إلكترونيات مش حقن حقنه للكهربية القوارض المزمنة المستقرة

Summary

المسابر الإلكترونيات مش دمج بسلاسة، وتوفير مستوى مستقرة وطويلة الأجل والعصبية واحد تسجيل داخل المخ. هذا البروتوكول يستخدم شبكة إلكترونية للتجارب في فيفو ، التي تشمل تصنيع الإلكترونيات مش، تحميل إلى الإبر والحقن ستيريوتاكسيك وربط المدخلات والمخرجات، وتجارب تسجيل والأنسجة من الأنسجة التي تحتوي على شبكة تحقيقات.

Abstract

المجسات الكهربية الدماغ القابلة للغرس أدوات قيمة في علم الأعصاب بسبب قدرتها على تسجيل النشاط العصبي مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية من المناطق الضحلة والعميقة في الدماغ. وعرقل استعمالها غير أن بعدم التطابق الميكانيكية والهيكلية بين المجسات والدماغ الأنسجة التي عادة تؤدي إلى ميكروموشن وإشارة الدباق بسبب عدم الاستقرار في تجارب تسجيل المزمنة. وفي المقابل، بعد زرع الإلكترونيات مش أولترافليكسيبلي عن طريق حقن حقنه، تحقيقات الشبكة نموذج واجهة سلسة، خالية من الدباق مع أنسجة المخ المحيطة بها التي تمكن من تتبع الخلايا العصبية الفردية مستقرة على الأقل في السنة مقياس الوقت. تفاصيل البروتوكول هذه الخطوات الرئيسية في تجربة تسجيل العصبية ماوس المعتاد استخدام حقن حقنه مش الإلكترونيات، بما في ذلك تصنيع الإلكترونيات مش قياسية المستندة إلى الطباعة التصويرية عملية ممكنة في العديد من الجامعات، تحميل مش الإلكترونيات في الإبر الشعرية القياسية، وحقن ستيريوتاكسيك في فيفو، الاتصال من شبكة الإدخال/الإخراج للأجهزة القياسية الواجهات، مقيدة أو الانتقال بحرية جلسات تسجيل، وغذائها تمزيقها للدماغ الأنسجة التي تحتوي على شبكة إلكترونية. وتعرض التسجيلات العصبية التمثيلية وبيانات علم الأنسجة. وسيكون المحققون على دراية بهذا البروتوكول المعرفة اللازمة لدمج إلكترونيات مش في التجارب الخاصة بهم، والاستفادة من الفرص الفريدة التي يتيحها التفاعل العصبية مستقرة طويلة الأجل، مثل دراسات الشيخوخة العمليات، ونمو الدماغ، وأمراض المخ المرض.

Introduction

تطوير أدوات قادرة على رسم الخرائط في الدماغ مع قرار واحد-العصبية ذات أهمية أساسية لعلم الأعصاب وعلم الأعصاب. وقد أثبتت تكنولوجيات موسع للدراسات العصبية مثل المخ (EEG)، ماجنيتونسيفالوجرافي (MEG) والتصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (الرنين المغناطيسي الوظيفي) قيماً لربط نشاط الدماغ مع السلوك في البشر^{1، 2}، ولكنها تفتقر إلى القرار الزمانية المكانية اللازمة لدراسة بنية وديناميات الشبكات العصبية في ميكرومتر الأساسية وميلي ثانية بره على التوالي^3،4. تحقيقات معينة اليكتروكورتيكوجرافي (ECoG) وأساليب التصوير الضوئي استخدام الأصباغ المراعية للجهد قد نجحت في تسجيل واحد-وحدة التشويك النشاط في فيفو^5،6، ولكن هم عموما فعالة فقط قرب سطح الدماغ، الحد من انطباق لدراسات المناطق الضحلة الدماغ. وفي المقابل، يمكن قياس المجسات الكهربائية القابلة للغرس الكهربية العصبية واحد في الانتقال بحرية الحيوانات من أي منطقة الدماغ دون الحاجة لوضع العلامات الفلورية، يجعلها لا غنى عنه لعلم الأعصاب مستوى النظم، لا سيما كما دفعت بتقنيات ميكروفابريكيشن من صناعة أشباه الموصلات تعول القناة إلى مئات وآلاف^3،7،،من⁸⁹. حكم هذه القدرات، جعلت المجسات الكهربائية القابلة للغرس العديد من المساهمات الهامة لعلم الأعصاب، والأمراض العصبية، بما في ذلك الدراسات الأساسية لمعالجة المعلومات في نظام البصرية¹⁰، علاج العصبية اضطرابات مثل مرض باركنسون¹¹، والتدليل على واجهات المخ-الجهاز (بميس) للأطراف الاصطناعية متقدمة^12،13.

ومع ذلك، عدم الاستقرار الطويل الأجل يتبدى في التناقص ستريك سبايك وإشارات غير مستقر على الجداول الزمنية لأسابيع إلى أشهر^14،15 محدودة انطباق المسابير القابلة للغرس للدراسة لفترات قصيرة نسبيا الظواهر، وترك المسائل مثل شيخوخة الدماغ والتنمية إلى حد كبير دون إجابة. أوجه القصور في عدم الاستقرار الطويل الأجل نتيجة لعدم تطابق بين المسابر التقليدية وأنسجة المخ في الحجم، والميكانيكا، وطوبولوجيا^14،،من^1516،،من¹⁷¹⁸. ومن حيث الحجم، بينما نهايات الخلايا العصبية وسوماتا تقريبا عشرات نانومتر إلى عشرات ميكرومتر في القطر¹⁹، على التوالي، المسابر التقليدية غالباً ما تكون أكبر بكثير، في حالة السليكون ميكرويليكترودي صفائف > 4 مرات حجم خلية وحيدة الخلية الجسم^7،8. قد تعطل الحجم الكبير نسبيا لهذه التحقيقات بالهيكل الطبيعي واتصالات كثيفة من الأنسجة العصبية، وبالتالي المساهمة في الاستجابة المناعية المزمنة ومقاومة الدوائر العصبية التي تجري دراستها. فيما يتعلق بالخصائص الميكانيكية، المسابر التقليدية أقسى جذريا من الأنسجة العصبية لينة جداً التي زرعها فيه؛ تحقيقات حتى "مرنة" من 10 – 20 ميكرون أوراق سميكة من بوليميد أشد الأوقات 100,000 على الأقل من أنسجة الدماغ^20،21. يؤدي عدم التطابق هذا في الانحناء صلابة الحركة القص النسبي بين الأنسجة المسبار والدماغ، مما يؤدي إلى وحدة واحدة لا يمكن الاعتماد عليها تتبع خلال تسجيلات الموسعة وحمل الدباق المزمن في موقع غرس. أخيرا، هيكل طوبولوجي المسابر التقليدية الدماغ يستبعد بالضرورة وحدة تخزين صلبة من النسيج. مثل عدم تطابق في طبولوجيا يعطل الاتصال بالدوائر العصبية، ويحول دون توزيع إينتيربينيتراتيد (3D) ثلاثي الأبعاد الطبيعية للخلايا العصبية والخلايا الدبقية والأوعية الدموية داخل أنسجة المخ²²، ويعوق نقل 3D مما يشير إلى جزيئات²³. معا، هذه النواقص من المسابر التقليدية قد جعلها قاصرة عن التوافق طويلة الأجل سعى للتطبيقات السريرية والدراسات الطولية علم الأعصاب على مستوى واحد-العصبية.

للتغلب على أوجه القصور هذه، سعينا إلى طمس الخط الفاصل بين النظم الإلكترونية والعصبية بتطوير نموذج جديد من المجسات العصبية "الأنسجة مثل" وصف مش إلكترونيات^16،،من²¹²⁴. إلكترونيات مش يعالج المسائل المذكورة أعلاه مطابقة في الحجم، والميكانيكا، وطوبولوجيا بإدراج السمات (1) الهيكلية نانومتر نفسه بمقياس حجم ميكرومتر من الأنسجة العصبية، (2) الميكانيكية خصائص مماثلة لانسجة المخ، و (3) 3D طوبولوجيا ماكروبوروس هو > 90% فتح الفضاء وهكذا يستوعب تداخل الخلايا العصبية ونشرها من جزيئات من خلال البيئة خارج الخلية. شبكة إلكترونية يمكن تسليمها المسابير تحديداً إلى مناطق محددة من الدماغ عن طريق حقنه وابرة، مما تسبب في أضرار حادة الحد الأدنى بينما غرس حتى في أعماق الدماغ مناطق^،من²¹²⁵. سوما الخلايا العصبية ومحاور عصبية قد ثبت أن اخترق هيكل المسبار الإلكترونيات مش 3D مفتوحة داخل حقن بعد أسابيع، مما خلق واجهة سلسة، خالية من الدباق بين تسجيل الإلكترونيات والمحيطة بأنسجة الدماغ^{21 , 26 , 27}-ومكنت هذه الميزات الفريدة المسابير الإلكترونيات مش ستابلي تتبع نشاط التشويك من نفس الخلايا العصبية الفردية على مر على الأقل مقياس الوقت سنة²⁷. وعلاوة على ذلك، يوفر تصنيع الإلكترونيات مش استناداً إلى الطباعة التصويرية (رر) قابلية عالية لعدد الأقطاب الكهربائية التي يمكن إدراجها، مع قناة إثبات التهم أقطاب تصل إلى 128 كل قناع الاتصال بسيطة الطباعة الحجرية باستخدام المسبار ²⁸ والتوصيل والتشغيل إدخال/إخراج (الإدخال/إخراج) تصميم الذي يسمح للربط الكهربائي السريع للإلكترونيات الطرفية دون المعدات المتخصصة²⁹.

مجموعة واسعة من الدراسات قد تستفيد من دمج شبكة إلكترونية في البروتوكولات القياس. معظم إينتراكورتيكال تسجيل تجارب يمكن أن تستفيد من غرس مينيملي الداخلي مش الكترونيكس عن طريق حقن حقنه، انخفاض شديد الاستجابة المناعية بعد زرع، والقدرة على ترك مش الإلكترونيات في الأنسجة خلال الأنسجة اللاحقة وإيمونوستينينج لتحليل دقيق للبيئة البيولوجية المحيطة بكل موقع التسجيل. تجارب تسجيل المزمنة خاصة يستمد قيمة من قدرة شبكة إلكترونية فريدة من نوعها لتعقب عدد كبير من الخلايا العصبية الفردية لأشهر وسنوات. هذه القدرة تتيح فرصاً للدراسات مع قرار واحد-العصبية التي كانت سابقا غير عملي، مثل دراسات الشيخوخة طولية من الدوائر العصبية، والتحقيقات في المخ النامي وتحقيقات في الآلية المرضية ¹⁶من الاعتلال.

في هذا البروتوكول، يمكننا وصف جميع الخطوات الرئيسية في تجربة تسجيل العصبية ماوس المعتاد استخدام الإلكترونيات مش حقن حقنه (انظر الشكل 1). الخطوات المذكورة تشمل تصنيع الإلكترونيات مش في احتمال عملية قياسية المستندة إلى رر في العديد من الجامعات، تحميل الشبكة للإلكترونيات في القياسية الشعرية الإبر والحقن ستيريوتاكسيك لشبكة إلكترونية في فيفو، الاتصال شبكة الإدخال/الإخراج إلى واجهات الأجهزة القياسية وجلسات تسجيل ضبط النفس أو تتحرك بحرية، وتقطيع غذائها من أنسجة المخ التي تحتوي على الإلكترونيات مش. قد لا تتطلب بعض الباحثين استخدام الإلكترونيات مش فقط لدراسات علم الأنسجة الكهربائية التواصل والتسجيل، وفي هذه الحالة قد تخطي تلك الخطوات. بعد الاطلاع على هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون المحققون جميع المعارف الضرورية لاستخدام الشبكة الإلكترونية في التجارب الخاصة بهم.

Protocol

وافق جميع الإجراءات تقوم على مواضيع الحيوانات الفقارية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة هارفارد.

1-تصنيع الإلكترونيات مش

ملاحظة: الإجراء الموضح في هذا القسم معد للاستخدام داخل منشأة غرفة نظيفة جامعة قياسية، مثل المركز لأنظمة النانو (CNS) في جامعة هارفارد. هذا المرفق، فضلا عن مرافق مماثلة متاحة للمستخدمين الخارجيين في جميع أنحاء الولايات المتحدة، على سبيل المثال، كجزء من الوطنية تكنولوجيا النانو البنية التحتية شبكة (نين) دعم مؤسسة العلوم الوطنية (NSF). في هذه المرافق، العديد من الأدوات والمعدات، والمواد الموصوفة في هذا المقطع ترد جنبا إلى جنب مع الوصول إلى مرفق غرفة نظيفة ولا يتطلب شراء منفصلة.

تنبيه: كثير من المواد الكيميائية المستخدمة في تصنيع الإلكترونيات مش تعتبر خطرة، منها تقاوم ومؤتمر نزع السلاح--26، مزيل PG, المطور سو-8 وني النقش الحل. استشارة بطاقات بيانات سلامة المواد (MSDS) لهذه المواد الكيميائية قبل استعمالها وتنفيذ واتباع تدابير السلامة المناسبة في جميع الأوقات.

1. تتبخر حرارياً 100 نانومتر ني على رقاقة Si نظيفة.
   ملاحظة: معلمات الترسب النموذجية هي قاعدة ضغط 5 × 10^-7 طن ومعدل 1 – 2 Å/s. طبقة رقيقة من ني بمثابة طبقة الذبيحة التي يحل فيها لاحقاً بالإفراج عن الإلكترونيات مش من يفر.
2. استخدام قناع رر الأولى (رر القناع-1) لتحديد الجزء السفلي تخميل طبقة من الإلكترونيات مش مع سو-8 سلبي مقاوم الضوء (الشكل 2A).
   ملاحظة: رر هو أسلوب ميكروفابريكيشن قياسية التي هي لمعت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) على قناع المعقود على الركازة حساس. الضوء أما يجعل غير قابلة للذوبان (تقاوم السلبية) أو القابلة للذوبان (تقاوم الإيجابية) المناطق المكشوفة على الركازة. الأقنعة بمساعدة الكمبيوتر (CAD) تصميم البرمجيات وثم أمرت عادة من مورد. راصفة قناع يستخدم لمحاذاة أقنعة للأنماط القائمة على الركازة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية. تصنيع الإلكترونيات مش يتطلب أربعة أقنعة مختلفة (رر القناع-1 عن طريق قناع PL-4). التصاميم قناع متاحة عند الطلب أو من موقع المورد، meshelectronics.org.
   1. تدور-معطف 2000.5 سو-8 سلبي مقاوم الضوء على الرقاقة على 4000 لفة في الدقيقة لسمك سو-8 تقريبي 400 – 500 نانومتر.
   2. خبز لينة يفر على هوتبلت لمدة 1 دقيقة عند 65 درجة مئوية تليها 1 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
   3. تحميل يفر إلى راصفة قناع لفضح سو-8 مع رر 1-قناع المقابلة للطبقة السفلي مش سو-8. كشف في جرعة i-خط (من الطول الموجي نانومتر 365) من 100 مللي جول/سم².
   4. وظيفة خبز يفر على هوتبلت لمدة 1 دقيقة عند 65 درجة مئوية تليها 1 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
   5. تزج يفر في علبة من المطور سو-8. بلطف تحرض الحل لمدة 2 دقيقة حتى تم تطوير نمط شبكة في سو-8 تماما. شطف في علبة من كحول الأيزوبروبيل 1 دقيقة وضربه الجافة.
   6. جد خبز يفر على هوتبلت على 180 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: سو-8 من الصعب عادة خبز بين 150 درجة مئوية و 250 درجة مئوية بعد التنمية. خبز الثابت أنيالس أي الشقوق السطحية التي قد تشكل أثناء تطوير وزيادة كروسلينكس سو-8 لضمان الاستقرار الميكانيكية. جد الخبز على 180 درجة مئوية للطبقة السفلي سو-8 و 190 درجة مئوية للأعلى طبقة سو-8 تعطي نتائج جيدة للإلكترونيات مش.
3. اتصال وصلتي استخدام رر القناع-2 تعريف المعدن ومنصات الإدخال/الإخراج (الشكل 2).
   1. LOR3A معطف تدور على رقاقة 4000 لفة في الدقيقة لسماكة تقريبية من 300 نانومتر.
      ملاحظة: LOR3A أساس بوليديميثيلجلوتاريميدي تقاوم السرعات التي تضعف أثناء إجراء التلميع اللاحقة.
   2. خبز يفر على هوتبلت على 180 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. تدور-معطف S1805 مقاوم الضوء الإيجابية عند 4000 دورة في الدقيقة لسمك تقريبي 500 نانومتر.
   4. خبز يفر على هوتبلت على 115 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
   5. تحميل يفر إلى راصفة قناع لفضح اتصال وصلتي S1805 مع رر 2-قناع المقابلة للمعدن ومنصات الإدخال/الإخراج. كشف بجرعة 40 مللي جول/سم²ح-خط (من الطول الموجي نانومتر 405).
   6. تزج يفر في علبة من مؤتمر نزع السلاح--26 مقاوم الضوء المطور. بلطف تحرض الحل نمواً كاملا لكان 1 دقيقة حتى المعدن نمط اتصال وصلتي. شطف في علبة من المياه (DI) 1 دقيقة وضربه الجافة.
   7. تتبخر حرارياً 3 نانومتر Cr متبوعاً 80 نيوتن متر من الاتحاد الأفريقي.
      ملاحظة: ضغط على الأكثر 5 × 10^-7 ر قاعدة ومعدل الترسيب 1 Å/s عادة تعطي أفضل جودة للفيلم.
   8. تزج الرقاقة في دورق مسطح من PG المزيل لما يقرب من 3 ح حتى المعدن قد تقوض تماما، تاركاً المعدن فقط في التواصل المنشود ومناطق لوحة الإدخال/الإخراج لشبكة إلكترونية. شطف في كحول الأيزوبروبيل وضربه الجافة.
4. استخدام قناع PL-3 تحديد أقطاب حزب العمال (الشكل 2).
   1. كرر الخطوات من 1.3.1 من خلال 1.3.4.
   2. تحميل يفر إلى راصفة قناع لفضح S1805 مع رر 3-قناع المقابلة لأقطاب حزب العمال. كشف بجرعة 40 مللي جول/سم²ح-خط.
   3. تزج يفر في علبة من مؤتمر نزع السلاح--26 مقاوم الضوء المطور. بلطف تحرض الحل لمدة 1 دقيقة حتى تم تطوير نمط أقطاب حزب العمال تماما. شطف في علبة من دي 1 دقيقة وضربه الجافة.
   4. استخدام مبخر شعاع إلكترون بإيداع 3 نانومتر Cr متبوعاً 50 نيوتن متر من حزب العمال.
      ملاحظة: معلمات الترسب النموذجية هي ضغط قاعدة من 5 × 10^-7 طن ومعدل 2/s.
   5. تزج الرقاقة في دورق مسطح من PG المزيل لما يقرب من 3 ح حتى المعدن قد تقوض تماما، ترك حزب العمال فقط في مواقع القطب المنشود للإلكترونيات مش. شطف في كحول الأيزوبروبيل وضربه الجافة.
5. استخدام قناع PL-4 تحديد أعلى تخميل طبقة من الإلكترونيات مش مع سو-8 سلبي مقاوم الضوء (الشكل 2D).
   1. كرر الخطوات من الإصدار 1.2.1 من خلال 1.2.5، ما عدا تعريض مع قناع PL-4 المقابلة للطبقة العليا مش باسيفاتينج سو-8.
   2. جد خبز يفر في وميكروريف عند 190 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: هذا درجة حرارة 10 درجة مئوية أعلى من مثيلة لخبز الثابت من أسفل سو-8 (الخطوة 1.2.6). أعيد هذا درجة حرارة مرتفعة قليلاً تدفق أسفل سو-8، الأمر الذي أدى إلى دمج مع الطبقة العليا سو-8 وهكذا تشكل هيكل سو-8 واحدة مستمرة.
6. مش الإلكترونيات هي الآن إكمال (2E الشكل و الشكل 3)؛ الإفراج عنهم من يفر Si بتذويب الطبقة الذبيحة ني.
   1. علاج يفر مع الأكسجين البلازما في 50 واط لمدة 1 دقيقة. وهذا يكسد السطح سو-8، مما يجعل من ماء والسماح للشبكة سهولة تعليق في المحلول.
   2. في دورق مسطح، الجمع بين حمض الهيدروكلوريك وكلوريد الحديد دي حجمي بنسبة 1:1:20، على التوالي، لجعل حل تنميش ني.
   3. تزج الرقاقة في دورق مسطح من الحل تنميش ني لما يقرب من 3 ح حتى أفرج عن الإلكترونيات مش تماما من يفر سي.
   4. استخدام ماصة باستور نقل شبكة المفرج عنهم يسبر الإلكترونيات من تنميش ني إلى كوب 100 مل من دي. نقل الإلكترونيات مش لكوب طازجة من دي 3 مرات على الأقل لضمان الشطف.
   5. استخدام ماصة باستور نقل الإلكترونيات مش إلى حل 70/30 ٪ إيثانول ومياه لتطهير، ثم استخدم ماصة نقل الإلكترونيات مش إلى الماء المعقم الشطف.
      ملاحظة: بعد التعقيم، الإلكترونيات مش يمكن نقلها إلى حلول أخرى الروغان. على سبيل المثال، تعزيز التصاق الخلوية، يمكن نقل الإلكترونيات مش إلى محلول مائي من بولي-د-يسين (1 ملغ/مل) ح 24.
   6. استخدام ماصة باستور نقل الإلكترونيات مش يسبر لكوب 100 مل من الفوسفات x 1 العقيمة مخزنة المالحة (PBS) قبل الحقن في الجسم الحي.

2-تحميل من شبكة إلكترونية في الإبر

1. صاحب ماصة كشراء مفتوح أمام تدفق في كلا طرفي. ختم النهاية المقابلة لقفل المسمار التعميم مع الإيبوكسي، حتى لا يكون هناك لا تسرب أثناء الحقن (الشكل 4 أ). واسمحوا الإيبوكسي تتصلب قبل المتابعة.
2. أدخل إبرة شعرية زجاج في حامل ماصة. يثبت أنه في مكان باستخدام المسمار تشديد التعميم والغسالة مخروط (الشكل 4 باء). واستخدمت 400 ميكرون قطر داخلي (القطر الخارجي 650 ميكرومتر) زجاج إبرة شعرية لهذا البروتوكول. المواد الإبرة الشعرية الأخرى (على سبيل المثال. معدنية) وأقطار يمكن استخدامها ولكن قد يتطلب إجراء تغييرات في تصميم شبكة إلكترونية لضمان إينجيكتابيليتي.
   ملاحظة: استخدمت الإبر الشعرية تتراوح بين 150 ميكرومتر 1.17 mm القطر الداخلي (250 ميكرومتر في القطر الخارجي 1.5 مم) في المختبر. الحقن بالإبر أصغر يمكن أن تنهض بصنع زاوية التقاطع بين العرضي والطولي سو-8 مش عناصر أكثر حدة وتقليل عرض عنصر عناصر شبكة سو-8 واستخدام أرق سو-8 واستخدام خشونة (أي.، أكبر وحدة خلية) مش بنية. فوتوماسكس للشبكات المصممة لأصغر الإبر الشعرية متاحة عند الطلب أو من موقع المورد، meshelectronics.org. وتتوفر أيضا الزجاج الإبر الشعرية قطر داخلي من 400 ميكرون والقطر الخارجي من 550 ميكرون تجارياً. هذه تقليل الأضرار الأنسجة الحادة الناجمة عن الحقن في حين الحفاظ على التوافق مع الشبكات التي تتطلب قطرها داخلي 400 ميكرون، إلا أنها لم تستخدم في دراسات الموصوفة هنا.
3. إرفاق حقنه 1 مل إلى منفذ الجانب حامل ماصة استخدام طول 2 – 4 سم من الأنابيب الشعرية.
4. أدخل الإبرة الشعرية الزجاج في الكأس 100 مل من برنامج تلفزيوني يتضمن الإلكترونيات مش. ضع نهاية الإبرة قرب منصات الإدخال/الإخراج لشبكة الإلكترونيات التحقيق وسحب يدوياً المحاقن رسم تحقيق إلكترونيات مش في الإبرة (الشكل 5 و التكميلي فيديو 1).
   ملاحظة: منصات الإدخال/الإخراج، الجذعية تربط بين المنطقة، والمنطقة الجهاز مش يتم التعرف عليها بسهولة بالعين المجردة عندما يتم تعليق تحقيقات الإلكترونيات مش في الحل. وهذا يتيح التحميل لا لبس فيه للإلكترونيات مش إلى الإبر بالاتجاه الصحيح.
5. دفع/سحب المكبس حقنه في حين لا تزال مغمورة في المحلول الملحي ضبط موضع الإلكترونيات مش داخل الإبرة.
   ملاحظة: مثالية لتحديد المواقع مع منطقة الجهاز مش أولترافليكسيبلي كقرب نهاية الإبرة قدر الإمكان. هذا التكوين يقلل من حجم السوائل التي سيتم ضخها في الدماغ بينما يضمن يتم حقن المنطقة الجهاز أولاً ومنصات إدخال/إخراج آخر.
6. فصل الأنبوب الشعرية من مخرج الجانب حامل ماصة بعناية. فصل ببطء لتجنب خلق قوة شفط التي يمكن أن تغير موقف الإلكترونيات مش داخل الإبرة.

3-ستيريوتاكسيك حقن الإلكترونيات مش في الدماغ الفأرة حية

ملاحظة: تم تخديره الفئران بالحقن داخل مع مزيج ديكسدوميتور الكيتامين و 1 مغ/كغ 75 مغ/كغ. تم التحقق من درجة التخدير مع أسلوب قرصه تو قبل البدء في الجراحة. وأبقى على درجة حرارة الجسم عن طريق وضع الماوس على بطانية هوميوثيرميك 37 درجة مئوية بينما تحت التخدير. ونفذ أسلوب تعقيم السليم لعملية جراحية، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على التعقيم جميع الأدوات الجراحية معدنية 1 ح قبل الاستخدام، واستخدام قفازات معقمة، استخدام معقم حبة ساخنة في جميع أنحاء الجراحة، الحفاظ على حقل معقم حول موقع الجراحية وتطهير الأدوات البلاستيكية مع الإيثانول 70% وفروة الرأس ديبيلاتيد وقد هيأهم الجلد مع إيودوفور قبل شق. لعملية جراحية في البقاء على قيد الحياة، بعد انتهاء الجراحة، تم تطبيق مرهم أنتيوبيوتيك حول الجرح، وعاد إلى قفص مجهزة 37 درجة مئوية التدفئة لوحة الماوس. عدم ترك الفئران غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. أعطيت الفئران التسكين البوبرينورفين عن طريق الحقن داخل بجرعة 0.05 مغ/كغ من وزن الجسم كل 12 ح ليصل إلى 72 ساعة بعد الجراحة. وكانت الفئران المعزولة من الحيوانات الأخرى بعد عملية جراحية. كانت euthanized الفئران أما بالحقن داخل بينتوباربيتال بجرعة 270 مغ/كغ من وزن الجسم أو عن طريق نضح ترانسكارديال (راجع الخطوة رقم 6، 1). المحققين قد تشير إلى غايغر, et al. ³⁰، كيربي، et al. ³¹، وسبر، وآخرون. ³² للحصول على تفاصيل حول جراحة ستيريوتاكسيك القوارض.

1. تخدير الماوس وإصلاحه في إطار ستيريوتاكسيك.
2. تطبيق مواد التشحيم العين للعيون الماوس لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
3. استخدام حفر الأسنان والإطار ستيريوتاكسيك لفتح اوديما في الإحداثيات المطلوبة في الجمجمة. فتح اوديما ثانية بعيداً عن موقع الحقن للإدراج برغي التأريض الفولاذ المقاوم للصدأ أو الأسلاك.
4. إصلاح الركازة لقط الجمجمة مع الأسمنت الأسنان. قص فجوة واسعة حوالي 1 ملم في الركيزة لتحسين موثوقية هذه الخطوة قابلة للطي لاحقاً في هذا الإجراء.
   ملاحظة: قطع كبل مرن المسطحة (تقصي) إلى "L" شكل يعمل بشكل جيد (الشكل 7 أ)، على الرغم من أن العديد من المواد ستعمل طالما هم من سمك الصحيح ل 32-القناة صفر موصل القوة (زيف) الإدراج (مصممة للكابلات سميكة 0.05 مم ± 0.18).
5. جبل صاحب ماصة مع الإبرة التي تحتوي على الإلكترونيات مش على الإطار ستيريوتاكسيك باستخدام المشبك نهاية زاوية (الشكل 4 و الشكل 6A).
6. إرفاق منفذ الجانب حامل ماصة لتثبيتها باستخدام مضخة (الشكل 6) حقنه حقنه 5 مل حوالي 0.5 – 1 م طول الأنابيب الشعرية.
   ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات في الأنابيب الشعرية قبل توصيله إلى صاحب ماصة. يمكن أن يقطع التدفق أثناء حقن فقاعات ومنع تسليم سلس، الخاضعة للرقابة للإلكترونيات مش.
7. استخدم الإطار ستيريوتاكسيك لوضع طرف الإبرة في موقع البدء المطلوب داخل المخ.
   ملاحظة: تم تصميم المجسات الإلكترونية مش المستخدمة هنا مع تسجيل أقطاب تنتشر على طول من ca. 2 مم ومع القطب الأول يقع ca. 0.5 مم من الحافة بدءاً من الإلكترونيات مش (حافة أقصى اليسار في الشكل 3A). لهذا السبب، يجب تحديد إحداثيات ستيريوتاكسيك أن موقع البدء أعمق من منطقة الدماغ للفائدة 0.5 مم. انتشار وموقع من أقطاب تسجيل داخل شبكة إلكترونية يمكن تحديدها بحرية خلال عملية تصميم قناع ويجب أن يكون محدداً حتى أقطاب تسجيل تمتد region(s) الدماغ للفائدة كما أنها يتم حقنها على طول على ستيريوتاكسيك مسار.
8. تحديد موضع الكاميرا (الشكل 6B) لعرض الجزء العلوي من المسبار الإلكترونيات مش داخل الإبرة الزجاج. بعض البرامج تسمح للمستخدم برسم خط على الشاشة لوضع علامة على موضع الأصلي للإلكترونيات مش.
9. بدء التدفق بوضع مضخة الحقن بسرعة منخفضة الضغط ابدأ. 10 مل/ساعة معدل تدفق انطلاق نموذجية لقطر داخلي 400 ميكرون شعرية إبرة. زيادة معدل التدفق ببطء إذا لم تتحرك المسبار الإلكترونيات مش داخل الإبرة.
   ملاحظة: من المهم للتقليل من حجم السوائل التي تحقن في الدماغ كهذا يمكن أن تلحق الضرر الأنسجة المحيطة بمكان الحقن. وتتحقق أفضل النتائج مع حقن كميات أقل من 25 ميليلتر الواحدة 1 مم طول مش حقن. القيم المثالية أقل من نصف هذا الحجم؛ في المختبر، ونحن عادة حقن 10 – 50 ميليلتر الواحدة بطول 4 ملم حقن مش.
10. كما يبدأ التحقيق الإلكترونيات مش للتحرك داخل الإبرة، باستخدام إطار ستيريوتاكسيك لسحب الإبرة بنفس المعدل الذي المسبار الإلكترونيات مش هو حقنها، باستخدام الموضع الأصلي ملحوظ للإلكترونيات مش كدليل.
    ملاحظة: يسمح هذا الإجراء، ووصف أسلوب مجال الرؤية (FoV) حقن²⁵، للتسليم الدقيق للإلكترونيات مش إلى منطقة الدماغ مستهدفة دون كرومبلينج أو التفكك. وكثيراً ما يمكن تخفيض معدل التدفق حالما يبدأ التحقيق الإلكترونيات مش تتحرك داخل الإبرة. في المختبر، غالباً ما يطلب معدلات التدفق من 20-30 مل/ساعة للتغلب على الاحتكاك ثابتة بين الشبكة والجدران الإبرة الشعرية، ولكن يمكن ثم تخفيض المعدل 10 مل/ساعة مرة واحدة وقد تم الشروع في عملية الحقن. معدلات التدفق ووحدات حقن عادة أصغر للابر الشعرية القطر الأصغر حجماً.
11. ما زالت تتدفق المالحة وتراجعه الإبرة حتى الإبرة وقد خرجت في الجمجمة. وقف التدفق من مضخة الحقن.

4-المدخلات والمخرجات "التواصل"

ملاحظة: عند هذه النقطة، المسبار الإلكترونيات مش قد ضخت من نقطة البداية المنشودة داخل المخ على طول المسار الذي تم اختياره. وقد تم سحب الإبرة وهو فقط فوق اوديما مع شبكة اتصال وصلتي للإلكترونيات الممتدة من الدماغ بالإبرة والإدخال/الإخراج منصات لا يزال داخل الإبرة (الشكل 7). يستخدم هذا المقطع لوحة دوائر المطبوعة (ثنائي الفينيل متعدد الكلور؛ الرقم 7، 8 الشكل) واجهة للمسبار الإلكترونيات مش. يتصل ثنائي الفينيل متعدد الكلور موصل زيف موصل 32 قناة قياسية مكبر للصوت عن طريق الركيزة العزل أن يصبح الرئيس-المرحلة للتجارب تسجيل العصبية. مجلس تنسيق البرنامج قابل للتخصيص لاستيعاب مختلف مراحل رئيس تكوينات. تتوفر لدينا ملفات التصميم حسب الطلب أو من موقع المورد، و meshelectronics.org، ويمكن أن تستخدم لشراء ثنائي الفينيل متعدد الكلور غير مكلفة من موردي خدمات تصنيع والجمعية ثنائي الفينيل متعدد الكلور.

1. باستخدام إطار ستيريوتاكسيك لتوجيه الإبرة بعناية تقصي الحقائق والتوفيق لقط الركيزة وعبر الفجوة، تتدفق الحل مع المضخة حقنه لتوليد فترة سماح في الإلكترونيات مش اتصال وصلتي (الشكل 7).
2. مجرد الإبرة فوق الركيزة لقط وعبر الفجوة، استئناف تدفق بمعدل سريع لإخراج الإلكترونيات مش منصات الإدخال/الإخراج على الركازة لقط (الشكل 7).
3. استخدام الملقط وماصة دي، ينحني منصات الإدخال/الإخراج إلى ca. زاوية 90° كقريبة من لوحة الإدخال/الإخراج الأولى قدر الإمكان.
   ملاحظة: الانحناء ضروري للسماح لمنصات لإدراجه في الموصل زيف على ثنائي الفينيل متعدد الكلور في خطوة لاحقة. الموصل زيف هو بالضبط نفس العرض كمنصات الإدخال/الإخراج 32 مش المسبار الإلكترونيات، حيث ينحني الكمال 90°، أو منعطف لا تحدث أمام لوحة الإدخال/الإخراج الأولى، سيؤدي إلى الاضطرار إلى قطع منصات الإدخال/الإخراج (منصات أقصى اليسار في الشكل 7E).
4. حالما يتم محاذاة منصات الإدخال/الإخراج، تكشفت، بزاوية 90 درجة إلى مش الجذعية، الجافة لهم في المكان مع يتدفق بلطف ضغط والهواء.
   ملاحظة: يمكن ربطه مش الإلكترونيات تحقيقات مع قنوات أقل من 32 إلى مع واجهة 32 قناة المجلس نفسه. على سبيل المثال، يستخدم لدينا مختبر عادة مش 16-قناة الإلكترونيات تحقيقات مع 32 قناة ثنائي الفينيل متعدد الكلور. وهذا يوفر مساحة إضافية داخل الموصل زيف، مما يجعل التواصل أسهل، وهي قنوات المنقطعة إضافية التعرف عليها بسهولة كالدوائر المفتوحة عن طريق مقاومة اختبار أثناء تسجيل الدورات.
5. قص الركيزة لقط على حافة مستقيمة حوالي 0.5 – 1 مم من الحافة من منصات الإدخال/الإخراج. كما قطع أجزاء غريبة من الركازة لقط سوف تعوق الإدراج في موصل زيف 32 قناة محمولة على ثنائي الفينيل متعدد الكلور (7F الشكل).
6. إدراج منصات الإدخال/الإخراج في الموصل زيف ثنائي الفينيل متعدد الكلور، وأغلق المزلاج (الشكل 7). استخدام قياس إلكترونية لقياس المقاومة بين القنوات والمسمار الأرض لتأكيد نجاح التواصل. إذا كانت قيم مقاومة مرتفعة جداً، أونلاتش الموصل زيف وضبط الإدراج وتجربتها حتى يتم التأكد من الاتصال بنجاح.
7. تغطية الموصل زيف والكترونيات مش يتعرض اتصال وصلتي مع الأسمنت الأسنان للحماية. انعكاس ثنائي الفينيل متعدد الكلور في الفجوة في الركيزة، وإصلاح ثنائي الفينيل متعدد الكلور بالأسمنت على جمجمة الفأرة (الشكل 7 ح).
   ملاحظة: الانحناء تقصي الحقائق والتوفيق في الفجوة يقلل الضغط الميكانيكي الذي يمكن في بعض الأحيان كسر شبكة اتصال وصلتي للإلكترونيات.
8. السماح الأسمنت تتصلب، تحول ثنائي الفينيل متعدد الكلور في رأس-مرحلة قوية، والتعاقد للتواصل خلال الدورات اللاحقة تسجيل (رقم 7I).

5-العصبية تسجيل تجارب

1. ضع الماوس في تيلفينير أو غيرها ريسترينير³³. إدراج المضخم ثنائي الفينيل متعدد الكلور في موصل قياسي مكبر للصوت على ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرأس-المرحلة. استخدم كبل منفصل للأرض إشارة المسمار.
2. لتسجيلات ضبط النفس، ترك الماوس في ريسترينير. تسجيل البيانات باستخدام نظام الحصول على البيانات للفترة الزمنية المطلوبة (الشكل 8 أ).
3. للانتقال بحرية التسجيلات، حرر زر الماوس من ريسترينير بعد إدراج المضخم ثنائي الفينيل متعدد الكلور، وأسس مرجعية المسمار. سجل للطول المطلوب من الوقت باستخدام نظام حيازة البيانات بينما الماوس يتصرف بحرية (8B الشكل).
4. في نهاية الدورة التسجيل، وضع الماوس مرة أخرى في ريسترينير، إذا لزم الأمر. إزالة سلك التأريض والمضخم، ثم حرر زر الماوس مرة أخرى إلى قفصة وإعادته إلى مرفق الحيوان حتى الدورة التالية في التسجيل.

6-نسيجية تمزيقها والتلوين والتصوير

1. الانتظار حتى الحقن بعد انتهاء الوقت المطلوب، ثم تخدير الماوس ونتخلل ترانسكارديالي مع فورمالدهايد. إزالة وتجميد كريوسيكشن الدماغ إلى شرائح سميكة 10 ميكرون. يمكن العثور على بروتوكول مفصلة بشأن إيمونوهيستوتشيميستري وكريوسيكتيونينج من أنسجة الدماغ القوارض في افيلسيزور، وآخرون. ³⁴.
   ملاحظة: يمكن الثابتة أنسجة المخ التي تحتوي على الشبكة الإلكترونية ومقطوع عادة، حتى ولو ترك الإلكترونيات الرصد داخل. وهذا هو قدرة فريدة من نوعها مقارنة بالمجسات العصبية التقليدية، التي يجب إزالتها قبل تمزيقها وذلك قد تعدل الأنسجة أو تجعل من الصعب على تحليل واجهة المسبار-الأنسجة.
2. شطف مقاطع أنسجة الدماغ المجمدة 3 مرات في 1 x PBS.
3. كتلة المقاطع في حل من 0.3% تريتون X-100 و 5% الماعز مصل في برنامج تلفزيوني 1 x. السماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة ح 1.
4. احتضان الفروع مع الحل الأجسام الأولية. وكانت الحلول جسم الأولية المستخدمة هنا أرنب المضادة-NeuN (تخفيف 1: 200) والماوس المضادة نيوروفيلامينت (1: 400 تمييع) والفئران مكافحة--توصيني (تخفيف 1: 500) مع 0.3% Triton X-100 و 3% الماعز المصل. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
5. أشطف أقسام 9 مرات لما مجموعة 40 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1 x.
6. احتضان الفروع الدماغ مع الحل من الأجسام المضادة الثانوية. وكانت الحلول جسم الثانوية المستخدمة هنا أليكسا فلور 488 الماعز المضادة أرنب (تخفيف 1: 200) واليكسا فلور 568 الماعز المضادة الماوس (تخفيف 1: 200) واليكسا فلور 647 الماعز لمكافحة الفئران (تخفيف 1: 200). احتضان الفروع ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
7. أشطف أقسام 9 مرات ليصبح مجموع 30 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1 x.
8. جبل المقاطع على الشرائح الزجاجية باستخدام مونتانت أنتيفادي كوفيرسليبس. اترك الشرائح في الظلام لمالا يقل عن 24 ساعة قبل التصوير.
9. صورة الشرائح مع مجهر [كنفوكل] استخدام 488 نانومتر، 561 شمال البحر الأبيض المتوسط، و 633 نانومتر الليزر كمصادر الإثارة لفلور أليكسا 488، 568 فلور أليكسا واليكسا فلور 647، على التوالي. استخدام التدخل التفاضلية التباين (DIC) إلى صورة الإلكترونيات مش على المجهر نفسه تتراكب اللاحقة للصور وتحليلها.

النتائج

وسوف تختلف النتائج استناداً إلى الأنواع الحيوانية في الدراسة، الوقت المنقضي منذ حقن مقدار الأضرار الحاد خلال الحقن، والنجاح للإدخال/الإخراج التواصل الداخلي، بين عوامل أخرى، منطقة الدماغ المستهدفة. قد لا تظهر نشاط التشويك وحدة واحدة حتى يوم 1 (في حالة 150 ميكرومتر الإبر القطر الداخلي) لأسبوع واحد بعد يمكن أن تختلف ستريك الحقن وارتفاع يصل إلى 4 – 6 أسابيع. ويبين الشكل 9 بيانات تمثيلية الكهربية من تحقيق إلكترونيات 32 قناة مش حقن في قرن آمون وقشرة somatosensory الأولية الماوس C57BL/6J الذكور البالغين. وسجلت حوالي 300-µV السعة الميدانية المحلية إمكانيات (لفبس) على جميع القنوات 32 وتم تسجيل واحد-وحدة النشاط التشويك على قنوات 26. وظلت لفبس ومعزولة من طفرات مماثلة بين 2 و 4 أشهر، مما يشير إلى واجهة عالية مستقرة بين تسجيل للإلكترونيات والخلايا العصبية على مدى هذه الفترة الزمنية الممتدة. يبين الشكل 10 نتائج تمثيلية لتقطيع غذائها وإيمونوستينينج من أنسجة المخ التي تحتوي على الإلكترونيات مش 1 سنة بعد الحقن. تلوين ل NeuN، علامة للعصبية سوماتى، ونيوروفيلامينت، علامة لمحاور عصبية العصبية، يكشف إلى أي خسارة القليل من كثافة الأنسجة في موقع الحقن، مما يعني ضمناً التواصل السلس بين الأنسجة للإلكترونيات والدماغ مش. تلطيخ توصيني (علامة ل astrocytes) كذلك يكشف عن مستويات قرب الخلفية astrocytes حول الإلكترونيات مش، مشيراً إلى أن وجودها يتسبب الاستجابة المناعية المزمنة قليلاً.

رقم 1: الخطوات في حقنه-حقن مش تجربة الإلكترونيات. ويصف هذا البروتوكول جميع الخطوات الرئيسية في تجربة نموذجية تسجيل العصبية القوارض باستخدام الشبكة للإلكترونيات. تجارب يستتبع عادة، في أمر التنفيذ، (1) تصنيع الإلكترونيات مش، (2) التحميل من شبكة إلكترونية إلى الإبر الشعرية، حقن (3) ستيريوتاكسيك للإلكترونيات مش في الدماغ، والإدخال/الإخراج (4) الكهربائية التواصل مش الإلكترونيات وتسجيلات مقيدة أو تتحرك بحرية (5) (6) مش/الأنسجة تمزيقها وتلطيخ لعلم الأنسجة. في بعض الدراسات، فقد رغبت في علم الأنسجة في البيانات فقط، في هذه الحالة يمكن تخطي الخطوات (4) و (5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: التخطيطي تصور إجراء تصنيع الإلكترونيات شبكة التوصيل والتشغيل في منطقة الجهاز أولترافليكسيبلي (الصف العلوي)، وقف اتصال وصلتي المنطقة (الصف الأوسط)، ومنطقة الإدخال/الإخراج (الصف السفلي)- (أ) هو منقوشة سو-8 سلبي مقاوم الضوء (الأحمر) مع قناع PL-1 تعريف أسفل تخميل طبقة لكل مسبار الإلكترونيات شبكة التوصيل والتشغيل. (ب) الزخرفة مع قناع-2 والتبخير الحراري زنتها معدنية رر تعريف الاتحاد الأفريقي اتصال وصلتي ومنصات الإدخال/الإخراج (الذهب). تعريف الزخرفة (ج) مع قناع-3 والتبخر شعاع الإلكترون زنتها معدنية رر أقطاب حزب العمال (أزرق). (د) هو منقوشة سو-8 سلبي مقاوم الضوء (الأحمر) مع قناع PL-4 تحديد الطبقة العليا باسيفاتينج. يتم ترك فتحات في سو-8 في كل قطب حزب العمال ولوحة الإدخال/الإخراج. (ﻫ) بإكمال مش المسبار الإلكترونيات مع مربعات المتقطعة التي تشير إلى مواقع الموسع في الأعلى والأوسط، وأسفل الصفوف. تتوفر ملفات تصميم النبائط بطلب من مقدمي البلاغ أو من موقع المورد، meshelectronics.org. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: صور فوتوغرافية وصور المجهر الضوئي للتوصيل والتشغيل مش الإلكترونيات. (أ) تجانب صور المجهر الضوئي للإلكترونيات مش حقن حقنه التحقيق مع الإدخال/الإخراج التوصيل والتشغيل. وكان تصويرها التحقيق بعد انتهاء التصنيع الخطوات في الشكل 2 ولكن قبل إطلاق سراح من الركازة المغلفة ني. متقطع مربعات تتوافق مع اليسار إلى اليمين إلى المقاطع من الجهاز أولترافليكسيبلي المنطقة، ووقف، وإدخال/إخراج المنطقة تضخيم في جيم ودال وهاء، على التوالي. مقياس بار = 1-(ب) صورة فوتوغرافية لرقاقة سي 3 بوصة تحتوي على 20 أكمل مش المجسات الإلكترونية. شريط المقياس = 20 مم-(ج) الضوئي المجهر صورة 20 ميكرومتر تسجيل حزب العمال أقطاب القطر في منطقة الجهاز أولترافليكسيبلي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د) الضوئي المجهر صورة الاتحاد الأفريقي عالي الكثافة اتصال وصلتي في منطقة الجذع. ربط الاتحاد الأفريقي كل معزولة كهربائياً ويتصل قطب نقطة واحدة للوحة الإدخال/إخراج واحد. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ﻫ) الضوئي المجهر صورة من منصات الإدخال/الإخراج. كل لوح يتكون من منطقة مش قابلة لطي ومنطقة غشاء رقيق مستمر الموجود في الساق. شرائط سو-8 إجراء عدم توصيل أجزاء شبكة منصات معا للمساعدة في الحفاظ على محاذاة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: الجمعية جهاز لعقد الإبر الشعرية خلال الحقن. (أ) صورة فوتوغرافية لمكونات الجهاز. وتشمل المكونات إبرة شعرية زجاج (1)، (2) حامل ماصة، وقفل المسمار دائرية (3) لصاحب ماصة، وغسالة مخروط (4) لصاحب ماصة. العناصر (2) من خلال (4) المضمنة مع شراء حامل ماصة. ويمثل السهم مخرج صاحب ماصة الذي يحتاج إلى أن يكون ملتصقاً مغلقة مع الإيبوكسي. (ب) صورة فوتوغرافية لصاحب ماصة بعد الجمعية والإدراج من إبرة الشعرية الزجاج. الإيبوكسي وأضاف مرئياً عند مخرج أعلى حامل ماصة (تميز بالسهم) والأنابيب الشعرية يربط صاحب ماصة لحقنه (غير معروضة). (ج) صورة فوتوغرافية لصاحب ماصة والإبرة الشعرية بعد الإلحاق بالإطار ستيريوتاكسيك مع المشبك نهاية الزاوية اليمنى. هي أشرطة مقياس 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: تحميل من شبكة إلكترونية في الإبر الزجاج. (أ) التوضيح التخطيطي للتحميل إجراء للإلكترونيات شبكة التوصيل والتشغيل. يتم وضع إبرة زجاج قرب نهاية الإدخال/الإخراج للتحقيق للإلكترونيات مش في حين أنه تم تعليق في الحل. ثم تراجع عن المكبس حقنه هو يدوياً رسم في التحقيق الإلكترونيات مش. مثالية لتحديد المواقع بمنطقة أولترافليكسيبلي الجهاز فقط داخل نهاية الإبرة. (ب) الصور المقابلة إلى (أ) التحقيق الإلكترونيات مش يجري تحميلها في إبرة زجاج. تغيير حجم أشرطة = 2 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: التخطيطي لمحطة جراحة ستيريوتاكسيك- يستخدم يجهز إطار ستيريوتاكسيك (A) مع حامل الماصة المرفقة ضع الإبرة إلى منطقة الدماغ المطلوب. موقف إبرة والإلكترونيات مش محملة تراقب مع عدسة الهدف وتعلق الكاميرا (ب) وعرضها على جهاز كمبيوتر (ج). مضخة الحقن (د) تدفقات كميات دقيقة من المياه المالحة من خلال الإبرة، مما يسمح لحقن دقيقة، والتي تسيطر عليها للإلكترونيات مش في منطقة الدماغ المرجوة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 7: الإدخال/الإخراج التوصيل والتشغيل التواصل الداخلي. يتم تأمين (A) "تقصي الحقائق والتوفيق" لقط الركازة مع الأسمنت الأسنان المجاورة اوديما. (ب) إلكترونيات شبكة التوصيل والتشغيل يتم حقن ستيريوتاكسيكالي في منطقة الدماغ المطلوبة باستخدام الأسلوب فوف. التحقيق لا يزال داخل الإلكترونيات (ج) الإبرة، مع منصات الإدخال/الإخراج للشبكة، يتم تغيير موضع أكثر تقصي الحقائق والتوفيق لقط الركازة. يتم استئناف تدفق (د) عن طريق الإبرة لإخراج منصات الإدخال/الإخراج على تقصي لقط الركازة. (ﻫ) منصات الإدخال/الإخراج هي بنت 90 ° بالنسبة إلى الساق، تكشفت مع الجانب إجراء مواجهة، وتجفف في مكان. قطع الركازة (F) تقصي الحقائق والتوفيق مع مقص ca على الخط المستقيم. 0.5 مم من الحافة من منصات الإدخال/الإخراج. يتم قطع الركازة الزائدة بعيداً للسماح بالإدخال في موصل زيف 32 قناة. (ز) الإدخال/الإخراج منصات تندس في موصل زيف 32 قناة محمولة على ثنائي الفينيل متعدد الكلور مخصصة. رابط زيف هو مغلق مغلق لجعل الاتصال مع منصات الإدخال/الإخراج. (ح) المزلاج هو عزز مغلقة، ثنائي الفينيل متعدد الكلور هو انقلبت على الجمجمة، وهو ثابت ثنائي الفينيل متعدد الكلور في المكان مع الأسمنت الأسنان. (أنا) "ثنائي الفينيل متعدد الكلور" أشكال هيدستاجي مدمجة مع موصل قياسي مكبر للصوت للتواصل السهل أثناء تسجيل الدورات. تغيير حجم أشرطة = 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8: تسجيلات مقيدة وتتحرك بحرية- (أ) صورة لماوس C57BL/6J الذكور في ريسترينير خلال جلسة تسجيل. تم إدراج ثنائي الفينيل متعدد الكلور المضخم 32 قناة توصيل مكبر للصوت القياسية. (ب) صورة فوتوغرافية للماوس نفسها مع 32 قناة المضخم ثنائي الفينيل متعدد الكلور أثناء تجربة تسجيل تتحرك بحرية. تغيير حجم أشرطة = 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 9: نتائج تسجيل العصبية التمثيلية. (أ) ممثل طابعات الحجم الكبير خرائط الحرارة من 32 قناة مش المسابير الإلكترونيات يحقن بالماوس قرن آمون وقشرة somatosensory. وسجلت البيانات بينما الماوس استكشاف بحرية قفصة في شهرين (أعلى)، والحقن بعد 4 أشهر (أسفل). طابعات الحجم الكبير السعة مرمزة وفقا لشريط اللون إلى اليمين. يتم تراكب عالية تمرير آثار المصفاة (أسود) عرض النشاط التشويك على الطيفية لكل القنوات 32. (ب) المسامير معزولة بعد فرز البيانات المرسومة في (أ). تم الكشف عن نشاط واحد-وحدة التشويك على 26 32 قنوات كل شهرين بعد الحقن (أعلى) وحقن بعد 4 أشهر (أسفل). وتناظر الأرقام أعلاه كل مجموعة من المسامير أرقام القنوات في (أ). وقد تم تعديل هذا الرقم من فو, et al. ²⁸- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 10: نتائج الأنسجة التمثيلية. التخطيطي (A) التي توضح اتجاه الإلكترونيات مش داخل أفقي (الفريق الأوسط) والسهمي شرائح المخ (أسفل اللوحة). (ب) صورة مجهر الأسفار شريحة سميكة من الدماغ القشرية 10 ميكرون سنة واحدة بعد حقن التحقيق الإلكترونيات مش 16-قناة. وكان الشريحة إيمونوستينيد ل NeuN (أخضر). (ج) شريحة الدماغ نفسه إيمونوستاينيد نيوروفيلامينت (أحمر). (د) إيمونوستينيد الدماغ نفسه على شريحة توصيني (السماوي). (ﻫ) صورة مركبة من (ب) من خلال (د) عرض مش الإلكترونيات/الأنسجة الواجهة مع المسمى NeuN (الأخضر)، نيوروفيلامينت (أحمر)، توصيني (سماوي)، وشبكة الإلكترونيات (أزرق). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من فو et al. ²⁷- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلي فيديو 1: تكرار التحميل وحقن للإلكترونيات مش في حل. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

جميع الخطوات في التصنيع واستخدام الإلكترونيات مش مهم، ولكن هناك عدد قليل من الأهمية. قبل الإفراج عن الإلكترونيات مش من أصدقائهم ويفر، من الضروري لأكسدة سطح جعل تنسجم سهولة علقت في المحلول (الخطوة 1.6.1). إذا كان يتم تخطي هذه الخطوة وتنسجم عادة تطفو على سطح الماء، ويجعلها صعبة لتحميل إلى الإبر، وإذا كان يمكن تحميلها، أنها عصا غالباً إلى جانبي الإبر الزجاج، تتطلب كميات كبيرة (> 100 ميليلتر) للحقن. يجب أن يكون عدم أكسدة السطح قبل الإصدار، لذلك، عادة ما يعني أنه لا يمكن استخدام الشبكات والتلفيق إعادة تنفيذه من البداية. خطوة حاسمة أخرى هي الانحناء الإلكترونيات مش "وقف" إلى ~ 90° أثناء الإدخال/الإخراج التواصل (الخطوة 4، 3). إذا كانت الزاوية أقل من 90°، ثم جميع منصات الإدخال/الإخراج 32 سوف لا تناسب الموصل زيف؛ بعض يجب أن تكون قطع نهاية للسماح بالإدراج، خفض عدد أقطاب متصلة. العملية يجب أيضا القيام بلطف منع تنبع من الانفصال.

يمكن تخصيص تصميم شبكة إلكترونية لمختلف التطبيقات بتعديل فوتوماسكس واستخدام نفس الإجراء تلفيق المبينة في الشكل 2. على سبيل المثال، حين المسابير الإلكترونيات مش المستخدمة لتسجيل البيانات في الشكل 9 صممت لأقطاب تسجيل 32 تمتد الماوس قرن آمون وقشرة somatosensory الأولية، يمكن وضع قطب كهربائي ضمن الشبكة أولترافليكسيبلي المحدد لاستهداف أي تقريبا region(s) الدماغ، أو أقطاب أكبر للتحفيز يمكن إدراج²⁷. يتم الاحتفاظ بنفس الشبكة الأساسية الهيكل وتلفيق الإجراء، ولكن يتم ضبط موضع القطب والتصميم لتلبية احتياجات الدراسة. المحققين ينبغي توخي الحذر، ومع ذلك، ودائما الاختبار أن التصاميم المعدلة يمكن حقنها بسهولة عن طريق الإبر المقصود. يمكن أن يكون التغييرات الصغيرة لميكانيكا الانحناء للإلكترونيات مش آثار كبيرة على إينجيكتابيليتي. واحد هذه الأمثلة هو أن غلة بزاوية 45 درجة بين شرائط سو-8 العرضي والطولي إلكترونيات مش تحقيق الذي يمكن أن يكون حقن فاسيليلي ولكن بزاوية 90° النتائج في أحد يتكوم والسدادات الإبر²¹.

قياس مقاومة أقطاب تسجيل مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ينبغي أن يكون قطب Pt دائرية قطرها 20-ميكرومتر حجم مقاومة قرب MΩ 1 عندما تقاس بتردد من 1 كيلو هرتز في فيفو أو 1 ײ⁹من برنامج تلفزيوني. مقاومة أكبر بكثير من هذا يعني ضمناً أن مسرى لا يتعرض، كما قد يحدث إذا أنها ملوثة ببقايا مقاوم الضوء، أو كهربائياً غير متصل. قد تحدث هذه الأخيرة إذا، على سبيل المثال، هناك غبار على قناع الصور أثناء رر أن النتائج في قطع اتصال الاتحاد الأفريقي في اتصال وصلتي، أو إذا كانت واحدة من منصات شبكة الإدخال/الإخراج لا يتم الاتصال بدبابيس رابط زيف أثناء التواصل الإدخال/الإخراج. حجم مقاومة ما يقرب من نصف القيمة المتوقعة تشير إلى أنه قد قلل القناة إلى واحدة متجاورة، إنشاء دارة من اثنين القطب ممانعات بالتوازي مع بعضها البعض. القيم المقاسة مقاومة تعمل كدليل أثناء استكشاف الأخطاء وإصلاحها؛ جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري الضوئي من المسابر الإلكترونيات مش، مصدر المشكلة يمكن عادة تحديد وتصحيح تبعاً لذلك في تلفيق المقبل تشغيل أو محاولة ربط الإدخال/الإخراج.

استخدام الإلكترونيات مش حقن حقنه للدراسات الحادة محدودة في هذا النشاط التشويك وحدة واحدة لا تحترم عادة حتى الأسبوع 1 وظيفة حقن²⁷، على الرغم من أن العمل الأخيرة (غير منشورة) يبين سهولة التغلب على هذه المشكلة. المحددات الرئيسية للوقت المطلوب لرؤية النتوءات النشاط هي الشبكة تصميم وحجم السوائل التي تحقن في الدماغ جنبا إلى جنب مع شبكة إلكترونية، والقطر من الإبرة المستخدمة للحقن، كما تؤثر هذه على درجة تلف الأنسجة خلال حقن ومعدل الشفاء. كميات كبيرة من الحقن قد يكون مطلوباً إذا الإلكترونيات مش لا تعامل مع الأكسجين في البلازما قبل الإفراج في تنميش ني؛ فإذا لم يكن عيون ماء، يمكن أن تنضم إلى الإبرة الزجاج. في بعض الأحيان، قد تنسجم العيوب التي تؤدي إلى الانحناء ميكانيكا مما يجعلها صعبة لحقن. أثناء تحميل الإلكترونيات مش، من المهم التحقق من أن تنسجم تتحرك بسهولة وسلاسة داخل الإبرة (كما هو موضح في التكميلية الفيديو 1). إذا لم يكن الأمر كذلك، ينبغي أن يكون استخدام مجس إلكترونية شبكة مختلفة. أفضل النتائج للتواصل السلس العصبية سيتحقق مع أحجام 10 – 50 ميليلتر الواحدة 4 مم لطول مش حقن حقن مثالية. حقن نتائج أكثر حداثة مع تحقيقات الإلكترونيات مش الدقيقة و/أو إظهار أصغر قطر الشعرية الإبر (صغيرة مثل القطر الداخلي 150 ميكرومتر، 250 ميكرون القطر الخارجي) يمكن ملاحظة أن وحدة واحدة النتوءات من بعد وقت قصير من الحقن (قياسات الحادة) من خلال أوقات أطول. قناع تصميم ملفات لهذه الهياكل الدقيقة مش متوفرة عند الطلب أو من موقع المورد، meshelectronics.org. نحن تقدير العائد الإجمالي في فيفو مش حقن إجراءاتنا باستخدام 400 ميكرون القطر الداخلي (القطر الخارجي 650 ميكرومتر) الإبر إلى حوالي 70%، على الرغم من أن العائد أقرب إلى 80 – 90% لعملنا أكثر حداثة مع 150 ميكرومتر القطر الداخلي (250 ميكرون القطر الخارجي ) الإبر. الأسباب الأكثر شيوعاً للفشل هي (1) أن الشبكة لم تضخ بسلاسة، نتج عنه وذمة الدماغ من وحدات حقن كبيرة بشكل غير متوقع إلى الدماغ، والكسر (2) مش خلال التلاعب اليدوي المطلوب في الإدخال/الإخراج التواصل الداخلي، و (3) نزيف من إتلاف الأوعية الدموية أثناء الحقن. إتلاف الأوعية الدموية خلال الحقن نادر (قضية أقل من 10% من حالات الفشل) ويمكن خفض المزيد باستخدام الجراحة الموجهة بصورة. ونلاحظ أيضا أن تلف الأوعية الدموية حد مشترك من جميع الإجراءات التي تنطوي على اختراق أنسجة المخ، بما في ذلك حقن الجسيمات الفيروسية تعداء، وغرس المسابير الدماغ الجامدة، وحقن للإلكترونيات مش.

المسابر الإلكترونيات مش قادرون على سجل من ستابلي وتتبع نفس الخلايا العصبية الفردية على الأقل أشهر إلى السنة الجداول الزمنية واستحضار تكاد لا توجد استجابة مناعية مزمنة، كما هو موضح في الشكل 9 و الرقم 10، على التوالي. وهذا يمثل ميزة كبيرة مقارنة بالاتفاقية عمق أقطاب، التي تعاني عادة من تناقص ستريك سبايك وإشارات غير مستقرة، والتهاب مزمن على مدى طويل الأجل تسجيل تجارب^{14، 15}-بالإضافة إلى ذلك، الإلكترونيات مش ميزة أن أنها يمكن أن تترك في الأنسجة أثناء تقطيع غذائها، التلوين، والتصوير، وعلى النقيض من المسابر التقليدية، التي هي صارمة جداً ويجب إزالة ذلك قبل علم الأنسجة التحليلات. ومن ثم، تسمح الإلكترونيات مش قدرة فريدة على استخدام التحليل المناعي لدقة دراسة البيئة الخلوية المحيطة بكل موقع التسجيل.

البروتوكول قدم هنا يفتح حتى مثيرة فرصاً جديدة في علم الأعصاب. طريقة التسليم كسبها والتكامل السلس للإلكترونيات مش مع أنسجة المخ يقلل من تعطل الدوائر العصبية ويتجنب الاستجابة المناعية المزمنة، التي يمكن أن تستفيد معظم أنواع التجارب تسجيل العصبية المزمنة. قدرة شبكة إلكترونية لتسجيل وتتبع نفس الخلايا العصبية وحيدة لفترات طويلة من الزمن ستكون خاصة تهم المحققين تسعى إلى الربط بين نشاط التشويك مللي ثانية على نطاق عمليات الشهر إلى سنوات طويلة مثل الشيخوخة، المرضية لأمراض الدماغ، أو الدماغ التنمية^16،18. بالإضافة إلى ذلك، هناك فرص كبيرة توسيع وتخصيص هذا البروتوكول، مثل إضافة إلكترونيات النشطة لثنائي الفينيل متعدد الكلور الرأس-مرحلة لتنفيذ وظائف مثل الرقمية المتنوعة³⁵من^8،، لاسلكية الاتصالات^35،،من³⁶³⁷، و³⁵، شارك حقن الخلايا الجذعية أو البوليمرات مع الإلكترونيات مش للمساعدة في تجديد الأنسجة^{18،38، معالجة الإشارات 39}، ودمج أسلاك متناهية الصغر الميدان – تأثير الترانزستورات (NW-[فتس]) إلى مش الإلكترونيات للغاية مترجمة ويَسْبِر الدماغ متعدد الوظائف^24،،من^{2940،41 ،42}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motorized stereotaxic frame	World Precision Instruments	MTM-3	For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller	Intan Technologies	C3004	A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board	Intan Technologies	C3314	A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable	Intan Technologies	C3213	A component of the neural recording system
Mouse restrainer	Braintree Scientific	TV-150 STD	Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers	Nova Electronic Materials		3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats & 6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass)	Advance Reproductions		Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator	Sharon Vacuum		Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist	MicroChem Corp.		Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner	Karl Suss Microtec AG		Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer	MicroChem Corp.		Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist	MicroChem Corp.		Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist	Microposit, The Dow Chemical Company		Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer	Microposit, The Dow Chemical Company		To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater	Reynolds Tech		For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system	AST Products, Inc.		Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator	Denton Vacuum		For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG	MicroChem Corp.		Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution	MG Chemicals	415-1L	A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution	Kanto Corp.		A component of Ni etching solution
Glass capillary needles	Drummond Scientific Co.		Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type	Molecular Devices, LLC	1-HL-U	Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe	NORM-JECT®, Henke Sass Wolf		Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing	Becton Dickinson and Company		Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe	Becton Dickinson and Company		Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera	Thorlabs Inc.	DCC1240C	Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras	Thorlabs Inc.		Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill	Osada	3144-830	For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr	Fine Science Tools	19007-09	For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm	Fine Science Tools	18000-50	Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument	Leica Microsystems		Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100	Life Technologies		Used for histology
5% goat serum	Life Technologies		Used for histology
3% goat serum	Life Technologies		Used for histology
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab177487	Used for histology
Mouse anti-Neurofilament	Abcam	ab8135	Used for histology
Rat anti-GFAP	Thermo Fisher Scientific Inc.	PA516291	Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific Inc.	P36930	Used for histology
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich Corp.	P6407-5MG	Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp	Thorlabs Inc.	RA180/M	Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB)	Advanced Circuits		Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector	Omnetics Connector Corp.	A79024-001	Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC)	Molex, LLC	152660339	Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector	Hirose Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	Component assembled onto the PCB