JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الصغير-الكشف (ميرناس) تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة وعالية مثلى، بوصفه بوستترانسكريبشونال المنظمين للكشف رسول (مرناس). وتختلف طرق الكشف عن ميرنا الحالية في حساسية وخصوصية. ونحن تصف بروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع وإيمونوستينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على أبواب أنسجة القلب الماوس المتزامنة.

Abstract

الصغير-الكشف (ميرناس) هي النصوص الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي ربط الكشف رسول (مرناس) وتحول دون ترجمتها أو الترويج عن التدهور. وحتى الآن، قد تورط ميرناس في عدد كبير من العمليات البيولوجية والمرض، والتي قد تدل على الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين ميرنا المستندة إلى المسبار الكشف، جنبا إلى جنب مع البروتين إيمونوستاينينج على أبواب القلب الماوس. أولاً، أجرينا في الموقع تهجين أسلوب استخدام التحقيق لتحديد التعبير ميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم وتضخم القلب الفئران. بعد ذلك، أجرينا إيمونوستينينج للقلب بروتين "تروبونين تي" (كتنت)، على نفس المقاطع، شارك تعريب ميرنا-182 مع الخلايا كارديوميوسيتي. باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على اكتشاف ميرنا-182 من خلال الفوسفاتيز قلوية على أساس مقايسة اللونية، وكتنت من خلال تلطيخ الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن التعبير عن أي ميرنا من الفائدة من خلال تحقيقات LNA المسمى حفر، وتعبير البروتينات ذات الصلة على أبواب أنسجة القلب الماوس.

Introduction

الصغير-الكشف (ميرناس) قصيرة (18 – 25 النيوكليوتيدات)، واحد-الذين تقطعت بهم السبل، وفضله الكشف التي تؤدي وظيفة المنظمين السلبية للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال بتثبيط الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) ترجمة و/أو تعزيز تدهور مرناً 1-يتم نسخها ميرناس من إينترونس أو exons من الترميز أو المشقوق فضله، والجينات في النواة من دروشا، للسلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس)، وهياكل الجذعية-حلقة قصيرة من النيوكليوتيدات 702. عقب هيولى الصادرات، وكذلك معالجة قبل ميرناس بواسطة ديسير في ميرناس الناضجة التي تمتد 18 – 25 النيوكليوتيدات3،4. وفي وقت لاحق، المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC) يتضمن هذه ميرناس كالكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل، الذي يسمح تجليدها إلى 3 'غير مترجمة منطقة (3'-UTR) بهم مرناس الهدف لقمع ما التعبير3،5 .

خلال العقود الثلاثة الماضية، حيث أنها قد حددت أولاً، ظهرت ميرناس للمنظمين سيد التعبير الجيني، ومستويات التعبير الخاصة التي هي أحكام الرقابة6. وقد وصف أدوار ميرناس في جهاز التنمية7،،من89،10،11،12، الحفاظ على التوازن13،14 ، فضلا عن سياقات المرض التي تشمل العصبية15،16،17،،من1819،20من القلب والأوعية الدموية، شروط المناعة الذاتية21 ،22،23،السرطان24وغيرها25. جلبت إلى الأمام الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا التقدير المتزايد للأهمية أنماط التعبير ميرنا. وتشمل هذه الأساليب PCR الوقت الحقيقي، [ميكروارس]، النشاف الشمالية، والتهجين في الموقع وغيرها، التي تختلف في حساسية وخصوصية، وكمية الطاقة، معظمها يرجع ذلك إلى حقيقة أن النصوص ميرنا تتألف من قصيرة و 6من متواليات عالية مثلى.

ونحن أفادت مؤخرا دوراً هاما لميرنا-182 في التنمية لتضخم عضلة القلب26، شرط وصف التكيف الهيكلي للقلب في الاستجابة لمطالب الفسيولوجية مرتفعة27،28. تضخم القلب تتميز بالزيادة في كتلة عضلة القلب، التي، إذا ترافق مع مهايئ يعيد29، يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بقصور القلب، شرط المحاسبة 8.5 في المائة من جميع الوفيات المنسوبة إلى القلب والأوعية الدموية 30من المرض.

هنا، يمكننا وصف لنا البروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع مع مسبار الحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين وإيمونوستاينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على الماوس المقاطع أنسجة القلب، المتزامنة في موقعنا نموذج لتضخم القلب.

Protocol

ماوس القلب عينات الأنسجة لهذه الدراسة تم الحصول عليها وفقا للقوانين ذات الصلة والمبادئ التوجيهية للمؤسسات ووافقت عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية جامعة ييل.

1-حل إعداد

  1. إعداد رناسي ddH الحرة2س، بعلاج ل 5 من ddH2س مع 5 مل من 0.1% ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك) بين عشية وضحاها (O/N)، في درجة حرارة الغرفة (RT). اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية) لإلغاء تنشيط في ديبك. وأشار إلى استخدام المعالجة ديبك ddH2س للإعداد الحلول النهائية ك.
    تنبيه: ديبك مسرطن معروف، معالجة فقط في غطاء الدخان.
  2. إعداد x 1 فوسفات مخزنة المالحة (PBS) الحل بتذويب 5 أقراص برنامج تلفزيوني في 1 لتر من تعامل ديبك ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  3. إعداد 0.1% غير الأيونية المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني (ببست) بتمييع 1 مل منظفات غير الأيونية كل 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
  4. تحضير الإيثانول 90%، 70%، 50% و 30% في تعامل ديبك ddH2o.
  5. إعداد 10 ملغ/مل الحل الأسهم بروتيناز ك (ProK) في تعامل ديبك ddH2قاسمة سين وتخزينها في-20 درجة مئوية. تعد حلاً عامل ميكروغرام/مل 20 من ProK بتمييع ميكروليتر 100 حل ProK الأسهم في 50 مل من تعامل ديبك ddH2O. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  6. إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) عن طريق إضافة ز 2 من منهاج عمل بيجين في 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. الحرارة عند 65 درجة مئوية مع الهز أحياناً، حتى يذوب. قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية.
    تنبيه: منهاج عمل بيجين مادة مسرطنة معروفة، ومعالجة فقط في غطاء الدخان.
  7. إعداد حل م 3 كلوريد الصوديوم بإضافة ز 87.8 إلى 500 مل ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  8. تعد حلاً2 مجكل م 1 بإضافة ز 20.3 إلى 100 مل من ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  9. تحضير 1 "م تريس" pH 8.0 بحل ز 121.1 في 800 مل ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع بضع قطرات من 1 N HCl، إحضار وحدة التخزين إلى 1 لتر والاوتوكلاف (121 درجة مئوية). يعد إيجاد حل عملي من 50 مم تريس pH 8.0 بتمييع 2.5 مل م 1 تريس pH 8.0 في 47.5 مل ddH2o.
  10. تحضير 1 "م تريس" pH 9.5 بحل ز 60.6 في 400 مل ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 مع بضع قطرات من 1 N HCl، جلب الحجم 500 مل والاوتوكلاف (121 درجة مئوية).
  11. إعداد 0.13 م 1-ميثيليميدازولي pH 8.0 بتمييع مل 1.6 من 1-ميثيليميدازولي لمل 130 من تعامل ديبك ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع ميليلتر حوالي 450 من 12 N HCl. إضافة 16 مل من كلوريد الصوديوم م 3 والحجم 160 مل. جعل الطازجة قبل استخدامها.
    تنبيه: 1-ميثيليميدازولي الضارة بالأغشية المخاطية والعينين والجلد، ومعالجة فقط في غطاء الدخان.
  12. إعداد 0.16 م ن هيدروكلوريد-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-اثيلكاربودييميدي (EDC) بتمييع ميليلتر 176 لتنمية الصادرات إلى 10 مل من 0.13 م 1-ميثيليميدازولي. قم بضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع حوالي 100 ميليلتر من جديد N HCl. جعل 12 قبل الاستخدام.
    تنبيه: تنمية الصادرات الضارة للأغشية المخاطية والعيون، والجلد، ومعالجة فقط في غطاء الدخان.
  13. إعداد 1% ح2س2 بإذابة 1.5 مل من 30 ٪ ح2س2 في 50 مل من 1 x PBS. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  14. إعداد 20 x SSC pH 7.0 بتذويب 175.3 ز من كلوريد الصوديوم وز 88.2 سترات الصوديوم (Na3ج6ح5س7) في 800 مل من ضبط O. ddH2درجة الحموضة 7.0 مع بضع قطرات من 1 N HCl، إحضار وحدة التخزين إلى 1 لتر والاوتوكلاف (121 درجة مئوية).
    1. إعداد حلاً عامل من 2 x SSC pH 7.0 بتمييع 20 مل x SSC 20 درجة الحموضة 7.0 في 180 مل من ddH2o.
    2. يعد إيجاد حل عملي من 1 x SSC pH 7.0 بتمييع 2.5 مل من x SSC 20 درجة الحموضة 7.0 في 47.5 مل ddH2o.
    3. تعد حلاً عامل من 0.2 x SSC pH 7.0 بتمييع مل 5 x SSC 2 درجة الحموضة 7.0 في 45 مل من ddH2o.
  15. تحضير 1 × الحل التهجين بإذابة 0.5 مل من x microRNA 2 ايش العازلة في 0.5 مل من تعامل ديبك ddH2O. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  16. إعداد حل Levamisole الأسهم 200 ملم بإضافة 250 ملغ إلى 5 مل من قاسمة O. ddH2وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  17. إعداد حل حظر للخطوة 5 (10% الأغنام serum/1% جيش صرب البوسنة/0.2 مم ليفاميسول) بتمييع 1 مل مصل الأغنام في 9 مل ببست، وإضافة 0.1 غرام من جيش صرب البوسنة. إضافة 10 ميكروليتر من Levamisole قبل استخدام. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  18. إعداد حل حظر للخطوة 6 (الماعز 10% serum/1% جيش صرب البوسنة) بتمييع 1 مل مصل الماعز في 9 مل ببست، وإضافة 0.1 غرام من جيش صرب البوسنة. تخزين في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون أسبوع.
  19. إعداد حل بريستينينج بتمييع 3.3 مل 3 "م كلوريد الصوديوم"، 5 مل من م 1 MgCl2، 10 مل من 1 م تريس pH 9.5، 100 ميليلتر توين-20، 100 ميليلتر من Levamisole 81.5 مل ddH2O. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  20. استخدام نيتروبلوي تيترازوليوم (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly أقراص الفوسفات (بسب) بإعداد 20 من مل من محلول الركازة الفوسفاتيز القلوي (AP) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إضافة 20 ميكروليتر من Levamisole. جعل الطازجة قبل الاستخدام، وحماية من الضوء.
  21. إعداد الحل كتبت بإضافة 4 غرام تريس، ز 4.4 من كلوريد الصوديوم و 375 ملغ من بوكل في 500 مل من ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  22. اختياري: تحضير حلاً عامل DAPI (1 ميكروغرام/مل) بتمييع ميكروليتر 50 DAPI حل الأسهم (1 ملغ/مل) في 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الحلول القياسية مثل 3 كلوريد م الصوديوم، مجكل م 12, 1 م تريس-HCl، خالية من نوكلاس ddH2س، 1 x PBS و 20 x SSC يمكن شراؤها بدلاً من ذلك. وقد استخدمت لهذا البروتوكول أو الجرار كوبلين زجاج 50 مل أو الإرسال الشريحة البوليبروبيلين 20 مل الجرار.

2-الأنسجة إعداد

ملاحظة: المقاطع قلب الماوس المستخدمة هنا كانت أعدتها "جامعة ييل باثولوجيا الأنسجة الخدمات"، من الفورمالين-الثابتة/البارافين-جزءا لا يتجزأ من النسيج وقطع في 5 ميكرومترات والمتمركزة في الشرائح مشحونة.

  1. الإماهة الأنسجة.
    1. الحارة الشرائح عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، في الفرن التهجين حتى يذوب البرافين واضح.
    2. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل وكيل التخليص متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد) لمدة 10 دقائق، مرتين.
    3. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل إيثانول 100% لمدة 2 دقيقة، مرتين، وتليها الإيثانول 90% لمدة 2 دقيقة، الإيثانول 70% لمدة 2 دقيقة، مرتين، الإيثانول 50% لمدة 2 دقيقة والايثانول 30% لمدة 2 دقيقة.
    4. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من تعامل ديبك ddH2س لمدة 5 دقائق.
    5. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  2. الأنسجة دي-بروتيناتينج.
    1. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 20 ميكروغرام/مل ProK العامل الحل، في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
      تنبيه: قد يؤدي الهضم الناقص في الفقراء أو لا وضع الإشارات، بينما الهضم الإفراط قد تؤدي إلى تدهور النسيج والتنمية لتلوين الخلفية. الأمثل قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة (1 – 20 ميكروغرام/مل ProK، حضانة 5 – 20 دقيقة، الرايت-37 درجة مئوية).
    2. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، في الرايت، مرتين.
  3. تثبيت الأنسجة.
    1. استخدام قلم مسعور لرسم دائرة طارد مياه حول الأنسجة على كل شريحة.
    2. تطبيق 500 ميليلتر من حل منهاج العمل 4% على طول كل شريحة، واحتضان الشرائح أفقياً لمدة 10 دقيقة، في الرايت
    3. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، في الرايت، مرتين.
    4. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من 0.13 م 1-ميثيليميدازولي لمدة 10 دقيقة، في الرايت، مرتين.
    5. تطبيق 500 ميليلتر من 0.16 م الصادرات الحل على طول كل شريحة، واحتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
    6. شطف الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من 50 مم تريس pH 8.0 في الرايت
    7. شطف الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت، مرتين.
      ملاحظة: كل خطوات التثبيت منهاج العمل وتنمية الصادرات مطلوبة من أجل ميرنا crosslinking وينبغي إلا تحذف. 31
  4. كتلة البيروكسيديز الذاتية.
    1. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من 1 ٪ ح2س2 لمدة 30 دقيقة في الرايت
    2. شطف الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت، مرتين.

3-التهجين

  1. يسخن حل التهجين (500 ميليلتر كل شريحة) عند 50 درجة مئوية في الفرن التهجين، حتى درجة الحرارة المستهدفة، ويتم التوصل إلى (10 – 15 دقيقة).
  2. إعداد قاعة التهجين بوضع قطعتين من التصفية أو المناديل الورقية في الجزء السفلي من الدائرة وترطيب الورقة مع 50% ميثلامين/1 x SSC.
    تنبيه: ميثلامين مضر للأغشية المخاطية والعينين والجلد ومقبض فقط في غطاء الدخان.
  3. تطبيق 200 ميليلتر من التهجين الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 – 3 في 50 درجة مئوية، في دائرة هوميديفيد.
  4. إعداد الحل المسبار بمزج 0.5 ميليلتر الأسهم مسبار (25 ميكرومتر) في 250 ميليلتر أوفهيبريديزيشن الحل (التركيز النهائي 50 نانومتر) في أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: يتم أعرب ميرناس مختلفة على مختلف المستويات، حتى الأمثل فيما يتعلق بتركيز التحقيق قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة (1 – 50 nM)، لتجنب لا إشارة أو وضع خلفية عالية.
  5. تطبيق 250 ميليلتر من مسبار الحل على طول كل شريحة وساترة رناسي مجاناً على أعلى. تجنب تشكيل الفقاعات.
  6. ختم الدائرة التهجين مع بارافيلم بعناية واحتضان O/N في 50 درجة مئوية.
    ملاحظة: درجة حرارة التهجين يجب تعيين حوالي 30 درجة مئوية تحت درجة حرارة ذوبان الحمض النووي الريبي (Tm) لكل التحقيقات. قد يكون التحسين المطلوبة. هنا، 50 درجة مئوية كدرجة حرارة التهجين/الغسيل لميرنا-182، وضبط وفقا لتحقيقات مختلفة.

4-التشدد يغسل

  1. بريوارم 200 مل 2 x SSC عند 50 درجة مئوية في الفرن التهجين، حتى يتم التوصل إلى درجة حرارة الهدف (20 – 40 دقيقة).
  2. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 2 x SSC عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو حتى تخفف كوفيرسليبس.
  3. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 2 x SSC على RT لمدة 5 دقائق، مرتين.
  4. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 0.2 x SSC على RT لمدة 5 دقائق.
  5. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل ببست في RT لمدة 5 دقائق.
  6. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: استخدام ظروف خالية من رناسي لم يعد ضروريا منذ الهجينة رنا رنا تعتبر مستقرة.

5-حفر الكشف عن الأجسام المضادة

  1. استخدام قلم مسعور لإعادة رسم دائرة طارد مياه حول الأنسجة على كل شريحة إذا لزم الأمر.
  2. تطبيق 500 ميليلتر لعرقلة حل لطول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً مدة 30 دقيقة في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  3. تحضير حل جسم حفر (1:1، 000) بتمييع ميكروليتر 0.5 من جسم حفر في 500 ميليلتر أوفبلوكينج الحل في أنبوب 1.5 مل.
    تنبيه: قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة الأمثل (1: 500-000 1:2).
  4. تطبيق 500 ميليلتر من حفر جسم الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  5. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل ببست في RT لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
  6. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من بريستينينج الحل في RT لمدة 5 دقائق، مرتين.
  7. احتضان الشرائح في جرة الإرسال البوليبروبيلين شريحة التي تحتوي على 20 مل أوفاب الركازة الحل عند 37 درجة مئوية، ح 6 – 24، محمية من الضوء.
    تنبيه: يجب فحص وضع لون كل حاء 2 الأمثل قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة.
  8. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من محلول كتبت على RT لمدة 5 دقائق، مرتين.
  9. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق.

6-كتنت الكشف عن الأجسام المضادة

  1. استخدام قلم مسعور لإعادة رسم دائرة طارد مياه حول الأنسجة على كل شريحة إذا لزم الأمر.
  2. تطبيق 500 ميليلتر لعرقلة حل لطول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  3. تحضير حل جسم كتنت (1: 100) بتمييع ميكروليتر 2 من جسم كتنت في 200 ميكروليتر أوفبلوكينج الحل في أنبوب 1.5 مل.
  4. تطبيق 200 ميليلتر كتنت جسم الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً س/ن في 4 درجات مئوية، في دائرة هوميديفيد.
  5. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
  6. إعداد الحل الأجسام المضادة بعد 568 رابيت (1: 500) بتمييع ميكروليتر 0.5 من الأجسام المضادة رابيت-568 في 250 ميكروليتر أوفبلوكينج الحل في أنبوب 1.5 مل.
  7. تطبيق 250 ميليلتر من الأجسام المضادة بعد 568 رابيت الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  8. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
  9. اختياري: تطبيق 250 ميليلتر لحل عملي DAPI على طول كل شريحة، واحتضان الشرائح أفقياً لمدة 1 دقيقة على RT، محمية من الضوء.
  10. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق، مرتين.

7-تركيب والتصوير

  1. تحميل الشرائح مع 2 – 3 قطرات من زلة تغطية زجاج وتصاعد المتوسطة. السماح للشرائح لتجف O/N، شقة، عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
  2. انتقل إلى ابيفلوريسسينت أو مجهرية [كنفوكل].

النتائج

ميرنا التهجين في الموقع الأمثل على أبواب القلب الماوس باستخدام ميرنا التدافع و U6-سنرنا، كانت بمثابة عناصر سلبية وإيجابية على التوالي. يرد تلطيخ إيجابية باللون الأزرق، بينما تلطيخ سلبي يرد بعدم وضع اللون (الشكل 1A-1B). تم تقييم التعبير كارديوم?...

Discussion

يمكن تحقيق ميرنا نسخة الكشف من خلال التقنيات المختلفة التي تختلف في حساسية وخصوصية وكمية الطاقة. هنا، علينا أن نبدي اقتران ميرنا في الموقع التهجين مع إيمونوستاينينج ووصف بروتوكول يسمح لتقييم مستويات التعبير من جزيئات البروتين وميرنا، على نفس المقاطع القلب المتزامنة. نحن أولاً إظها?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

نود أن نشكر أثاناسيوس بابانجيليس، للتعليقات الانتقادية على المخطوطة. FM معتمد بواسطة التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BBSRC؛ BB/M009424/1). IP تدعمها "أمريكية قلب جمعية العلماء التنمية المنحة" (17SDG33060002).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DiethylpyrocarbonateSigma AldrichD5758DEPC
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417PBS
Tween-20American BioanalyticalAB02038non-ionic surfactant
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma Aldrich3115879001ProK
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148PFA
Sodium ChlorideThermoFisherS271NaCl
Magnesium Chloride HexahydrateThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 NThermoFisherSA48HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-MethylimidazoleSigma Aldrich336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma Aldrich39391EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrate dihydrateSigma AldrichS1804Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probeQIagenYD006157015'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP TabletsSigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
Potassium ChlorideThermoFisherP217KCl
DAPI solution (1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
Glass coverslipThermoFisher12-545EGlass coverslip
Plastic coverslipGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsSigma Aldrich11093274910DIG antibody
Hydrophobic barrier penVector LaboratoriesH-4000Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibodyAbcamab92546cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting MediumDAKOS3023mounting medium
Sheep serumSigma AldrichS3772
Goat serumSigma AldrichG9023
Deionized FormamideAmerican BioanalyticalAB00600
Hybridization OvenThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 LNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved