والرزن سريع فوعة جرثومية المستندة إلى الصور استخدام أميبا

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لقياس ضراوة البكتيريا العوالق أو المرفقة بالسطح باستخدام ديسكويديوم دال (الاميبا) كمضيف. فوعة يقاس مدى ح 1 والمضيف مما أسفر عن مصرع هو كمياً باستخدام التحليل المجهري والصورة الفلورية. علينا أن نظهر هذا البروتوكول باستخدام بكتيريا P. الزّنجاريّة.

Abstract

فحوصات الفوعة الجرثومية التقليدية تنطوي على التعرض لفترة طويلة للبكتيريا على مدى عدة ساعات للخلايا المضيفة. وخلال هذا الوقت، يمكن أن البكتيريا تغيرات في الفسيولوجيا بسبب التعرض لبيئة النمو المضيف ووجود خلايا المضيف. لقد طورنا فحص لقياس سرعة حالة ضراوة من البكتيريا التي تقلل من مدى التي تنمو فيها البكتيريا حضور الخلايا المضيفة. البكتيريا الزحارية مختلطة معا ومعطلة على متن طائرة واحدة تصوير باستخدام جهاز pad أجار. يستخدم الإجراء تصوير fluorescence خلية واحدة مع إستر كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص) كمؤشر على صحة الخلية المضيفة. ويتم تحليل الأسفار الخلايا المضيفة بعد ح 1 من التعرض للخلايا المضيفة للبكتيريا باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي. صورة تحليل البرمجيات المستخدمة لحساب مؤشر قتل مضيف. وقد استخدمت هذا الأسلوب لقياس ضراوة داخل العوالق والمرفقة بالسطحية الزائفة الزّنجاريّة السكان الفرعية خلال المرحلة الأولى من تشكيل بيوفيلم ويمكن تكييفها للبكتيريا الأخرى والمراحل الأخرى من النمو بيوفيلم. هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة وقوية من قياس ضراوة ويتجنب العديد من التعقيدات المرتبطة بالنمو والحفاظ على خطوط خلايا الثدييات. تعمل الفوعة تقاس هنا باستخدام الزحارية قد صودق باستخدام الماوس الضامة. على وجه الخصوص، هذا التحليل كانت تستخدم لإنشاء ذلك فوعة أوبريجولاتيس مرفق السطحية P. الزّنجاريّة.

Introduction

العدوى البكتيرية واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات في الإنسان والحيوانات^1،2. القدرة على قياس ضراوة البكتيريا في ثقافات أو الأغشية الحيوية مهم في إعدادات الرعاية الصحية والبحوث. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنوعاً وسريعة وبسيطة نسبيا لقياس الفوعة الجرثومية. وتستخدم الكائنات الحية حقيقية النواة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم (الاميبا) كنموذج الكائن المضيف. دال-ديسكويديوم قد استخدمت كمضيف لتحديد عوامل الفوعة في الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة)^3،،من⁴⁵ والأخرى البكتيريا^{6،7 ،8} وهو عرضه لالي حد كبير عوامل الفوعة ذاتها التي تقتل خلايا الثدييات بما في ذلك النوع الثالث إفراز^9،10. وأشركت فحوصات الفوعة السابقة باستخدام ديسكويديوم دال- التعرض المطول للبكتيريا مع الخلايا ديسكويديوم دال- على مدى ساعات^3،،من⁴⁵. ويقدم البروتوكول، هنا، طريقة سريعة لتحديد ضراوة استخدام هذا الاميبا. هذا البروتوكول (الشكل 1) ويصف كيفية: (1) تنمو الزحارية أكسينيكالي (في عدم وجود البكتيريا)، (2) تنمو البكتيريا للمقايسة، (3) إعداد البكتيريا والخلايا المضيفة للفحص المجهري، (4) إجراء الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي، و (5) تحليل أميبا الأسفار.

في البداية الزحارية السنة اللهب أثناء الخروج من الأرصدة المجمدة وتزرع في حديقة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)، حيث تنتج الزحارية الجراثيم. التقطت هذه الجراثيم وتلقيح إلى وسيلة إثراء لنمو أكسينيك. يتم الاحتفاظ في الزحارية من خلال النمو أكسينيك في ظروف الغنية بالمغذيات حتى أنهم على استعداد لتكون مختلطة مع البكتيريا لتقييم الفوعة الجرثومية. البقاء أو موت الزحارية هو كمياً عن طريق قياس الأسفار من كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص)، وهو المشقوق من استيراسيس داخل الخلايا، وبالتالي تنشيط للأسفار^11،12. الزحارية لايف يحمل الأسفار القليل أو لا بينما أكد وخلايا الموت فلوريس مكثف. هذه النتيجة بسبب إدراج قليلاً أو لا كالسين-صباحا إلى الزحارية صحية والتأسيس والانقسام من الركازة في الزحارية أكد¹³. يعتبر هذا السلوك خاصة متميزة من الأسفار كالسين-صباحا في خلايا الثدييات^11،14،،من¹⁵¹⁶.

وتزرع البكتيريا التي سيجري تقييم لضراوة كل على حدة. هنا، نحن تصف كيفية قياس ضراوة من مسببات الأمراض الانتهازية الزّنجاريّة P. وتفاصيل كيفية تحديدها كمياً ضراوة من العوالق (سباحة) والسكان الفرعية المرفقة بالسطح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاختبار ضراوة البكتيريا الأخرى. في مقطع النتائج الممثل، نظهر أن ضراوة تنشيط في الخلايا المرفقة بالسطح ومنخفضة في الخلايا العوالق، التي ذكرت سابقا¹³. تنشيط الفوعة المرفقة بسطح P. الزّنجاريّة يقتل الزحارية بينما الخلايا العوالق غير الخبيثة يتم استهلاكها بواسطة الزحارية. إذا كان هو فقط يجري جزيئي ضراوة البكتيريا العوالق، يمكن أن تكون البكتيريا المستزرعة في أنابيب الثقافة عادية بدلاً من استخدام أطباق بيتري كما هو مبين في البروتوكول.

يجب أن يكون نمو الزحارية والثقافات P. الزّنجاريّة منسقة مثل الثقافات P. الزّنجاريّة التوصل إلى مرحلة النمو المقصود في حين تتزايد الزحارية في حالة مستقرة في ظروف الغنية بالمغذيات. ويتطلب هذا الشرط عادة الثقافات الزحارية أن تضعف قبل 1 يوم على الأقل عندما كانت مختلطة مع البكتيريا. الزحارية والبكتيريا هي معطلة باستخدام منصات أجار، وهي شاركت المحتضنة ح 1، وتصويرها باستخدام دقة منخفضة (10 X، الفتحة العددية 0.3) بتصفية البروتينات الفلورية الخضراء، وموضوعية (التجارة والنقل)، وكاميرا تصوير. تحليل يمكن أن يؤديها باستخدام برمجيات ImageJ متاحة بحرية، أو تخصيص برنامج تحليل الصور. تم إجراء تحليلنا باستخدام البرمجيات الخاصة بنا مكتوبة باستخدام حزمة تحليل علمي¹³. ينبغي إنشاء قناع باستخدام الصورة التباين المرحلة البرنامج واستخراج القيم الأسفار من مجالات الملثمين في الصورة الفلورية. يتم حساب متوسط القيم الأسفار عبر خلايا على الأقل 100، أسفر عن مؤشر قتل مضيف عددي.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التجريبية في جامعة كاليفورنيا في إيرفين.

1-المخازن المؤقتة والحلول

1. إعداد مرق ليسوجيني (رطل) في زجاجة زجاج 1 لتر بإضافة 25 غراما مزيج رطل-ميلر في 1 لتر الماء المقطر مزدوجة (ddH₂س). لاطباق بيتري، إضافة 20 غراما إضافية من أجار. اﻷوتوكﻻف لتعقيم. صب 25 مل متوسطة أجار المنصهر في أطباق بتري سم قطرها 10 والسماح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة. تخزين وسائل الإعلام السائلة في درجة حرارة الغرفة ولوحات أجار في 4 درجات مئوية.
2. إعداد لوحات ببتون الخميرة جلوكوز (جيب) في زجاجة زجاج 1 لتر من خلط ز 1 د-الجلوكوز، وانتزاع ز 2 من ببتون، 0.25 غرام خميرة، 4.2 ز خ₂ص₄، ز 5.1 غ₂هبو₄7 ح₂س، و 25 جرام من أجار في 1 لتر من ddH₂ سين اﻷوتوكﻻف لتعقيم. صب 25 مل أجار المنصهر في أطباق بتري سم قطرها 10 والسماح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة. مخزن في 4 درجات مئوية.
3. إعداد متوسطة ببتون S (PS) في زجاجة زجاج 1 لتر بمزج 10 جرام ببتون، واستخراج 7 غرام خميرة، ز 15 د-الجلوكوز، ز 0.12 Na₂هبو₄7 ح₂س، ز 1.4 من خ₂ص₄، 40 ميكروغرام من فيتامين ب₁₂ ، و 80 ميكروغرام من حمض الفوليك في 800 مل ddH₂سين معايرة مقياس الأس الهيدروجيني إلكترونية استخدام الأس الهيدروجيني 4 ودرجة الحموضة 7 المعايير إذا لم يستخدم مقياس الأس الهيدروجيني خلال يوم واحد.
   1. قياس درجة الحموضة PS المتوسطة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. إضافة 5 م كوه أو م 5 ح₃ص₄ لضبط درجة الحموضة إلى 6.5. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام عامل تصفية O. ddH₂تعقيم 0.22 ميكرومتر فراغ تصفية باستخدام وتخزين في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الحذر مع التعديلات الأس الهيدروجيني بارتداء المعدات الواقية، بما في ذلك القفازات والملابس الواقية، وحماية العين، وتواجه الحماية.
4. إعداد 10 × التنمية المخزن المؤقت لرئيس الوزراء (DB ') مخزن في زجاجة زجاج 1 لتر بإضافة 3.4 ز خ₂ص₄، ز 13.4 غ₂هبو₄ 7 ح₂س، و ddH₂س إلى إجمالي حجم 800 مل. معايرة مقياس الأس الهيدروجيني إلكترونية استخدام الأس الهيدروجيني 4 ودرجة الحموضة 7 المعايير إذا لم يستخدم مقياس الأس الهيدروجيني خلال يوم واحد.
   1. قياس درجة الحموضة من المخزن المؤقت باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الإلكترونية. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.5 بلطف إضافة 5 م كوه أو م 5 ح₃ص₄ حسب الحاجة. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام ddH₂س وتعقيمها قبل التعقيم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الحذر مع التعديلات الأس الهيدروجيني بارتداء المعدات الواقية، بما في ذلك القفازات والملابس الواقية، وحماية العين، وتواجه الحماية.
5. جعل 1 × التنمية المخزن المؤقت (DB) بخلط 100 مل 10 × DB ' المخزن المؤقت مع 1 مل من تعقيم مجكل م 2₂، و 1 مل من تعقيم كاكل 1 م₂. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر في زجاجة 1 لتر باستخدام ddH معقم يعقم₂"مخزن سين" في درجة حرارة الغرفة.
6. إعداد متوسطة PS:DB في زجاجة زجاج 1 لتر بخلط 100 مل من تعقيم PS المتوسطة، وتعقيم 100 مل من 10 × DB ' المخزن المؤقت، وتعقيم ddH₂س إلى إجمالي حجم 1 ل. الملحق مع 1 مل من تعقيم مجكل م 2₂ و 1 مل من تعقيم 1 م كاكل ₂-مخزن في 4 درجات مئوية.
7. إعداد الحل الأسهم صباحا كالسين بإضافة 50 ميليلتر من [دمس] إلى 50 ميكروغرام من كالسين-صباحا في حاوية بلاستيكية تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة. مخزن في-20 درجة مئوية.

2-النمو والحفاظ على الزحارية

1. تنمو سلالة كولاي B/r¹⁷ كمصدر لغذاء الزحارية خلال فترة النمو الأولى. الانتصارات كولاي B/r من أسهم مجمدة مخزنة في-80 درجة مئوية على صفيحة أجار رطل واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحصول على مستعمرات واحدة.
2. تطعيم مستعمرة واحدة من كولاي B/r إلى 2 مل متوسطة رطل واحتضان في طبل اسطوانة أو شاكر على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3. تجلب بين عشية وضحاها كولاي الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام عصا خشبية، تطعيم الزحارية من أسهم مجمدة تحفظ في-80 درجة مئوية إلى 750 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: استخدام ديسكويديوم دال- سلالة AX3، وقادرة على النمو أكسينيك¹⁸. لا تتطلب هذه الخطوة النمو أكسينيك، ولكن الخطوات اللاحقة له الشرط.
4. فور إضافة 700 ميليلتر الزحارية-كولاي الخليط على صفيحة ببتون خميرة جلوكوز (جيب). نشر ثقافة بالتساوي على سطح اللوحة عن إمالة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب حسب الحاجة. تجنب استخدام الناشرة.
5. ضع لوحة جيب مع أجار مواجها لأعلى في مربع الذي يحافظ على رطوبة عالية. استخدام الحاويات البلاستيكية المتاح اثنين (183 سم × 183 سم × 91 سم) مكدسة أعلى بعضها البعض. ملء حاوية أسفل مع حوالي 25 مل من الماء ومكان أعلى الحاوية مع حفر من خلال الأرضيات الحاوية للسماح للرطوبة للانتقال من خزان المياه إلى أعلى الحاوية عدة ثقوب قطرها سم 0.5.
6. احتضان لوحة جيب ومربع عند 22 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام حتى تحترم جراثيم أميبا المتنامية بالقرب من سطح اللوحة (الشكل 2). استخدام حاضنة مبردة لاحتضان لوحات بدلاً من حضانة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: بعد أن نمت جراثيم، تظل قابلة للتطبيق على لوحات لعدة أسابيع عند تخزينها في 4 درجات مئوية. تخزين اللوحات مع الجانب أجار مواجها لأعلى. بعد 3-4 أيام للحضانة، يمكن ملاحظة مناطق لتطهير داخل الحديقة البكتيرية، التي تشير إلى بدء تبوغ أميبا.
   1. مراقبة الزحارية الصغيرة جراثيم فوق سطح اللوحة بعد 4-5 أيام للحضانة (الشكل 2).
      ملاحظة: لا تنمو الزحارية لمدة أطول من أسبوع، كما يقلل من نوعية الجراثيم خارج هذه الفترة الزمنية.
7. جمع الجراثيم الزحارية للتحضير لنمو أكسينيك الزحارية التي تجتاح تلميح ماصة معقمة 1 مل موازية لسطح اللوحة. جمع الجراثيم من نصف 10 سم طبق بيتري.
   ملاحظة: تجنب ملامسة تلميح إلى سطح لوحة أجار كهذا الاقتراح سيتم جمع أعدادا كبيرة من كولاي.
8. ريسوسبيند الزحارية في تلميح الماصة أغرق في التلميح إلى 1 مل من PS المتوسطة ولطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
9. نقل الخليط الملقحين في قارورة 250 مل التي تحتوي على 25 مل PS المتوسطة وتستكمل مع الحل مضاد حيوي فطري 0.25 x تركيز.
   ملاحظة: تخزين الحل مضاد حيوي فطري ك 250 ميليلتر مختبرين في-20 درجة مئوية. تجنب دورات متكررة من ذوبان الجليد وتجميد هذا الحل، وهذا قد يقلل من فعاليته.
10. تنمو الزحارية أكسينيكالي عند 22 درجة مئوية في شاكر الدورية 100 لفة في الدقيقة. للمقايسة الفوعة في الخطوة 5، تنمو خلايا لكثافة بصرية قياس 600 نانومتر (OD₆₀₀) من 0.2 إلى 0.5.
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة 3-4 أيام نمو من وقت التطعيم (الخطوة 2.7). إذا كانت الخلايا نمت بكثافة أعلى، تضعف ثقافة العودة في المتوسطة PS OD₆₀₀ 0.05 أو أقل وتنمو مرة أخرى ل التطوير التنظيمي₆₀₀ من 0.2 إلى 0.5.

3-نمو P. الزّنجاريّة

1. اختيار مستعمرة واحدة من P. الزّنجاريّة من صفيحة رطل وتطعيم أنه في 2 مل الثقافة PS:DB، وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للتشبع.
   ملاحظة: لا إضافة الحل مضاد حيوي فطري لوسائل الإعلام PS:DB.
2. تمييع بين عشية وضحاها الثقافة 1: 100 أو 1:1,000 في طبق بتري قطرها 6 سم باستخدام PS:DB. إذا كان هو فقط يجري جزيئي الفوعة الخلايا العوالق، تنمو الثقافات بدلاً من ذلك باستخدام أنابيب الثقافة التقليدية. اهتز الثقافة على محور دوار benchtop تعيين 100 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. حصاد الثقافات في نقطة زمنية معينة لضمان إمكانية تكرار نتائج. في 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل تقييم الفوعة، إعداد جهاز pad أجار كما هو موضح في القسم 4.
   ملاحظة: هو الناجم عن ضراوة في P. الزّنجاريّة حوالي 8 ح النمو على السطوح.
4. لعزل الخلايا المرفقة بالسطح، إزالة المتوسطة السائل من طبق بيتري وتغسل فورا مع 1 مل من المخزن المؤقت DB لإزالة الخلايا العوالق، والشروع فورا في الخطوة 5، 1.
   تنبيه: لا تغسل أطول من 30 ثانية كهذا سوف التشويش وفصل الخلايا المرفقة بالسطح وقد تؤثر على قياس ضراوة.
5. لعزل الخلايا العوالق، نقل 10 ميليلتر للثقافة من طبق بيتري إلى طبق بتري نظيفة والشروع فورا في الخطوة 5، 1.

4-الفحص المجهري-إعداد لوحة المفاتيح أجار

1. إعداد منصات أجار حوالي 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل الزحارية على استعداد لتكون مختلطة مع P. الزّنجاريّة.
2. الموجات الدقيقة 50 مل أجار 1% (w/v) في المخزن المؤقت DB في قارورة 250 مل. مزيج كل 20 ثانية حتى كتل من أجار تختفي.
3. بارد أجار المنصهر بوضعه في حوض ماء مسخن 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4. إضافة 15 ميليلتر من الحل الأسهم كالسين-صباحا إلى 15 مل أجار المنصهر في أنبوب مخروطي. المزيج بلطف عكس الأنبوب 4-5 مرات والشروع فورا في الخطوة التالية.
   ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في أنبوب الطرد مركزي البوليبروبيلين 15 مل. عدم استخدام حاوية زجاج سميك كما سيؤدي هذا أجار يصلب بسرعة كبيرة جداً.
5. صب الخليط المنصهر أجار على رأس لوحة زجاج 12 × 10 سم وتسمح أجار يصلب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قطع لوح أجار طدت إلى مقاطع أصغر 1.5 × 1.5 سم بوضع لوحة زجاج عبر شبكة مطبوعة وقطع على طول الشبكة باستخدام مسطرة معدنية.
6. تبقى هلام رطب في مربع رطبة حتى يكون جاهزاً للاستخدام.

5-الفحص المجهري-إعداد نموذج الاميبا البكتيريا للتصوير

1. للاعتداء ضراوة المرفقة بسطح الخلايا البكتيرية، إضافة 10 ميليلتر من خلايا الاميبا من الخطوة 2.10 إلى البكتيريا التي تعلق على سطح من الخطوة 3، 4.
   ملاحظة: هذه الخطوة وصف اختلاط الزحارية مع البكتيريا.
2. للاعتداء ضراوة الخلايا العوالق، يخلط 10 ميليلتر من خلايا الاميبا من الخطوة 2.10 10 ميليلتر من البكتيريا العوالق من الخطوة 3، 5.
   ملاحظة: لا تغسل الخلايا أميبا نابعة من أكسينيكالي (في OD₆₀₀ من 0.2 إلى 0.5) قبل الاختلاط مع البكتيريا. أي نمو كولاي سيتبع في ثقافة أميبا نتيجة لاستخدام الحل مضاد حيوي فطري.
3. فورا وضع لوحة أجار كالسين-ص 1.5 × 1.5 سم من الخطوة 4، 5 أعلى الخليط أميبا البكتيريا على سطح طبق بيتري.
   ملاحظة: وضع لوحة أجار على رأس المخلوط حركة سلسة سريعة باستخدام. لن تقلل لوحة المفاتيح ببطء على الخليط من هذه الحركة تميل إلى دفع الخلايا نحو المحيط وبعيدا عن الجانب السفلي من لوحة المفاتيح. هذه الخطوة سيتم التأكد من وجود البكتيريا والزحاريه بالتساوي مختلطة، معطلة وأن كليهما الخلية أنواع تقتصر على متن نفس الطائرة.
4. إزالة السائل الزائد بلطف بيبيتينج بها أي سائل المتبقية المحيطة بلوحة أجار. تسمح طبق بيتري لتجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. تغطي بطبق بيتري مع غطاء واحتضان البكتيريا أميبا المعطل تداولها الخليط في درجة حرارة الغرفة لدقيقة 40 إضافية المضي قدما إلى الخطوة 6، 1.
   ملاحظة: من المهم لاحتضان جميع العينات لنفس المقدار من الوقت، كما يزيد fluorescence الخلفية مع مرور الوقت. ويوصي بفترة حضانة من ح 1. إينكوبيشنز لمدة أطول من ح 1 أقل استنساخه كما قد تبدأ الخلايا الزحارية إلى انفجار.

6-الفحص المجهري--الحصول على الصور

1. الزحارية الصورة باستخدام مجهر الأسفار قادرة على جلب الصور الفلورية برايتفيلد والأخضر. الفلورية الخضراء، استخدام مرشحات البروتين (بروتينات فلورية خضراء) الفلورية الخضراء مع 474/27 نانومتر و 525/45 نانومتر للإثارة والانبعاثات، على التوالي. استخدم هدفا (≥0.3 فتحه عددية) X 10 للصورة في الزحارية.
   ملاحظة: سيؤدي كالسين-صباحا في أجار الزحارية الموت للأسفار في قناة الفلورية الخضراء. خلاف ذلك، لا تكون الزحارية صحية الفلورسنت.
2. ضبط أوقات اكتساب للتباين المرحلة، قنوات التجارة والنقل الحد من الضيائية، وتحسين النطاق الديناميكي لكثافة الصورة. تحل محل التباين مرحلة التباين (DIC) فرق التدخل إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: استخدام ms 100-200 التعرض لمرحلة التباين والأسفار بروتينات فلورية خضراء إذا كان ذلك ممكناً. الاحتفاظ بإعدادات التعرض والصك دون تغيير طوال هذه التجربة كاملة. هذا أمر بالغ الأهمية للحوسبة في فهرس قتل المضيف.
3. الحصول على الصور لخلايا الاميبا على الأقل 100 بغية الحصول على إحصاءات جيدة لحساب المضيف فهرس القتل.

7-صورة مؤشر قتل المضيف والتحليل

1. أداء تحليل الصور باستخدام إيماجيج.
2. فتح ملف الصورة التباين المرحلة في إيماجيج عن طريق النقر على الملف | فتح وتحديد الصورة. ضبط العتبة بالنقر فوق صورة | تحليل | عتبة. ضبط العتبة السفلي والعلوي لتحديد ذروة شدتها فقط (الشكل 3أ).
3. تحويل الصورة إلى ثنائي بالنقر فوق عملية | ثنائي | جعل ثنائي. ملء الثغرات عن طريق تحديد عملية | ثنائي | ملء الثقوب.
   ملاحظة: باستخدام الصورة في الشكل 1 كالمصدر، ستنتج الخطوات 7.1 7.2 صورة تظهر فيها الزحارية والمرفقة بسطح البكتيريا كمناطق مظلمة (الشكل 3ب).
4. ضمان أن يتم التحقق من المربعات المنطقة و يعني قيمة الرمادي في تحليل | تعيين قياسات. قياس الحجم التقريبي الزحارية بتحديد أداة البيضاوي على شريط الأدوات الرئيسي. انقر فوق تحليل | قياس وملاحظة منطقة الزحارية الممثل.
5. إنشاء أقنعة الزحارية عن طريق النقر فوق تحليل | تحليل الجزيئات. في مربع الحجم، قم بإدخال المنطقة التي سوف تدرج في الزحارية لكن استبعاد البكتيريا. حدد أقنعة في شريط القوائم المنسدلة إظهار الخيار. تأكد من أن يتم التحقق من المربع إضافة إلى مدير .
6. انقر فوق موافق وصورة تظهر فقط في الزحارية وهو مدير العائد على الاستثمار سوف يظهر مربع حوار (الشكل 3ج).
7. فتح الصورة الفلورية باستخدام الملف | فتح واختيار الملف المناسب. تحديد جميع المناطق في إدارة العائد على الاستثمار بالضغط باستمرار على المفتاح Shift والنقر على كل منطقة في القائمة (الشكل 3د).
8. انقر فوق زر الإجراء في إدارة العائد على الاستثمار. سيؤدي هذا إلى فتح إطار نتائج عرض قيمة كثافة يعني كل أميبا.
9. نسخ قيم الأسفار كل أميبا في برنامج جدول بيانات وحساب المضيف قتل المؤشر بأخذ متوسط جميع الأسفار القيم.

النتائج

ونحن نمت البرية من نوع P. الزّنجاريّة سلالة PA14¹⁹ أو Δﻷسر سلالة²⁰ في نفس الخلفية PA14 في أطباق بتري سم قطرها 6 وجزيئي الفوعة من العوالق والمرفقة بسطح الخلايا. الثقافات تم تلقيح من مستعمرات واحدة في الثقافات PS:DB، نمت بين عشية وضحاها في أنابيب ?...

Discussion

هذا البروتوكول وصف أسلوب سريع والكمية الاعتداء الفوعة في P. الزّنجاريّة. ويمكن اختبار هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى. ومع ذلك، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن متوسط النمو ينبغي أن تكون متوافقة مع ظروف النمو أميبا. على وجه الخصوص، نحن الأمثل البروتوكول باستخدام PS:DB كوسيلة النمو الج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated	BD Difco	214010
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Yeast extract	Oxoid	LP0021
Special peptone	Oxoid	LP0072
Potassium hyroxide	Fisher Chemical	P250
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE	For filter sterilization
Conical tube, 15 mL	Corning	352097
Glass storage bottles	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter	Corning	351007	60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid	Ziploc	2.57E+09	Square 3-cup containers
Glass plates	Bio-Rad	1653308	For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks	Fisher	23-400-102
Equipment
Eclipse Ti-E microscope	Nikon	MEA53100	Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA	Nikon	MRH20101	Microscope setup
Fluorescence excitation source	Lumencor	Sola light engine	Microscope setup
Fluorescence filter set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera	Hamamatsu	77054098	Microscope setup
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software for image analysis
MATLAB	Mathworks	R2013	Software for image analysis
Orbital shaker incubator	VWR	89032-092	For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker	Fisher	13-687-700	For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator	Fisher	97990E	For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath	Fisher	15-462-21Q	For cooling media to 55 °C