Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt

Zusammenfassung

Weißen Fettgewebe (WAT) hat kritische Mängel in seiner aktuellen Primärkultur Modelle, pharmakologischen Entwicklung und metabolische Studien zu behindern. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine adipöse Microphysiological System durch sandwichartig WAT zwischen den Blättern der Stromazellen Zellen zu produzieren. Diese Konstruktion bietet eine stabile und flexible Plattform für WAT Primärkultur.

Zusammenfassung

Weißen Fettgewebe (WAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Gesundheit Gewicht und jeden Tag. Dennoch gibt es erhebliche Einschränkungen verfügbar Primärkultur Modelle, die versäumt haben, treu der adipösen Mikroumgebung rekapitulieren oder WAT Lebensfähigkeit über zwei Wochen hinaus zu verlängern. Das Fehlen eines verlässlichen Primärkultur Modells behindert stark Forschung in WAT Stoffwechsel und Arzneimittelentwicklung. Zu diesem Zweck haben wir NIH Normen eines Microphysiologic-Systems zur Entwicklung einer neuartigen Plattform für WAT Primärkultur genannt "SWAT" (Sandwich weißen Fettgewebe) genutzt. Wir überwinden den natürlichen Auftrieb der Adipozyten durch sandwiching Hackfleisch / WAT Cluster zwischen den Blättern von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen Zellen. In diesem Konstrukt sind WAT Proben tragfähige über acht Wochen in der Kultur. SWAT unterhält die intakte ECM, Zell-Zell Kontakte und physischen Druck der in Vivo WAT Bedingungen; Darüber hinaus unterhält SWAT eine robuste transkriptionelle Profil, Sensibilität für exogene chemische Signal- und ganze Gewebefunktion. SWAT stellt eine einfache, reproduzierbare und effektive Methode der adipösen Primärkultur. Möglicherweise ist es eine breit anwendbar Plattform für Forschung im WAT-Physiologie, Pathophysiologie, Stoffwechsel und pharmazeutischen Entwicklung.

Einleitung

Fettgewebe ist das primäre Organ von Fettleibigkeit, die direkte jährlichen medizinische Kosten zwischen $ 147 Milliarden und $ 210 Milliarden in die US-¹trägt. Die Ansammlung von Fettgewebe trägt auch zu anderen führenden Todesursachen wie Herz-Kreislauferkrankungen, Diabetes Typ II und bestimmte Arten von Krebs². In-vitro- Kultur-Modelle sind essentiell für metabolische Studien und Entwicklung von Medikamenten, aber aktueller Forschungsmodelle von Fettgewebe haben erhebliche Mängel. Adipozyten sind zerbrechlich, lebhaft und unheilbar differenzierte Zellen, die Zelle Kultur Kunststoffe nicht halten, und daher können nicht gezüchtet werden mit konventionellen Zelle Kulturmethoden. Seit den 1970er Jahren wurden mehrere Methoden Versuche zur Überwindung dieser Hindernisse, einschließlich der Verwendung von extrazellulären Matrizen^3,4,5, , Glasdeckgläser, Decke Kultur und SUSPENSIONSKULTUR ^{6 , 7}. jedoch diese Methoden durch Zelltod und Entdifferenzierung markiert wurden, und sie sind in der Regel für nicht mehr als einen zweiwöchigen Studienaufenthalt verwendet. Darüber hinaus versuchen diese Modelle nicht die native adipösen Mikroumgebung zu rekapitulieren, wie sie nicht intakte ECM pflegen, die Interaktionen zwischen Adipozyten und Stromazellen Zellen unterstützen, noch die kontraktilen Kräften Zellen auf einander in in-vivo ausüben WAT.

In Ermangelung einer adipösen Primärkultur Goldstandard Methode hat adipösen Forschung in erster Linie auf differenzierte Pre Adipozyten (DiffAds) verlassen. DiffAds sind multilocular, Anhänger und metabolisch aktiv. Im Gegensatz dazu primäre weiße Fettzellen sind unilokuläre, nonadherent und relativ niedrigen Stoffwechsel zu demonstrieren. Das Versagen der aktuellen adipösen Kultur Modelle zu rekapitulieren die Physiologie des gesunden Reifen Fettgewebe ist wahrscheinlich ein wichtiger Faktor in der Abwesenheit von FDA-zugelassene Medikamente, die Fettzellen gezielt ansprechen. In der Tat ist das Fehlen der physiologischen in-vitro- Orgel-Modelle ein großes Problem in den meisten Organen und Krankheiten.

In seiner Positionspapier über die Erstellung des Programms Microphysiological Systeme (MPS) berichtet der National Institute of Health (NIH), dass die 2013 Erfolgsquote über alle klinischen Studien am Menschen pharmazeutischen nur 18 % für Phase II und Phase III 50 war % klinische Studien-⁸. Das MPS-Programm soll die Unfähigkeit der in-vitro- Monokultur, Modell Humanphysiologie direkt anzusprechen. Die NIH definiert MPSs als Kultur-Systeme bestehend aus menschlichen Grund- oder Stammzellen in mehrzelligen 3D Konstrukte, die Orgel funktionieren rekapitulieren. Im Gegensatz zu reduktionistische Modelle von homogenen, verewigt Zellkulturen sollten MPSs genau modellieren, Zell-Zell, Droge-Zelle, Medikamenten und Orgel-medikamentöse Interaktionen⁹. Im Gegensatz zu kurzfristigen Primärkultur Methoden diktieren NIH Standards MPS Nachhaltigkeit mehr als 4 Wochen in Kultur⁸. Weitere Einzelheiten zu den MPS-Programm finden Sie auf der NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)¹⁰.

Haben wir einen einfachen, Roman, anpassungsfähig, und preiswerte adipösen MPS bezeichnet "weißen Fettgewebe eingeklemmt" (SWAT)¹¹. Wir überwinden den natürlichen Auftrieb der Adipozyten durch "sandwichartig" Hackfleisch / primäre Fettgewebe zwischen den Blättern von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen Zellen (ADSCs) (Abbildung 1). Die daraus resultierenden 3D Konstrukt rekapituliert der Zell-Zell-Kontakt und der native adipösen Mikroumgebung von umliegenden Reifen Adipozyten mit einer natürlichen Adipocyte Unterstützung Zellpopulation. SWAT ist durch den Nachweis von 8 Wochen Lebensfähigkeit, Reaktion auf exogene Signalisierung, Adipokine Sekretion und Engraftment in einem Tiermodell validiert worden.

Protokoll

Alle Aufgaben wurden in Einhaltung der Protokolle #8759 "und" #9189 durchgeführt, wie von der IRB Office LSUHSC-NO. genehmigt Alle tierische Arbeit erfolgte unter Einhaltung Protokoll #3285 genehmigt vom Büro IACUC in LSUHSC-Nr.

(1) Aussaat von Sandwiching Zelle Blätter

Hinweis: Siehe Abbildung 1.

1. Samen ADSCs bei ca. 80 % Konfluenz in Gewebekultur Platten (6 cm oder 6-Well Platten). Für jede Vertiefung von SWAT gewünscht, Saatgut, 1 konventionelle Gewebekultur gut und 1 gut von entsprechender Größe auf Poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-beschichtete Gewebe-Kultur Kunststoffplatte.
   Anmerkung: Entsprechend, eine 6-Well-Platte von SWAT benötigen Aussaat Zellen auf einer standard 6-Well Gewebekultur Platte (Grundschicht) und einer Gewebekultur 6-gut pNIPAAm-beschichtete Platte (obere Schicht). pNIPAAm-beschichteten Platten können im Handel gekauft werden oder im Labor^12,13,14hergestellt.
2. Pflegen ADSCs bei 37 ° C und 5 % CO₂ in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS und 1 x Penicillin/Streptomycin_. Wechseln Sie Medium alle 2 Tage.
3. Zellen zu verschmelzen, bis sie 100 % Zusammenfluss und auf einem gekerbten Muster (ca. 6 – 8 Tage nehmen) zu ermöglichen.
   Hinweis: Diese Zellen müssen als einzige intakte Zelle Plan funktionieren, um das lebhafte Fettgewebe zu stabilisieren. Nur unzureichend konfluierende Zellen werden bei der Aussaat mit WAT fragment.

2. Vorbereitung des SWAT-Lieferungen

1. Bereiten Sie mehrere Aliquote in 10 mL von 1 X Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS); bereiten Sie genug für die gewünschte Anzahl von Platten mit Volumen zu ersparen.
2. Bereiten Sie den Kolben-Apparat für die Aussaat von SWAT. Konstruieren Sie den Kolben mit einfachen Acryl Kunststoffe, bestehend aus einem Stiel, eine runde Scheibe befestigt. Stellen Sie sicher, dass es in den Umfang der Gewebekultur Brunnen passt (Durchmesser: < 6 cm 6 cm Schüssel < 3,5 cm für 6-Well-Platte; ungefähre Masse: 6,7 g für eine 6 cm Schüssel, 5,1 g für eine 6-Well-Platte).
   1. Bereiten Sie zusätzliche Kolben um sicherzustellen, dass das Verfahren einen reibungslosen Ablauf im Fall, dass es ein Problem mit jedem einzelnen Kolben.
   2. Wickeln Sie Lab-Band rund um den Rand der Kolben-Platte, mindestens 2 X, Auslaufen von Gelatine-Lösung zu verhindern.
   3. Sprühen Sie ein Biosafety-Kabinett (BSC) mit 70 % EtOH. Sprühen Sie unten eine 15 mL konische Rohr Gestell innerhalb der BSC mit leeren, unbeschränkt 15 mL konische Röhrchen; Röhren werden dazu beitragen, die Platzierung der Gelatine Kolben zu sichern.
   4. Sprühen Sie jedes Klebeband umwickelt Kolben gründlich mit 70 % EtOH und Ort in ein 15mL konische Röhrchen auf dem Gestell. Sprühen Sie Metallscheiben (ungefähre Masse 6,3 g) und legen Sie sie auf das Gestell zusammen mit ein paar Haken Zange; die Unterlegscheiben werden die Kolben in SWAT Aussaat Gewicht hinzufügen.
   5. Schließen Sie die BSC-Schärpe und biegen Sie auf die UV-Licht, Trocknung und Sterilisation zu erleichtern.
      Hinweis: Im Idealfall führen Sie diesen Schritt 24 h vor der Aussaat SWAT. Alternativ führen Sie den Prozess am Tag der Gewebe Sammlung/SWAT Aussaat; in diesem Fall können Sie jedoch 15 – 45 min für die UV-Trocknung/Sterilisation.

3. Vorbereitung der Gelatine Kolben-Anwendung zur oberen Zelle Blätter

1. Ein Wasserbad auf 75 ° c erhitzen
2. Bereiten Sie die Gelatinelösung durch Zugabe von 0,75 g Gelatine-Pulver, 10 mL Brühe von 1 X HBSS. Fügen Sie unter einer Abzugshaube 100 µL 1 M NaOH, der pH-Wert der Lösung auszugleichen.
   1. Das Wasserbad fügen Sie 10 mL Aktien hinzu und schütteln Sie kräftig alle 5 min, bis sich das Pulver aufgelöst in Lösung. Die pulverisierte Gelatine auflösen, bald nach dem beheizten Wasserbad hinzufügen wollen.
   2. Das BSC-Gebläse schalten Sie, schalten Sie das UV-Licht und erhöhen Sie Flügel zu. Besprühen Sie die Oberfläche der BSC und bereiten Sie den Filter Lieferungen (5 mL Luer-Lock Spritzen und 0,2 µm Spritze Filter). Bereiten Sie mehrere Filter effizient Belastung ausreichende Mengen an Gelatine Kolben zuweisen.
3. Wenn die Gelatine-Lösung eine homogene Konsistenz erreicht, Filtern Sie die Lösung und wenden Sie es auf den Kolben. Laden Sie die Spritze mit der Gelatine. Wenden Sie die Gelatine auf die Kunststoff Kolben durch die Spritze-Filter (~2.5 mL für eine 6-Well-Platte, ~4.5 mL für eine 6 cm Schüssel an) und lassen Sie (~ 20 min) zu festigen.
4. Sobald die Gelatine fest ist, packen Sie das Klebeband von der Kante der Kolben. Mit der gebogenen Pinzette entfernen die Gelatine vom äußeren Rand des Kolbens (d. h. die hochgezogenen Kanten des Meniskus). Sicherzustellen, dass die restlichen Gelatine in der Mitte des Kolbens völlig eben ist, Kontakt mit ADSC Blatt zu maximieren.
5. Nach dem entfernen überschüssige Gelatine tragen Sie sanft die Gelatine-Kolben an den pNIPAAm-beschichtete ADSC-Platten auf. Verwenden Sie die Metallscheiben, die Kolben Wiegen. Scheren Sie Zelle Blätter nicht während der Anwendung der Kolben.
6. Lassen Sie die Kolben auf die Zelle Datenblätter für 1,5 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Platten/Kolben in ein Eis-Wasserbad für 1,5 h Dissoziation der Zelle Blatt aus der pNIPAAm-beschichtete Plattenoberfläche abschließen.
   1. Seien Sie vorsichtig, während der Inkubation in das Eisbad; lassen Sie sich nicht das Eisbad um die Zelle Medien während der Inkubation zu verunreinigen.
   2. Reinigen Sie nach Abschluss der Inkubation die Unterseite der pNIPAAm-beschichtete Platten, unsteril Wasser zu entfernen.

(4) weißen Fettgewebe Verarbeitung

1. Beim Sammeln von menschlichen Fettgewebe aus dem OP zu halten alle Proben in einen sterilen Behälter, die auf Eis bis SWAT ist gesät werden. Fettgewebe Container für Gewebestabilität sterile Wartung Medien wie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), hinzufügen.
2. Fügen Sie kalt Zellkulturmedium, 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für jedes gut/Gericht sein ausgesät (100 µL für eine 6-Well-Platte, 200 µL für eine 6 cm Schüssel).
3. Zerkleinere das Fettgewebe.
   1. Gehen Sie für feste Fettgewebe Segmente wie folgt vor.
      1. Waschen Sie große Teile des Fettgewebes 3 X in sterilen PBS und soviel PBS wie möglich zu entfernen.
      2. Grob hacken Gewebe mit Zange und sterilen Rasierklinge und soviel Gefäßsystem und Faszie wie möglich zu entfernen (siehe Diskussion für mehr Detail).
      3. Hacken Sie fein Fett mit Rasiermesser bis Hackfleisch / Gewebe dick, flüssige Konsistenz annimmt.
         Hinweis: Im Idealfall Gewebe homogen mit keine sichtbaren einzelne Segmente des WAT erscheint obwohl dies nicht immer möglich ist.
   2. Lipoaspirate wie folgt zu verarbeiten.
      1. Unter der BSC sterilen Gaze über den oberen Rand ein Becherglas mit Klebeband und stellen diese Becher in ein größeres Becherglas, überschüssige Flüssigkeit zu sammeln.
      2. Mit einer serologischen 25-mL-Pipette, so viel Lipoaspirate nach Bedarf zu zeichnen und auf die Oberfläche der sterile Gaze auftragen. Gelten Sie PBS direkt an dieser Oberfläche, Lipoaspirated Fett zu waschen und um überschüssiges Blut und Lipid-Rückstände zu entfernen.
      3. Verwenden Sie Zange wiederherstellen durchlässigen Gewebe, übertragen Sie es auf eine sterile affektierten Oberfläche und Zerkleinern der Lipoaspirate.
4. Verwenden einer sterilen Rasierklinge abgeschnitten das distale Ende des p1000 Pipettenspitzen, Hackfleisch / Gewebe zu übertragen; Dies minimiert Schubspannung, die Adipocyte Lyse führen kann. Sobald eine richtige Gewebe Konsistenz erreicht ist übertragen Sie die gewünschte Lautstärke von Hackfleisch / Gewebe auf jede 1,5 mL Tube (300 – 400 µL für 6-Well-Platte, 500 – 600 µL für 6 cm Schüssel). Mischen Sie Hackfleisch / WAT und Medien in die Rohre kurz.
5. Nehmen Sie die Grundplatten ADSC und Dekantieren/Absaugen der Medien. Ersetzen Sie die Medien mit der WAT/Medien-Mischung von jeweils 1,5 mL-Tube.
   1. Sanft die Gelatine-Kolben von den pNIPAAm-beschichtete Platten zu entfernen und auf der WAT-Mischung auf die Grundplatten ADSC anzuwenden. Prüfen der Monoschicht der pNIPAAm-beschichtete Platten unter dem Mikroskop, zelluläre Loslösung zu bestätigen.
6. Legen Sie einen Heizblock auf ca. 37 – 40 ° C unter der BSC. Mit den Kolben noch in Kraft wechseln Sie die Platten an den Heizblock Oberfläche Fügen Sie 2 – 3 mL erwärmten Nährmedien zu inkubieren der Zellen und zu erleichtern, Gelatine schmelzen.
7. Entfernen Sie nach ~ 30 min vorsichtig die Kolben aus der Plattenoberfläche. Ersetzen Sie die Deckel der Basis Gewebekultur Platten und bewegen Sie in eine Zelle Kultur Inkubator. Sobald die Gelatine vollständig bei 37 ° C verflüssigt hat, Aspirieren und Zellkulturmedien ersetzen.
8. Pflegen Sie SWAT bei 37 ° C und 5 % CO₂ an Phenol rotfrei-M199 Medium mit 7 µM Insulin, 30 µM Dexamethason, 1 X Penicillin/Streptomycin. Halten Sie in etwa 2 mL Medien für 6-Well-Platten und 3 mL für 6 cm Gerichte. Wechseln Sie Medium alle 2 Tage.

(5) SWAT-Ernte

1. Kollagenase (0,5 mg/mL Kollagenase, 500 nM Adenosin in PBS) bereiten Aliquote in 15 mL konische Röhrchen (ungefähre Volumen von 10 mL). Die Rohre Einfrieren und lagern bei-20 ° C.
2. Aspirieren Sie jede Kulturmedium aus Zellen, waschen Sie 1 X mit PBS und dann Aspirieren Sie PBS. Vorbereitung der Kollagenase Aliquote von ihnen in einem 37 ° C Wasserbad Auftauen.
   Hinweis: Im Idealfall wird die Kollagenase Lösung 37 ° C erreichen; Fügen Sie unmittelbar danach Gewebe.
3. Die einzelnen Aliquote alle Gewebe aus der SWAT-Platte hinzufügen. Ernte mit einem sterilen Zelle Scrapper SWAT und überträgt es auf die Kollagenase Aliquote mit einem Cut-Off p1000 PIPETTENSPITZE. Fügen Sie Gewebe direkt in das 15 mL konische Röhrchen mit Kollagenase Lösung.
   1. Inkubieren Sie alternativ die Gewebe/Kollagenase-Mischung in einem 50 mL konische Röhrchen; die vergrößerte Oberfläche wird weiter enzymatische Verdauung erleichtern.
4. Ein inkubierten Orbitalschüttler in einem 45°-Winkel entgegenbringen Sie Probenröhrchen. Bei 200 u/min bei 37 ° C für 30 – 60 min inkubieren.
5. Platz 250 µm mesh-Filter in ein neues 15 mL konische Röhrchen für Sammlung. Füllen Sie die verdaute Adipocyte Lösung durch den Filter.
   Hinweis: Dies ermöglicht alle Zellen durchlaufen beim herausfiltern von Bindegewebe.
6. Durchfluss für 5 min bei Raumtemperatur ermöglicht Phasentrennung sitzen lassen.
   Hinweis: Die Adipozyten schweben an die Spitze der Lösung während Stromazellen Fettzellen (ASC) in die unteren Phasen niederlassen werden. Zentrifugation für 5 min bei 500 X g kann auch Zellseparation oder Ernte rund um ADSCs im Pellet maximieren.
7. Mit eine Cut-Off p1000 PIPETTENSPITZE übertragen Sie Adipozyten (schwimmende Schicht an Spitze der Kollagenase-Lösung), ein 1,5 mL Microcentrifuge sammelröhrchen. Unter ~ 250 µL zu einem Zeitpunkt, pipette langsam entlang der Kante des Rohres, die Fettzellen zu sammeln.
   1. Drehen Sie das Rohr langsam beim Sammeln der Fettzellen um die Erholung der Zellen, die an der Innenseite zu maximieren. Halten Sie mehr Zellen zeichnen, bis 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch voll ist.
8. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem isolierten Fettzellen mit einer Spritze mit einer Nadel (~ 21) verbunden. Versenken Sie die Nadel unter der schwimmenden Adipocyte Schicht. Rühren Sie die Nadel kurz, um alle Zellen an der Nadel-Welle zu verdrängen, und warten Sie, bis die verdrängt Adipozyten nach oben zu schweben.
9. Ziehen Sie langsam die überschüssige Flüssigkeit, dabei darauf achten, die unbeabsichtigte Entfernung von Fettzellen zu vermeiden. Microcentrifuge Schlauch Promotionen zu verwenden, um konsequent Probenvolumina isolieren (z. B.. 0,1 mL für jede Probe).
10. Verwenden Sie die isolierten Zellen für DNA/RNA Extraktion, Glukose-Aufnahme-Assay, Lipolyse-Assay, etc.

Ergebnisse

Lebensfähigkeit des SWAT wurde zunächst durch serielle Hellfeld Darstellung der einzelnen WAT Cluster beurteilt (n = 12) über ca. 7,6 Wochen. Cluster blieb auf der Monolage während dieser Zeit gesichert. Leichte morphologische Veränderungen beobachtet mit einzelnen Adipozyten leicht verziehen oder Positionen verschieben. Jedoch Adipozyten weder zu multilocular im Laufe der Zeit, zeigt einen Mangel an Entdifferenzierung, noch haben sie weisen keine sichtbaren Zeichen des Zelltods wie ...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von ADSCs zu Sandwich menschlichen weißen Fettgewebe; menschlichen ADSC-Zell-Linien können über gut etablierte Protokolle¹⁵isoliert werden. Jedoch kann das System für individuelle Forschungsanforderungen (z. B. mit 3T3L-1-Zellen, Sandwich Maus WAT) angepasst werden. Dieser Prozess beinhaltet Umgang mit primären menschlichen Gewebes. Standard-Sicherheitsvorkehrungen sollten eingesetzt werden; menschliche Gewebe als BSL-2 Krankheitserreger (z. B.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250 µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2 µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics