منصة ميكروفيسيولوجيك للدهون البشرية: تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء

Summary

وقد الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) أوجه القصور الهامة في نماذجها الثقافة الأولية الحالية، التي تعوق التنمية الدوائية والدراسات الأيضية. نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج نظام ميكروفيسيولوجيكال الدهنية بوات يقحم بين الأوراق من الخلايا اللحمية. يوفر هذا بناء منصة مستقرة وقابلة للتكيف للابتدائي وات الثقافة.

Abstract

الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) يلعب دوراً حاسما في تنظيم الصحة الوزن وكل يوم. مع ذلك، هناك قيود كبيرة على نماذج الثقافة الأولية المتاحة، التي أخفقت في إخلاص الخص المكروية الدهنية أو تمديد صلاحية وات بعد أسبوعين. عدم وجود نموذج الثقافة الأولية موثوقة يعوق بشدة البحث في الأيض وات وتطوير الأدوية. وتحقيقا لهذه الغاية أننا استخدمت معايير المعاهد الوطنية للصحة لنظام ميكروفيسيولوجيك لوضع منهاج جديد للثقافة الأولية وات دعا 'سوات' (تقع الأنسجة الدهنية البيضاء). نتغلب على الطفو الطبيعي adipocytes التي يقحم مفروم وات مجموعات بين الأوراق من الخلايا اللحمية المستمدة من الدهنية. في هذا البناء، عينات وات قابلة للاستمرار أسابيع ما يزيد على ثمانية في الثقافة. وتحتفظ سوات ECM سليمة وخلية إلى جهات الاتصال، والضغوط المادية في فيفو ظروف وات؛ بالإضافة إلى ذلك، تحتفظ سوات تشكيل جانبي النسخي قوية، وحساسية للإشارات الكيميائية خارجية المنشأ، ووظيفة الأنسجة كاملة. سوات يمثل طريقة بسيطة واستنساخه وفعالة لثقافة الدهنية الأساسية. يحتمل أن تكون، أنها منبر المطبقة على نطاق واسع للبحوث في علم وظائف الأعضاء وات والفيزيولوجيا المرضية، والايض وتطوير الأدوية.

Introduction

الأنسجة الدهنية هي الجهاز الأساسي للسمنة، التي تحمل التكاليف الطبية السنوية المباشرة بين مبلغ 147 بیلیون ومبلغ 210 بیلیون في الولايات المتحدة¹. كما يسهم تراكم الأنسجة الدهنية الأخرى الأسباب الرئيسية للوفاة مثل أمراض القلب والنوع الثاني من السكري، وأنواع معينة من السرطان². في المختبر نماذج الثقافة ضرورية للدراسات الأيضية وتطوير الأدوية، لكن النماذج البحثية الحالية في الأنسجة الدهنية لأوجه القصور الرئيسية. Adipocytes هي هشة، وازدهار، والميؤوس من شفائهم متباينة الخلايا التي لم تنضم إلى خلية ثقافة البلاستيك، ولذلك لا يمكن أن يكون مثقف على استخدام أساليب الثقافة التقليدية الخلية. ومنذ السبعينات، استخدمت عدة أساليب في محاولات للتغلب على هذه العوائق، بما في ذلك استخدام الزجاج كوفيرسليبس وسقف الثقافة وثقافة الوقف ومصفوفات خارج الخلية^3،،من^{45، 6 , 7}-ومع ذلك، لقد اتسمت هذه الأساليب بموت الخلايا وديديفيرينتييشن، ويتم استخدامها عادة للا يزيد عن فترة دراسة أسبوعين. وعلاوة على ذلك، لا تحاول هذه النماذج الخص المكروية الدهنية الأصلية كما أنها لا تحتفظ بالمحتوى سليمة، دعم التفاعلات بين adipocytes و stromal خلايا، ولا خلايا قوات الهوس بذل كل منهما على الآخر في الحية في وات.

نظراً لغياب أسلوب الثقافة الدهنية الأساسية معيار الذهب، اعتمدت البحوث الدهنية أساسا على adipocytes المسبق متباينة (ديفدس). ديفدس مولتيلوكولار وملتصقة أيضي نشطة. على النقيض من ذلك، adipocytes الأبيض الأساسي نوناديرينت، والثلاجات، وتثبت الأيض منخفضة نسبيا. ومن المرجح عدم النماذج الدهنية الثقافة الحالية للخص فسيولوجيا الأنسجة الدهنية ناضجة صحية عاملاً رئيسيا في عدم وجود الأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير التي تستهدف مباشرة adipocytes. في الواقع، عدم وجود الفسيولوجية في المختبر نماذج الجهاز مشكلة كبيرة عبر معظم الأجهزة والمرض.

في ورقة موقف يعلن إنشاء برنامجها لأنظمة ميكروفيسيولوجيكال (MPS)، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) أفادت أنه معدل نجاح 2013 عبر جميع التجارب السريرية البشرية الصيدلانية فقط 18% للمرحلة الثانية و 50% للمرحلة الثالثة ⁸من التجارب السريرية. تم تصميم برنامج MPS لمباشرة معالجة عجز الأحادية في المختبر لفسيولوجيا الإنسان النموذجي. المعاهد الوطنية للصحة يعرف مبس نظم الثقافة تتألف من الابتدائي البشرية أو الخلايا الجذعية في بني ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا التي الخص أداء الجهاز. خلافا للنماذج الاختزالية الثقافات الخلية متجانسة، مخلدة، ينبغي أن دقة نموذج مبس خلية خلية وخلية المخدرات والمخدرات-المخدرات والجهاز--المخدرات التفاعلات⁹. خلافا لأساليب الثقافة الأولية، قصيرة الأجل وتملي معايير المعاهد الوطنية للصحة الاستدامة النواب أكثر من 4 أسابيع في الثقافة⁸. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن البرنامج من أعضاء البرلمان في المعاهد الوطنية للصحة في رفاس (#RFA-أون-18-001)¹⁰.

ووضعنا رواية بسيطة وقابلة للتكيف، ووصف النواب الدهنية غير مكلفة "تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء" (سوات)¹¹. يمكننا التغلب على الطفو الطبيعي adipocytes بالانسجة الدهنية الأساسية مفروم "يقحم" بين الأوراق المشتقة من الدهنية الخلايا اللحمية (أدسكس) (الشكل 1). ويجمل بنية ثلاثية الأبعاد الناتجة عن جهة الاتصال خلية خلية والمكرويه الدهنية أصلي قبل adipocytes ناضجة مع عدد سكان خلية دعم adipocyte طبيعية المحيطة. وقد تم التحقق من صحة سوات بإثبات صلاحية 8 أسابيع، استجابة للخارجية مما يشير إلى إفراز أديبوكيني وانجرافتمينت في نموذج حيوان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأجريت جميع المهام في الانضمام إلى البروتوكولين #8759 و #9189، كما وافق عليها مكتب مجلس الهجرة واللاجئين من LSUHSC-NO. جميع الحيوانات من العمل قد أنجز في الانضمام إلى البروتوكول 3285 # وافق عليها "مكتب إياكوك" في لسوهسك--رقم

1-البذر يقحم أوراق الخلية

ملاحظة: انظر الشكل 1.

1. أدسكس البذور في حوالي 80% في كونفلوينسي في لوحات زراعة الأنسجة (6 سم أو لوحات 6-جيدا). لكل بئر من سوات المرجوة، البذور 1 زراعة الأنسجة التقليدية جيدا وكذلك 1 حجم المقابلة على لوحة البلاستيك المغلفة poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) زراعة الأنسجة.
   ملاحظة: تبعاً لذلك، لوحة 6-جيدا من سوات سيتطلب بذر خلايا على لوح واحد قياسي 6-جيدا زراعة الأنسجة (طبقة الأساس) وزراعة الأنسجة المغلفة بنيبام 6-جيدا لوح واحد (الطبقة العليا). لوحات بنيبام المغلفة يمكن شراؤها تجارياً أو أنتجت^13،،في مختبر¹²¹⁴.
2. الحفاظ على أدسكس في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10% FBS و 1 × البنسلين/ستربتوميسين_. تغيير وسائل الإعلام كل يومين.
3. السماح للخلايا الاندماج حتى تصبح روافد 100% وتأخذ على نمط striated (حوالي 6-8 أيام).
   ملاحظة: سوف تحتاج إلى هذه الخلايا تعمل كورقة وحيدة خلية سليمة من أجل تحقيق الاستقرار في الأنسجة الدهنية للطفو. سيتم تفتيت الخلايا المتلاقية غير كاف عند البذر مع وات.

2-إعداد لوازم سوات

1. إعداد عدة 10 مل مختبرين من موازنة الملح الحل (حبس هانك س 1 ل)؛ بإعداد كافية للعدد المطلوب من لوحات مع وحدة التخزين لقطع الغيار.
2. إعداد جهاز المكبس لبذر سوات. بناء المكبس استخدام البلاستيك اﻷكريليك بسيطة، تتكون من جذع يعلق على قرص جولة. ضمان أن تناسبها داخل محيط الآبار زراعة الأنسجة (القطر: < 6 سم للطبق 6 سم، < 3.5 سم للوحة 6-جيدا؛ والإعلام التقريبي: 6.7 ز لطبق 6 سم، ز 5.1 للوحة 6-جيدا).
   1. إعداد بلونجيرس إضافية التأكد من أن الإجراء بسلاسة في الحالة هناك مشكلة مع أي الغطاس الفردية.
   2. مختبر الشريط التفاف حول حافة القرص المكبس، x 2 على الأقل، لمنع التسرب من الجيلاتين الحل.
   3. الرش خزانة السلامة الأحيائية (BSC) مع 70% EtOH. رذاذ أسفل رف أنبوبة مخروطية 15 مل داخل البكالوريوس مع أنابيب مخروطية فارغة، ولم يسبق لهم اللعب 15 مل؛ وسيساعد أنابيب تأمين موضع بلونجيرس الجيلاتين.
   4. رش كل المكبس التفاف الشريط جيدا مع 70% EtOH ومكان في أنبوب مخروطي 15 مل على الرف. رش غسالات معدنية (الكتلة التقريبية ز 6.3) ووضعها على الرف جنبا إلى جنب مع زوج من الملقط مدمن مخدرات؛ الغسالات إضافة الوزن بلونجيرس خلال سوات بذر.
   5. إغلاق وشاح BSC وتشغيل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة تيسيرا للتجفيف والتعقيم.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، إجراء هذه الخطوة 24 ساعة قبل البذر سوات. وبدلاً من ذلك، إجراء العملية في اليوم من الأنسجة جمع/سوات بذر؛ ومع ذلك، في هذه الحالة، تسمح 15 – 45 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية تجفيف في التعقيم.

3-إعداد بلونجيرس الجيلاتين – التطبيق إلى أوراق الخلية العلوية

1. الحرارة حمام مائي على 75 درجة مئوية.
2. إعداد الحل الجيلاتين بإضافة 0.75 غ مسحوق الجيلاتين للأوراق المالية 10 مل من 1 x HBSS. تحت غطاء دخان إضافة 100 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 1 لتحقيق التوازن بين درجة حموضة الحل.
   1. إضافة الأرصدة السمكية 10 مل إلى حمام الماء واهتز بشدة كل 5 دقائق حتى يذوب المسحوق في الحل. وتهدف لإذابة الجيلاتين مسحوق قريبا بعد إضافة إلى حمام الماء الساخن.
   2. تشغيل منفاخ BSC وإيقاف ضوء الأشعة فوق البنفسجية، ورفع وشاح. رش السطح بكالوريوس العلوم وإعداد عامل التصفية الإمدادات (5 مل اللوير لوك المحاقن و 0.2 ميكرون حقنه مرشحات). إعداد عوامل تصفية متعددة لكفاءة سلالة كميات كافية من الجيلاتين لتطبيق بلونجيرس.
3. عندما يصل الحل الجيلاتين اتساق متجانس، تصفية الحل وتطبيقه بلونجيرس. تحميل المحاقن مع الجيلاتين. تطبيق الجيلاتين إلى بلونجيرس البلاستيكية من خلال تصفية المحاقن (مل ~2.5 للوحة 6، حسنا، مل ~4.5 لطبق 6 سم) والسماح لترسيخ (~ 20 دقيقة).
4. وبمجرد الجيلاتين الصلبة، بسط الشريط من الحافة بلونجيرس. مع الملقط مدمن مخدرات، إزالة الجيلاتين من الحافة الخارجية للمكبس (أي حواف التي أثيرت غضروف). التأكد من أن الجيلاتين المتبقية في وسط المكبس مستوى تماما تحقيق أقصى قدر من الاتصال مع ورقة آخر.
5. بمجرد إزالة الجيلاتين الزائدة، بلطف تطبيق بلونجيرس الجيلاتين على لوحات آخر المغلفة بنيبام. استخدام غسالات معدنية لوزن أسفل المكبس. لا للقص أوراق الخلية أثناء تطبيق بلونجيرس.
6. إجازة في بلونجيرس على الأوراق خلية ل 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة. احتضان لوحات/بلونجيرس في حمام الماء المثلج ل 1.5 ح لاستكمال الانفصال ورقة خلية من سطح لوحة المغلفة بنيبام.
   1. توخي الحذر أثناء حضانة في حمام الثلج؛ عدم السماح بحمام الثلج لتلويث الإعلام الخلية أثناء الحضانة.
   2. بعد الانتهاء من الحضانة، بتنظيف الجزء السفلي من لوحات المغلفة بنيبام لإزالة المياه غير معقمة.

4-تجهيز الأنسجة الدهنية البيضاء

1. عند جمع الأنسجة الدهنية البشرية من غرفة العمليات، تبقى جميع العينات في حاوية عقيمة التي على الجليد حتى سوات أن يكون المصنف. إضافة وسائط الصيانة العقيمة، مثل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إلى حاوية الأنسجة الدهنية للاستقرار الأنسجة.
2. إضافة خلية الباردة الثقافة المتوسطة إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب لكل بئر/طبق يكون المصنف (100 ميليلتر للوحة 6، حسنا، 200 ميليلتر لطبق 6 سم).
3. فرم الأنسجة الدهنية.
   1. لشرائح الأنسجة الدهنية الصلبة، القيام بما يلي.
      1. تغسل شرائح كبيرة من الأنسجة الدهنية 3 x في برنامج تلفزيوني العقيمة وإزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان.
      2. خشنا فرم الأنسجة بالملقط وأسلاك شائكة العقيمة وإزالة قدر المفرج واللفافة ممكن (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل).
      3. فرم ناعما الدهون مع أسلاك شائكة حتى يأخذ الأنسجة مفروم في سميكة، السائل والاتساق.
         ملاحظة: من الناحية المثالية الأنسجة سوف تظهر متجانسة مع لا شرائح فردية مرئية وات على الرغم من أن هذا ليس ممكناً دائماً.
   2. عملية ليبواسبيراتي كما يلي.
      1. بكالوريوس العلوم، تحت الشريط شاش معقم عبر الجزء العلوي من كوب، ومكان هذا الكأس في كوب أكبر لجمع أي سائل الزائدة.
      2. استخدام ماصة 25 مل مصلية، رسم قدر ليبواسبيراتي حسب الحاجة وتطبيقه على سطح شاش معقم. تطبيق برنامج تلفزيوني مباشرة على هذا السطح لغسل ليبواسبيراتيد الدهون وإزالة الدم الزائدة وبقايا الدهن.
      3. استخدام الملقط لاستعادة الأنسجة المصفى ونقلها إلى سطح تنميق عقيمة وتخطر ليبواسبيراتي.
4. استخدام الشفرة عقيمة بقطع نهاية القاصي p1000 ماصة نصائح لنقل الأنسجة مفروم؛ سيؤدي ذلك إلى تقليل إجهاد القص يمكن أن تؤدي إلى تحلل adipocyte. حالما يتم التوصل إلى اتساق أنسجة سليمة نقل وحدة التخزين المطلوبة للأنسجة مفروم لكل أنبوبة 1.5 مل (300-400 ميليلتر للوحة 6، حسنا، 500-600 ميليلتر للطبق 6 سم). مزيج مفروم وات ووسائط الإعلام بإيجاز في الأنابيب.
5. تأخذ لوحات آخر قاعدة وصب/أسبيراتي وسائل الإعلام. استبدال وسائط الإعلام مع خليط وات/وسائل الإعلام من كل أنبوبة 1.5 مل.
   1. بلطف إزالة بلونجيرس الجيلاتين من لوحات المغلفة بنيبام وتطبيقها على خليط وات على لوحات آخر قاعدة. بحث أحادي الطبقة المغلفة بنيبام لوحات تحت مجهر للتأكد من مفرزة الخلوية.
6. تعيين كتلة حرارة إلى حوالي 37 – 40 ° ج تحت بكالوريوس العلوم. مع بلونجيرس لا تزال في مكانها، نقل اللوحات للسطحية الكتلة الحرارة. إضافة 2-3 مل وسائط الثقافة المعالجون احتضان الخلايا وتسهيل ذوبان الجيلاتين.
7. بعد ~ 30 دقيقة، إزالة بلطف بلونجيرس من سطح اللوحة. استبدال أغطية لوحات قاعدة زراعة الأنسجة والانتقال إلى حاضنة ثقافة خلية. مرة واحدة قد المسال الجيلاتين تماما عند 37 درجة مئوية، نضح واستبدال خلية ثقافة وسائل الإعلام.
8. الحفاظ على سوات في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في المتوسط M199 خالية من الفينول الحمراء مع 7 ميكرومتر الأنسولين، 30 ميكرون الديكساميتازون، 1 x البنسلين/ستربتوميسين. تحتفظ في حوالي 2 مل الإعلام للوحات 6-جيدا ومل 3 للاطباق 6 سم. تغيير وسائل الإعلام كل يومين.

5-وادي سوات الحصاد

1. إعداد كولاجيناز (كولاجيناز 0.5 ملغ/مل، 500 الادينوسين شمال البحر الأبيض المتوسط، في برنامج تلفزيوني) مختبرين في 15 مل أنابيب مخروطية الشكل (الحجم التقريبي لمل 10). تجميد الأنابيب وتخزينها في-20 درجة مئوية.
2. نضح المتوسطة الثقافة أي من الخلايا وغسل x 1 مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم نضح برنامج تلفزيوني. الإعدادية مختبرين كولاجيناز بذوبان الجليد لهم في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: من الناحية المثالية، أن الحل كولاجيناز سوف تصل إلى 37 درجة مئوية؛ وبعد ذلك مباشرة، أضف الأنسجة.
3. إضافة جميع الأنسجة من لوحة سوات إلى مختبرين الفردية. حصاد سوات استخدام المزيل خلية عقيم ونقلها إلى مختبرين كولاجيناز مع تلميح ماصة p1000 وقف إنتاج المواد الانشطارية. إضافة الأنسجة مباشرة إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل يحتوي على الحل كولاجيناز.
   1. بدلاً من ذلك، تبني الأنسجة/كولاجيناز الخليط في أنبوب 50 مل مخروطية؛ سيزيد من مساحة السطح زيادة تسهيل الهضم الأنزيمي.
4. وضع أنابيب العينة في شاكر مداري المحتضنة بزاوية 45 درجة. احتضان 200 لفة في الدقيقة، في 37 درجة مئوية لمدة 30 – 60 دقيقة.
5. مش مكان مكم 250 عامل التصفية في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد لمجموعة. من أجل حل adipocyte هضمها من خلال عامل تصفية.
   ملاحظة: هذا سوف يسمح كافة الخلايا بالمرور بينما تسربت أنسجة ليفية.
6. السماح بتدفق خلال الجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بانفصال.
   ملاحظة: سوف تطفو adipocytes بينما سوف تستقر الخلايا الدهنية stromal (الخزفية) إلى مراحل أدنى إلى الأعلى من الحل. يمكن أيضا زيادة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ز فصل الخلية أو الحصاد المحيطة أدسكس في بيليه.
7. استخدام تلميح ماصة p1000 وقف إنتاج المواد الانشطارية، نقل adipocytes (الطبقة العائمة أعلى الحل كولاجيناز) إلى أنبوب جمع 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. أخذ ~ 250 ميليلتر في وقت واحد، "الماصة؛" ببطء على طول حافة الأنبوب بجمع في adipocytes.
   1. قم بتدوير الأنبوب ببطء حين جمع adipocytes تحقيق أقصى قدر من الانتعاش من الانضمام إلى الداخل الخلايا. الحفاظ على رسم المزيد من الخلايا حتى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل كاملة.
8. إزالة السائل الزائد من adipocytes المعزولة باستخدام المحاقن المرفقة بإبرة (~ 21). تغرق إبرة تحت طبقة adipocyte العائمة. تحرض الإبرة بإيجاز لإزاحة الخلايا أي التمسك برمح إبرة ومن ثم انتظر adipocytes المزاحة تطفو إلى الأعلى.
9. رسم ببطء السائل الزائد، مع الحرص على تجنب إزالة adipocytes غير مقصودة. استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي التخرج إلى استمرار عزل حجم العينة (مثلاً- 0.1 مل لكل عينة).
10. تستخدم الخلايا المعزولة لاستخراج الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي، مقايسة الامتصاص الجلوكوز، lipolysis المقايسة، إلخ

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

جدوى سوات قيمت في البداية قبل تصوير المسلسل برايتفيلد لكل وات مجموعات (ن = 12) على مدى أسبوعين تقريبا من 7.6. وظلت مجموعات المضمون في مكان في أحادي الطبقة طوال هذا الوقت. ولوحظت التغييرات الشكلية الطفيفة مع adipocytes الفردية تزييفها قليلاً أو تحويل المواقف. ولكن adipocytes لا تصبح مول...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تفاصيل هذا البروتوكول استعمال أدسكس ساندويتش البيض الأنسجة الدهنية البشرية؛ خطوط الخلايا البشرية في آخر يمكن أن تكون معزولة عن طريق بروتوكولات راسخة¹⁵. ومع ذلك، يمكن تكييفها لمتطلبات البحوث فردية (مثل استخدام الخلايا 3T3L-1 إلى ساندويتش الماوس وات) النظام. تنطوي هذه العملية على...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250 µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2 µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics