וזמינותו התקפה אלימה חיידקי מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התקפה אלימה של חיידקים פלנקטוניים או צמוד-השטח באמצעות discoideum ד (אמבה) כמחשב מארח. התקפה אלימה נמדד על פני תקופה של 1 h, המארח הורג הוא לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח התמונה. נדגים את פרוטוקול זה באמצעות החיידק aeruginosa פ.

Abstract

מבחני התקפה אלימה חיידקי מסורתי לערב חשיפה ממושכת של חיידקים במשך מספר שעות, התאים המארחים. במהלך תקופה זו, חיידקים יכולים לעבור השינויים בפיזיולוגיה עקב החשיפה לסביבת הגידול מארח ואת נוכחותם של התאים מארח. פיתחנו assay למדוד במהירות את מצב התקפה אלימה של חיידקים כי למזער את מידת שאליו הבקטריה גדלה בנוכחות התאים המארחים. חיידקים, amoebae מעורבבים יחד, ותשמרו על מטוס יחיד הדמיה באמצעות רכיב pad אגר. ההליך משתמש פלורסצנטיות בתא יחיד הדמיה עם אסתר calcein-acetoxymethyl (calcein-AM) כמחוון של בריאות התא המארח. ידי קרינה פלואורסצנטית של התאים המארחים ניתוח לאחר h 1 של חשיפה של התאים המארחים חיידקים באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. התמונה ניתוח תוכנה משמשת לחישוב בעל אינדקס הרג המארח. בשיטה זו נעשה שימוש כדי למדוד התקפה אלימה בתוך פלנקטוניים ומחוברת משטח Pseudomonas aeruginosa תת אוכלוסיות במשך השלב ההתחלתי של ביופילמים, שעשוי להיות מותאם חיידקים אחרים ושלבים אחרים biofilm הצמיחה. פרוטוקול זה מספק שיטה מהיר וחזק של מדידת התקפה אלימה, מונע רבים של המורכבויות המשויכות את הצמיחה ואת התחזוקה של שורות תאים בתרבית. התקפה אלימה פנוטיפים נמדד כאן באמצעות amoebae יש גם מאומתים באמצעות העכבר מקרופאגים. בפרט, זה וזמינותו שימש להקים את התקפה אלימה upregulates מצורף משטח aeruginosa פ.

Introduction

זיהום חיידקי הוא אחד הגורמים המובילים התמותה האדם וחיות^1,2. היכולת למדוד התקפה אלימה של חיידקים תרבויות או biofilms חשוב הגדרות בריאות ומחקר. כאן, אנו מתארים שיטה רב תכליתי, מהירה, פשוטה יחסית לכמת התקפה אלימה חיידקי. האורגניזם האיקריוטים Dictyostelium discoideum (אמבה) משמש האורגניזם המארח מודל. ד discoideum שימש כמארח כדי לזהות גורמים התקפה אלימה Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ)^3,4,5 ו אחרים חיידקים^{6,7 ,8} , היא חשופה בעיקר אותם התקפה אלימה גורמים להרוג תאים בתרבית של כולל סוג III הפרשת^9,10. מבחני התקפה אלימה הקודם באמצעות discoideum ד מעורב חשיפה ממושכת של חיידקים עם תאים discoideum ד במהלך שעות^3,4,5. הפרוטוקול, כאן, מציג שיטה מהירה של קביעת התקפה אלימה באמצעות זה אמבה. פרוטוקול זה (איור 1) מתאר כיצד: (1) לגדל את amoebae axenically (בהיעדרו של חיידקים), (2) לגדול חיידקים על וזמינותו, (3) להכין חיידקים, התאים המארחים עבור מיקרוסקופ, (4) לבצע epifluorescence מיקרוסקופ, ולנתח (5) אמבה קרינה פלואורסצנטית.

Amoebae בתחילה קווצות שער החוצה מן המלאי קפוא, גדל על מדשאה של Escherichia coli (e. coli), שבו amoebae מייצרים נבגים. הנבגים האלו הם הרים, מחוסן לתוך בינוני מועשר לצמיחה axenic. Amoebae מתוחזקים באמצעות צמיחה axenic בתנאים עשירות עד שהם יהיו מוכנים להיות מעורב עם חיידקים להערכה של התקפה אלימה חיידקי. ההישרדות או מותו של amoebae זה לכמת על ידי מדידה של זריחה של calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), אשר הוא ביקע מאת תאיים esterases, ובכך, מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית^11,12. Amoebae חיה להפגין מעט או ללא קרינה פלואורסצנטית ואילו הדגיש, תאים הגוסס לזרוח באופן אינטנסיבי. תוצאה זו נובעת תיאגוד מעט או ללא calcein-אם amoebae בריאה, התאגדות, המחשוף של המצע לחוץ amoebae¹³. התנהגות זו היא בעיקר נבדלת זריחה calcein-אם תאים בתרבית של^11,14,15,16.

חיידקים ייבחנו על התקפה אלימה גדלים בנפרד. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את התקפה אלימה של המחלה הזדמנותית aeruginosa פ וכן פירוט איך לכמת את התקפה אלימה של יצורי (שחייה), צמוד-פני אוכלוסיות משנה. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם כדי לבדוק את התקפה אלימה של חיידקים אחרים. במקטע תוצאות נציג, אנו מראים כי התקפה אלימה מופעלת בצמוד-משטח תאים והוא נמוך פלנקטוניים תאים, אשר דווחה בעבר¹³. מופעל התקפה אלימה צמוד-משטח aeruginosa פ הורג amoebae ואילו-מידבק תאים פלנקטוניים שנצרכים על ידי amoebae. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של יצורי חיידקים, חיידקים יכולים להיות בתרבית צינורות רגילים תרבות יותר מאשר באמצעות צלחות פטרי כמפורט בפרוטוקול.

הצמיחה של amoebae ותרבויות aeruginosa פ חייבים להיות מתואמים כך aeruginosa פ תרבויות להגיע שלב הצמיחה המיועד ואילו amoebae גדלים על מצב יציב בתנאים עשירות. מצב זה מחייב בדרך כלל amoebae תרבויות אלקליניים לפחות יום אחד לפני כאשר הם מעורבבים עם חיידקים. Amoebae וחיידקים הם מתאושש באמצעות רפידות אגר, שיתוף incubated לשעה, עם תמונה ברזולוציה נמוכה (10 X, מפתח נומרי 0.3) חלבון פלורסצנטיות אובייקטיבי, ירוק (GFP) מסננים באמצעות מצלמה הדמיה. הניתוח יכול להתבצע באמצעות תוכנת ImageJ זמינה בחופשיות או אישית התמונה ניתוח תוכנה. הניתוח שלנו בוצעה באמצעות התוכנה שלנו שנכתבו באמצעות חבילת¹³ניתוח מדעי. התוכנה צריכה ליצור מסיכה באמצעות שלב חדות התמונה, לחלץ ערכים זריחה האזורים עם מסיכה בתמונה זריחה. קרינה פלואורסצנטית ערכים הם בממוצע לפחות מאה תאים, וכתוצאה מכך אינדקס הרג מארח מספריים.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני בוצעו ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין.

1. מאגרי ופתרונות

1. להכין מרק Lysogeny (LB) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 25 גרם מיקס LB-מילר 1 ליטר של מים מזוקק פעמיים (ddH₂O). צלחות פטרי, הוסיפו של 20 גרם נוספים של אגר. אוטוקלב לחטא. יוצקים 25 מ של אגר מותכת בינוני 10 ס מ קוטר פטרי ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. לאחסן מדיה נוזלי בטמפרטורת החדר, פלטות אגר ב 4 º C.
2. הכנת לוחות Peptone שמרים גלוקוז (באסה) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 1g של D-גלוקוז, 2 גר' peptone, 0.25 g של שמרים לחלץ, 4.2 גר'₂פו ח'₄, g 5.1 של נה₂HPO₄7 שעות₂O ו- 25 גרם אגר ב- 1 ליטר של ddH₂ או אוטוקלב לחטא. שופכים 25 מ של אגר מותכת לתוך צלחות פטרי בקוטר ס מ 10 ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. חנות ב 4 º C.
3. הכנת Peptone S (PS) בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 10 גרם של peptone, 7 גר' שמרים לחלץ, 15 גרם של D-גלוקוז, 0.12 גר' נה₂HPO₄7 שעות₂O, 1.4 גר'₂פו ח'₄, 40 µg של ויטמין B₁₂ , ו- 80 µg חומצה פולית 800 מיליליטר ddH₂O. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.
   1. למדוד את רמת החומציות של המדיום PS באמצעות מד pH. להוסיף 5 מ' קו או 5 מ' H₃פו₄ כדי להתאים את ה-pH ל 6.5. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH₂O. מסנן לחטא באמצעות מסנן ואקום מיקרומטר 0.22 ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.
4. הכינו 10 x פיתוח מאגר ראשוני (DB') מאגר בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 3.4 גרם₂פו ח'₄, 13.4 גר' נה₂HPO₄ 7 שעות₂O ו- ddH₂O הנפח הכולל של 800 מ ל. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.
   1. למדוד את רמת החומציות של המאגר באמצעות מד pH אלקטרוני. להתאים את ה-pH ל 6.5 על-ידי הוספת בעדינות 5 מ' קו או 5 מ' H₃פו₄ לפי הצורך. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH₂O ולחטא על-ידי autoclaving. לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.
5. להפוך 1 x פיתוח מאגר (DB) על-ידי ערבוב 100 מ של 10 x DB' מאגר עם 1 מ"ל של עיקור MgCl 2 מ'₂, 1 מ"ל של עיקור CaCl 1 מ'₂. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר בתוך בקבוק זכוכית 1 ליטר באמצעות ddH סטיריליים בלוק של₂O. חנות בטמפרטורת החדר.
6. הכנת PS:DB בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 100 מ של מדיום PS מעוקר, 100 מ של עיקור 10 x DB' מאגר, ו- ddH סטיריליים₂O כדי הנפח הכולל של 1 ל' השלמה עם 1 מ"ל של עיקור 2 מ' MgCl₂ ו 1 מ"ל של עיקור מ' 1 CaCl ₂-חנות ב 4 º C.
7. להכין את הפתרון מניות calcein-אם על-ידי הוספת µL 50 של דימתיל סולפוקסיד 50 µg של calcein-אם במכל פלסטיק המסופקים על ידי היצרן. חנות ב-20 ° C.

2. צמיחה ותחזוקה של Amoebae

1. לגדל זן e. coli B/r¹⁷ כמקור מזון עבור amoebae במהלך תקופת הגידול הראשוני. רצף של e. coli B/r של מניה קפוא המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשיג אחת המושבות.
2. לחסן מושבה בודדת של e. coli B/r לתוך 2 מ ל LB בינוני, דגירה תוף רולר או מטרף ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. להביא e. coli תרבות הלילה טמפרטורת החדר. באמצעות מקל עץ, לחסן amoebae של מניה קפוא שמרו ב-80 מעלות צלזיוס לתוך µL 750 של התרבות בין לילה.
   הערה: שימוש discoideum ד זן AX3, בעל יכולת של צמיחה axenic¹⁸. שלב זה אינו מחייב צמיחה axenic, אבל והשלבים יהיה הדרישה שלו.
4. מיד להוסיף 700 µL של amoebae -e. coli התערובת לצלחת Peptone שמרים גלוקוז (ג'יפ). להפיץ את התרבות באופן שווה על פני השטח של הצלחת בהטיית גב וושוב גם הוא צד אל צד כנדרש. הימנע משימוש מפזר.
5. מקם את הצלחת ללמוד עם אגר פונה כלפי מעלה בתוך קופסה השומר על לחות גבוהה. שימוש שני מיכלי פלסטיק חד פעמיות (183 ס"מ על 183 ס"מ x 91 ס מ) נערמו בראש אחד את השני. למלא את המיכל התחתון כ 25 מ ל מים ומניחים את המיכל העליון עם כמה פתחים 0.5 ס מ קוטר קדח דרך הריצוף של המיכל כדי לאפשר לחות להעביר המים הקרים המיכל העליון.
6. תקופת דגירה של ג'יפ צלחת ותיבת ב 22 ° C של 4-5 ימים עד אמבה נבגים הם נצפו גדל קרוב לפני השטח של הצלחת (איור 2). השתמש חממה בקירור כדי דגירה צלחות ולא הדגירה בטמפרטורת החדר.
   הערה: לאחר נבגים גדלו, הם נשארים קיימא על צלחות למשך מספר שבועות כאשר הוא מאוחסן ב 4 º C. חנות את הלוחיות עם אגר צד פונה כלפי מעלה. לאחר 3-4 ימי דגירה, אזורי, אגף בתוך הדשא חיידקי יכול להיות שנצפו, מעידות על תחילת הנבגה אמבה.
   1. שימו לב amoebae קטן נבגים מעל פני השטח צלחת אחרי 4-5 ימי דגירה (איור 2).
      הערה: לא גדלים על amoebae במשך יותר משבוע, ככל שאיכות הנבגים הקטנת מעבר פרק זמן זה.
7. איסוף amoebae נבגים כדי להתכונן הגידול axenic של amoebae מאד טיפ פיפטה עקר 1 מ"ל מקביל פני השטח של הצלחת. לאסוף חצי של 10 ס מ פטרי נבגים.
   הערה: להימנע מלגעת בקצה השטח של צלחת אגר תנועה זו לאסוף מספר רב של e. coli.
8. Resuspend את amoebae על קצה פיפטה על ידי הטבעית הטיפ לתוך 1 מ"ל של PS בינוני בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
9. להעביר את התערובת חוסנו לתוך בקבוקון 250-mL המכיל 25 מ של המדיום PS בתוספת הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic-0.25 x ריכוז.
   הערה: אחסן את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic כמו aliquots µL 250 ב-20 ° C. הימנע מחזורים חוזרים ונשנים של מפשיר, הקפאה של פתרון זה כמו זו עלולה להפחית את יעילותה.
10. לגדול amoebae axenically ב 22 ° C ב שייקר מסתובב ב 100 סל"ד. עבור וזמינותו התקפה אלימה בשלב 5, מגדלים תאים צפיפות אופטית הנמדד על 600 nm (OD₆₀₀) של 0.2 עד 0.5.
    הערה: שלב זה דורש 3-4 ימים של גידול מימי חיסון (שלב 2.7). אם התאים גדלו צפיפות גבוהה יותר, לדלל את התרבות בחזרה ב- PS בינוניים יתר₆₀₀ של 0.05 או נמוך, לגדול חזרה יתר₆₀₀ של 0.2-0.5.

3. צמיחת aeruginosa פ

1. לבחור מושבה בודדת של aeruginosa פ מ צלחת LB לחסן אותו לתוך 2 מ ל PS:DB תרבות, לגדול בין לילה ב 37 ° C כדי רוויה.
   הערה: לא להוסיף את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic לתקשורת PS:DB.
2. לדלל את בטחונות תרבות לילה או 1:1,000 לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 ס מ באמצעות PS:DB. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, לגדול תרבויות באמצעות צינורות תרבות המקובלת במקום. נתנער התרבות rotator benchtop שוכן בגובה 100 סל"ד ב 37 º C.
3. קציר תרבויות בנקודות זמן מסוים כדי להבטיח הפארמצבטית. ב- 30 דקות עד h 1 לפני הערכת התקפה אלימה, להכין את רכיב pad אגר כמתואר בסעיף 4.
   הערה: התקפה אלימה ב פ aeruginosa הנגרמת על ידי כ 8 שעות של צמיחה על משטחים.
4. כדי לבודד את תאי השטח-attached, להסיר את המדיום הנוזלי הפטרי לשטוף מיד עם 1 מ ל DB המאגר כדי להסיר תאים פלנקטוניים, פנה/י מיד לשלב 5.1.
   התראה: אנחנו לא שוטפים יותר מ 30 s כמו זה perturb, ניתוק צמוד-משטח תאים, עשוי להשפיע על המדידה התקפה אלימה.
5. בידוד תאי פלנקטוניים, להעביר 10 µL של התרבות צלחת פטרי צלחת פטרי נקי, פנה/י מיד לשלב 5.1.

4. מיקרוסקופ - הכנת משטח אגר

1. להכין רפידות אגר בערך 30 דקות ל- 1 h לפני amoebae מוכנים להיות מעורב עם aeruginosa פ.
2. מיקרוגל 50 מ של 1% (w/v) אגר במאגר DB בבקבוקון 250 מ. לערבב כל 20 s עד גושים של אגר נעלמים.
3. מגניב של אגר מותכת על-ידי הצבתו באמבט מים טרופה 55 ° צלזיוס למשך 15 דקות.
4. להוסיף µL 15 של הפתרון מניות calcein-אם-15 מיליליטר אגר מותכת צינור חרוטי. לערבב על-ידי היפוך בעדינות את הצינור 4 - 5 פעמים, פנה/י מיד לשלב הבא.
   הערה: לבצע שלב זה בשפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל. אל תשתמש/י מיכל זכוכית עבה כמו זה יגרום את אגר שבמהלכו מהר מדי.
5. שופכים את התערובת אגר מותכת על גבי צלחת זכוכית 12 ס"מ x 10 ס"מ ולאפשר את אגר שבמהלכו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחתוך משטח אגר הקרושה למקטעים קטנים יותר של 1.5 ס מ x 1.5 ס מ על ידי הצבת לוח הזכוכית על רשת מודפסת חיתוך לאורך הרשת בעזרת סרגל מתכת.
6. שמור את הג'ל להתייבש בתוך קופסה לחים עד שזה מוכן לשימוש.

5. מיקרוסקופ - הכנת המדגם חיידקים-אמבה עבור הדמיה

1. כדי assay של התקפה אלימה של צמוד-משטח תאים חיידקיים, להוסיף 10 µL של תאים אמבה מהשלב 2.10 צמוד-השטח חיידקים מהשלב 3.4.
   הערה: שלב זה מתאר את ערבוב של amoebae עם חיידקים.
2. כדי assay של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, מערבבים µL 10 תאים אמבה מהשלב 2.10 עם 10 µL של חיידקים פלנקטוניים מהשלב 3.5.
   הערה: לא רחץ את התאים אמבה תוצרת axenically (-יתר₆₀₀ של 0.2 עד 0.5) לפני ערבוב עם החיידקים. אין התפתחות החיידק יתקיימו בתרבות אמבה עקב השימוש של הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.
3. מיד במקום משטח אגר calcein-אם 1.5 ס מ x 1.5 ס מ שלב 4.5 מעל תערובת חיידקים-אמבה על פני צלחת פטרי.
   הערה: מקום משטח אגר מעל התערובת באמצעות תנועה חלקה מהירה. אל תסירו משטח לאט לתוך התערובת כמו תנועה זו נוטה לקדם תאים לעבר הפריפריה, מן החלק התחתון של משטח. שלב זה יבטיח כי חיידקים, amoebae הם אחיד מעורב, ללא יכולת תנועה וסלולרי כי שני סוגי מוגבלים על אותו מישור.
4. להסיר עודפי נוזלים על-ידי pipetting בעדינות את כל הנוזל הנותר סביב משטח אגר. לאפשר הפטרי לייבוש למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
5. מכסה עם הפטרי עם מכסה, דגירה התערובת אמבה קיבוע-חיידקים בטמפרטורת החדר במשך נוספים 40 דקות להמשיך לשלב 6.1.
   הערה: חשוב דגירה כל דוגמאות עבור אותה כמות של זמן, כמו עליות פלורסצנטיות רקע לאורך זמן. זמן הדגירה של 1 h מומלץ. Incubations יותר מ 1 h הם פחות לשחזור כפי amoebae תאים עשויים להתחיל פרץ.

6. מיקרוסקופ - ייבוא תמונות

1. Amoebae תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מסוגל לרכוש תמונות זריחה brightfield וירוק. עבור ירוק פלורסצנטיות, השתמש במסננים חלבון (GFP) זריחה ירוק עם 474/27 nm ו 525/45 ננומטר עירור, פליטה, בהתאמה. השתמש מטרה (≥0.3 מפתח נומרי) X 10 כדי amoebae את התמונה.
   הערה: calcein-AM באגר תגרום amoebae גוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית בערוץ פלורסצנטיות ירוק. Amoebae בריא אינם אחרת פלורסנט.
2. להתאים את רכישת פעמים לניגודיות שלב, ערוצי ה-GFP כדי להגביל את phototoxicity, ולמטב את הטווח הדינמי של התמונה עוצמות. החלף את הניגוד שלב ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית במידת הצורך.
   הערה: השתמש חשיפות 100-200 ms עבור שלב חדות, זריחה GFP במידת האפשר. שמור את הגדרות החשיפה, מכשיר ללא שינוי לאורך כל הניסוי כולו. . זה קריטי עבור מחשוב מדד הרג המארח.
3. לרכוש תמונות עבור תאים אמבה לפחות 100 על מנת לקבל נתונים סטטיסטיים טוב לחישוב המארח הרג אינדקס.

7. תמונה ניתוח ואינדקס הרג מארח

1. לבצע ניתוח התמונה באמצעות ImageJ.
2. לפתוח את קובץ התמונה של ניגודיות שלב ב ImageJ על ידי לחיצה על קובץ | פתוח ובחירת התמונה. התאם את הסף על ידי לחיצה על תמונה | ניתוח | סף. התאם את הסף העליון והתחתון כדי לבחור רק את עוצמת שיא (איור 3א).
3. המירו את התמונה לערך בינארי על ידי לחיצה תהליך | בינארית | להפוך בינארי. למלא חורים על-ידי בחירה תהליך | בינארית | למלא חורים.
   הערה: שימוש בדמותו באיור 1 כמקור, צעדים 7.1-7.2 יפיק תמונה שבה amoebae וחיידקים צמוד-משטח מופיעים אזורים כהים (איור 3ב').
4. להבטיח כי תיבות אזור ו מתכוון וערך אפור מוכנסים נתח | לקבוע מידות. למדוד את גודל משוער amoebae על-ידי בחירת הכלי אליפסה בסרגל הכלים הראשי. לחץ על ניתוח | מדד ושים לב האזור של נציג amoebae.
5. ליצור מסכות amoebae על ידי לחיצה נתח | לנתח חלקיקים. בתיבה גודל, הזן את האזור כוללים את amoebae אבל לא לכלול את החיידקים. בחר מסכות בשורת התפריט הנפתח של הצג את האפשרות. ודא כי התיבה להוסיף מנהל מסומנת.
6. לחץ על OK תמונה המציגה רק את amoebae ואת מנהל רועי הדו-שיח תופיע (איור 3ג').
7. פתחו את התמונה פלורסצנטיות באמצעות קובץ | פתוח ובחירה את הקובץ המתאים. בחר את כל האזורים של רועי מנהל על-ידי החזקת מקש shift לחוץ ולאחר לחיצה על כל אזור ברשימה (איור 3ד').
8. לחץ על לחצן למדוד רועי מנהל. פעולה זו תפתח חלון תוצאות הצגת בערך כלומר העוצמה של כל אמבה.
9. להעתיק את הערכים פלורסצנטיות עבור כל אמבה לתוכנית של גליון נתונים ולחשב המארח הורג אינדקס על ידי לקיחת הממוצע של כל הערכים זריחה.

תוצאות

גדלנו פראי-סוג aeruginosa פ זן PA14¹⁹ או ΔlasR זן²⁰ ברקע PA14 אותו ב- 6 ס מ קוטר פטרי, לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים וצמוד-פני השטח. תרבויות חוסנו של יחיד-המושבות לתוך תרבויות PS:DB, גדל בין לילה תרבות צינורות תוף רולר ב 37 ° C כדי הרוויה, מדולל מט...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה כמותיים כדי assay התקפה אלימה ב aeruginosa פ. פרוטוקול זה עשוי להיבדק עם חיידקים אחרים. עם זאת, חשוב לזכור כי מדיום הגידול צריך להיות תואם תנאי הגידול של אמבה. בפרט, אנו יש אופטימיזציה הפרוטוקול באמצעות PS:DB כמו מדיום הגידול חיידקי. אם נעשה שימוש מדיה אחרת, ייתכן צורך ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated	BD Difco	214010
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Yeast extract	Oxoid	LP0021
Special peptone	Oxoid	LP0072
Potassium hyroxide	Fisher Chemical	P250
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE	For filter sterilization
Conical tube, 15 mL	Corning	352097
Glass storage bottles	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter	Corning	351007	60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid	Ziploc	2.57E+09	Square 3-cup containers
Glass plates	Bio-Rad	1653308	For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks	Fisher	23-400-102
Equipment
Eclipse Ti-E microscope	Nikon	MEA53100	Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA	Nikon	MRH20101	Microscope setup
Fluorescence excitation source	Lumencor	Sola light engine	Microscope setup
Fluorescence filter set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera	Hamamatsu	77054098	Microscope setup
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software for image analysis
MATLAB	Mathworks	R2013	Software for image analysis
Orbital shaker incubator	VWR	89032-092	For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker	Fisher	13-687-700	For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator	Fisher	97990E	For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath	Fisher	15-462-21Q	For cooling media to 55 °C