⁴ ± 9,53 x 10³. Пластиковые immunobead CD31 протокол был адаптирован для шагов 3.16 – 3,34 (см. Таблицу материалы).
16. Пелле клетки на 500 x g 5 мин и Ресуспензируйте гранулы в 250 мкл буфера B и 250 мкл буфера мытья.
17. Тщательно Ресуспензируйте CD31 бусы, vortexing трубки.
18. 20 мкл CD31 бусы.
    Примечание: Из-за общей клетки подсчитывает > 1 x 10⁶, объем было уменьшено по данным производителя ввода.
19. Инкубируйте образца с качания на 30 мин, при комнатной температуре.
20. Прикрепите ситечко для стерильных 50 мл Конические трубки.
    Примечание: Большее открытие ситечко должны быть на вершине.
21. До разделения клеток добавьте 1 mL мыть буфера, чтобы сбалансировать ситечко. Примените смесь, сформировавшейся под шаг 3.16 ситечко.
22. Промойте ситечко с 5 мл буфера мытья в круговом движении за общим объемом 20 мл. Подключите разъем для стерильных 50 мл Конические трубки и закрыть luer-lock.
23. Подключите фильтр к разъему. Добавьте 1 mL мыть буфера вдоль стены ситечко. Добавьте 1 mL активированного буфера D вдоль стены ситечко. Вихревой мягко образца и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
24. Добавьте 1 mL мыть буфера. Отдельные клетки из бисера, закупорить вверх и вниз 10 x.
    Примечание: Избегайте создания пузырьков воздуха.
25. Откройте luer-lock и позволяют отдельные клетки впадают в 50 мл Конические трубки. Мыть сито 10 x с 1 мл буфера мыть каждый раз.
26. Удалить соединитель и сетчатый фильтр и Центрифугуйте образцы на 300 x g за 10 мин., на 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл полной ЭГМ-2 СМИ для культуры.
    Примечание: Среднее количество клеток на грамм на на данный момент это: (a) ом депо: 5,92 x 10³ ± 4,27 x 10³; (b) SC депо: 4.12 x 10³ ± 2,1 x 10³. Жизнеспособность клеток от обоих депо было свыше 90%.

4. индукция Adipogenesis в изолированных эндотелиальных клеток

1. Рост клеток в 6-хорошо лечить культуры ткани пластины с полным ЭГМ-2 СМИ в 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора. Замените носитель каждые 3 – 4 дня до 80 – 90% слияния ячеек.
   Примечание: Удвоение населения составляет 2 – 3 дня.
2. Разверните клетки путем покрытия их на чашки Петри 100 мм и разбить ячейки 1:3 раз. На этой стадии клетки находятся на проход 2.
3. Счетчик клеток с использованием автоматической клеток противостоять (см. Таблицу материалы).
4. Семя приблизительно 100 – 200 000 клеток в 6-ну пластины, обеспечение повторяющиеся скважин для каждого депо и культуры их в полный ЭГМ-2 СМИ за 2 дня.
5. Аспирационная от любого средства роста и заменить его с 2 мл DMEM/F12 с 5% FBS и 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина для управления клетки и заменить его с 2 мл Adipogenesis СМИ (см. шаг 1.4) для лечения клеток.
6. Инкубировать клетки при 37 ° C в увлажненные 5% CO₂ инкубатора для 13 дней, заменив соответствующих средств массовой информации каждые 3 до 4 дней.
   Примечание: Клетки начинают накапливаться липиды после 4 дней лечения.
7. Проведение Оро и Нил красное окрашивание согласно опубликованным методы^15–17.
8. Чтобы изолировать клетки для извлечения РНК, удалить медиафайл из 6-ну индукционных плит и мыть его с 1 мл стерильного PBS.
9. 350 мкл раствора тиоцианат фенол хлороформ guanidium (см. Таблицу материалы) для каждой хорошо и проинкубируйте его при комнатной температуре за 5 – 10 мин.
10. Скрип клетки от пластину с помощью скребка клетки и передать клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    Примечание: Образцы можно хранить в морозильной камере-80 ° C для извлечение RNA и дальнейшей обработки на более поздний срок.
11. Извлечение mRNA из примеров с использованием адаптированных РНК добыча протокола (см. Таблицу материалы).
12. Выполнять в реальном времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) для оценки экспрессии генов, используя следующие датчики: адипонектина, UCP-1 и CIDEA (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Здесь, RT-PCR были проведены процедуры с использованием следующих стандартный протокол: денатурация (95 ° C; 15 s), отжига и расширение (60 ° C; 1 мин) 40 циклов. Образцы, которые выразили генов с значения C_T > 35 были рассмотрены обнаружить.

Результаты

Наш протокол направлен на обеспечение в vitro подход для определения адипогенном потенциал CD34 + CD31 + сосудистой клетки из разных депо жировых тканях человека. Упрощенная схема схема изображена на рисунке 1A. Первый шаг, используя положительный выбор CD...

Обсуждение

В центре внимания настоящего документа – обеспечить методологию для изоляции, расширения и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от висцеральных и подкожные депо жировых тканях человека.

Методологии были зарегистрированы для изоляции эндотелиальных кле?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484