Siringa-iniettabili Mesh elettronica per elettrofisiologia roditore cronica stabile

Riepilogo

Rete elettronica sonde perfettamente integrano e forniscono stabile, a lungo termine, singoli neuroni livello registrazione all'interno del cervello. Questo protocollo utilizza la rete elettronica per esperimenti in vivo , che coinvolgono la realizzazione di rete elettronica, caricamento in aghi, iniezione stereotassica, l'interfaccia di ingresso/uscita, esperimenti di registrazione e l'istologia del tessuto contenente mesh le sonde.

Abstract

Sonde di elettrofisiologia del cervello impiantabili sono strumenti preziosi in neuroscienze dovuto la loro capacità per registrare l'attività neurale con alta risoluzione spazio-temporale da regioni cerebrali superficiali e profonde. Loro uso è stato ostacolato, tuttavia, di squilibri meccanici e strutturali tra le sonde e il cervello dei tessuti che comunemente portare a micromotion e gliosi con conseguente instabilità negli esperimenti di registrazione cronica del segnale. Al contrario, dopo l'impianto di rete ultraversatile elettronica tramite iniezione della siringa, la mesh sonde forma un'interfaccia senza soluzione di continuità, privo di gliosi con il tessuto cerebrale circostante che consente il rilevamento stabile di singoli neuroni su almeno un anno scala cronologica. Dettagli di questo protocollo i passaggi chiave in un esperimento di registrazione neurali tipici del mouse utilizzando siringa-iniettabili in rete elettronica, tra cui la fabbricazione della rete elettronica con standard basati su fotolitografia processo possibile a molte università, caricamento rete elettronica in aghi capillari standard, iniezione stereotassica in vivo, connessione della mesh input/output per le interfacce di strumentazione standard, trattenuto o sessioni di registrazione, liberi di muoversi e istologica del cervello di sezionamento tessuto contenente rete elettronica. Rappresentante neurale registrazioni e dati di istologia sono presentati. Gli investigatori hanno familiari con questo protocollo avrà le conoscenze necessarie per incorporare i loro esperimenti di rete elettronica e sfruttare le opportunità uniche offerte fornendo un'interfaccia neurale stabile a lungo termine, quali gli studi di invecchiamento processi, lo sviluppo del cervello e la patogenesi della malattia di cervello.

Introduzione

Lo sviluppo di strumenti capaci di mappatura del cervello con risoluzione di singoli neuroni è di importanza centrale di neuroscienza e di neurologia. Tecnologie non invasive per studi neurali come l'elettroencefalografia (EEG), magnetoencefalografia (MEG) e la formazione immagine a risonanza magnetica funzionale (fMRI) hanno dimostrato preziosi per correlare l'attività cerebrale con comportamento in esseri umani^{1, 2}, ma manca la risoluzione spazio-temporale necessaria per studiare la struttura e la dinamica delle reti neurali alle loro fondamentale micrometro e millisecond scale, rispettivamente di^3,4. Alcuni electrocorticography (ECoG) sonde e metodi di imaging ottici utilizzando coloranti tensione-sensibili sono riusciti a registrazione unitario chiodando attività in vivo^5,6, ma sono generalmente efficaci solo vicino il superficie del cervello, limitando l'applicabilità agli studi di regioni cerebrali superficiali. Al contrario, impiantabili sonde elettriche possono misurare elettrofisiologia di singoli neuroni in animali liberi di muoversi da praticamente qualsiasi regione del cervello senza l'esigenza di etichettatura fluorescente, che li rende indispensabile a livello di sistemi neuroscienze, soprattutto come tecniche di microfabbricazione dall'industria dei semiconduttori hanno spinto il numero di canali in centinaia e migliaia^3,7,8,9. In virtù di queste funzionalità, impiantabili sonde elettriche hanno dato molti importanti contributi di neuroscienza e di neurologia, compresi gli studi fondamentali di elaborazione delle informazioni nel sistema visivo¹⁰, il trattamento di neurologico disturbi come la malattia del Parkinson¹¹e la dimostrazione delle interfacce cervello-macchina (BMI) per protesi avanzata^12,13.

Tuttavia, instabilità a lungo termine che si è manifestata come diminuendo spike ampiezze e segnali instabili su scale cronologiche delle settimane a mesi^14,15 ha limitato l'applicabilità di impiantabili sonde per lo studio di relativamente a breve termine fenomeni, lasciando le questioni come lo sviluppo e l'invecchiamento del cervello in gran parte senza risposta. Le limitazioni nella instabilità a lungo termine sono il risultato di una mancata corrispondenza tra le sonde tradizionali e tessuto cerebrale nelle dimensioni, meccanica e topologia^{14,15,16,17,18}. In termini di dimensioni, mentre le sinapsi neuronali e somata è circa decine di nanometri a decine di micrometri di diametro¹⁹, rispettivamente, sonde tradizionali sono spesso significativamente più grande, nel caso di microelettrodi di silicio > 4 volte la dimensione di un singolo neurone corpo cellulare^7,8. Le dimensioni relativamente grandi di queste sonde potrebbero interferire con la struttura naturale e la connettività del denso tessuto neurale, così contribuendo alla risposta immunitaria cronica e perturbando circuiti neurali in fase di studio. In termini di proprietà meccaniche, sonde tradizionali sono drasticamente più rigidi di estremamente morbido tessuto neurale in cui vengono impiantati; anche "flessibile" sonde costituiti da 10 – 20 µm spessore fogli di polyimide sono almeno 100.000 volte più rigidi del cervello tessuto^20,21. Questa mancata corrispondenza in rigidità alla flessione provoca movimento relativo taglio fra il tessuto sonda e cervello, portando a unitario inaffidabile monitoraggio durante le registrazioni estese ed inducendo il gliosis cronico sito di impianto. Infine, la struttura topologica delle sonde convenzionali del cervello esclude necessariamente un volume solido del tessuto. Tale mancata corrispondenza nella topologia interrompe la connettività dei circuiti neurali, preclude la naturale e interpenetrata distribuzione tridimensionale (3D) di neuroni, cellule gliali e vasi sanguigni all'interno del tessuto di cervello²²e ostacola il trasporto 3D di ²³di molecole di segnalazione. Insieme, queste carenze di sonde tradizionali li hanno resi privi la compatibilità a lungo termine ricercata per applicazioni cliniche e gli studi di neuroscienze longitudinale a livello di singoli neuroni.

Per ovviare a questi inconvenienti, abbiamo cercato di confondere la linea tra i sistemi neurali ed elettroniche attraverso lo sviluppo di un nuovo paradigma di "tessuto-come" sonde neurale definito rete elettronica^16,21,24. Rete elettronica risolve i problemi di corrispondenza sopra in dimensioni, meccanica e topologia incorporando caratteristiche (1) strutturali della stessa nanometro a scala di dimensione micrometrica del tessuto neurale, (2) caratteristiche meccaniche simili a quelle del tessuto cerebrale e (3) un 3D macroporoso topologia che è > 90% open space e così può ospitare compenetrazione di neuroni e di diffusione delle molecole attraverso l'ambiente extracellulare. Rete elettronica sonde possono essere consegnati precisamente a regioni specifiche del cervello attraverso una siringa e un ago, causando un danno acuto minimo mentre impiantare anche nel profondo del cervello regioni^21,25. Assoni e soma neuronale sono stati indicati per si compenetrano la struttura di sonda elettronica open mesh 3D all'interno di post-iniezione settimane, creando così un'interfaccia senza soluzione di continuità, privo di gliosi tra registrazione elettronica e che circonda il cervello tessuto^{21 , 26 , 27}. queste caratteristiche uniche hanno permesso maglia elettronica sonde monitorare stabilmente l'attività chiodando da singoli neuroni stessi nel corso di almeno un anno della scala cronologica²⁷. Inoltre, la realizzazione dell'elettronica di rete basato su fotolitografia (PL) fornisce elevata scalabilità del numero di elettrodi che possono essere incorporati, con dimostrata canale conta fino a 128 elettrodi per sonda usando Litografia semplice maschera di contatto ²⁸ e un design di (i/o) di input/output plug-and-play che consente rapidi collegamenti elettrici all'interno periferica elettronica senza attrezzature specializzate²⁹.

Una vasta gamma di studi può beneficiare di incorporare maglia elettronica protocolli di misura. Maggior parte degli esperimenti di registrazione intracortical potrebbero beneficiare di procedura di impianto minimamente invasiva di maglia electronics tramite iniezione della siringa, la risposta immunitaria drasticamente ridotta dopo impianto, e la possibilità di lasciare in rete elettronica nella tessuto durante l'istologia successiva e immunostaining per l'analisi precisa dell'ambiente biologico che circonda ogni sito di registrazione. Esperimenti di registrazione cronica in particolare ricaveranno valore dalla capacità unica di rete elettronica per tenere traccia di un numero elevato di singoli neuroni per mesi o anni. Questa funzionalità crea opportunità per gli studi con risoluzione di singoli neuroni che erano precedentemente impraticabili, come gli studi longitudinali di invecchiamento dei circuiti neurali, le indagini del cervello in via di sviluppo e richieste nella patogenesi di spongiformi trasmissibili¹⁶.

In questo protocollo, descriviamo tutti passaggi la chiave in un esperimento di registrazione neurali tipici del mouse utilizzando mesh iniettabile siringa elettronica (vedere la Figura 1). Passaggi descritti includono la fabbricazione di elettronica di maglia in un possibile processo di standard basati su PL a molte università, caricamento rete elettronica in aghi capillari standard, iniezione stereotassica di maglia elettronica in vivo, collegamento dei maglia I/O di strumentazione standard interfacce, sessioni di registrazione trattenuto o liberamente commovente e sezionamento istologica del tessuto cerebrale contenente rete elettronica. Alcuni ricercatori utilizzando mesh elettronica solo per gli studi di istologia non possono esigere l'interfaccia elettrica e registrazione, nel qual caso essi possono saltare questi passaggi. Dopo familiarizzare con questo protocollo, gli investigatori dovrebbero avere tutte le conoscenze necessarie per utilizzare la rete elettronica nei loro esperimenti.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite su soggetti animali vertebrati sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Harvard.

1. fabbricazione di elettronica di Mesh

Nota: La procedura descritta in questa sezione è destinata all'uso all'interno di un impianto di camera pulita Università standard, come il centro per sistemi su scala nanometrica (CNS) all'Università di Harvard. Questa struttura, così come strutture simili sono accessibili agli utenti esterni intorno agli Stati Uniti, per esempio, come parte del National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN) sostenuto dalla National Science Foundation (NSF). In queste strutture, molti degli strumenti, attrezzature e materiali descritti in questa sezione sono forniti insieme con l'accesso al camera pulita e non richiederebbe l'acquisto separato.

Attenzione: Molti dei prodotti chimici utilizzati nella fabbricazione di elettronica della maglia sono pericolosi, tra cui resiste, CD-26, remover PG, sviluppatore di SU-8 e Ni acquaforte soluzione. Consultare le schede di dati di sicurezza materiali (MSDS) per queste sostanze chimiche prima dell'uso e implementare e seguire adeguate misure di sicurezza in ogni momento.

1. Termicamente evaporare 100 nm di Ni su un wafer Si pulito.
   Nota: I parametri tipici di deposizione sono base pressione di 5 x 10^-7 T e la frequenza di 1 – 2 Å/s. Il sottile strato di Ni serve come uno strato sacrificale che più tardi sarà sciolto per rilasciare maglia elettronica da wafer.
2. La prima maschera di PL (PL maschera-1) consente di definire il fondo passivante strato di rete elettronica con photoresist negativo SU-8 (Figura 2A).
   Nota: PL è una tecnica di microfabbricazione standard in cui la luce ultravioletta (UV) è brillata su una maschera tenuta sopra un substrato fotosensibile. Luce sia rende insolubile (negativi resiste) o solubile (positivi resiste) le aree esposte sul substrato. Le maschere sono disegnate nel software di computer-aided design (CAD) e poi in genere ordinate da un fornitore. Un aligner maschera viene utilizzato per allineare le maschere per i modelli esistenti su un substrato ed esporli alla luce UV. Fabbricazione di rete elettronica richiede quattro diverse maschere (maschera di PL-1 attraverso maschera PL-4). I nostri disegni di maschera sono disponibili su richiesta o il sito di risorse, meshelectronics.org.
   1. Spin-cappotto SU-8 2000.5 photoresist negativo su wafer a 4.000 giri/min per uno spessore approssimativo di SU-8 di 400 – 500 nm.
   2. Cuocere morbido il wafer su una piastra riscaldante per 1 min a 65 ° C seguita da 1 min a 95 ° C.
   3. Caricare la cialda in un aligner maschera per esporre il SU-8 con maschera di PL-1 corrispondente al fondo della maglia SU-8 layer. Esporre ad una dose di linea i-line (lunghezza d'onda 365 nm) di 100 mJ/cm².
   4. Post cuocere la cialda su una piastra riscaldante per 1 min a 65 ° C, seguita da 1 min a 95 ° C.
   5. Immergere la cialda in un vassoio di SU-8 developer. Agitare delicatamente la soluzione per 2 minuti fino a quando il reticolo in SU-8 è stato completamente sviluppato. Sciacquare in un vassoio di alcol isopropilico per 1 min e colpo secco.
   6. Duro e cuocere la cialda su una piastra riscaldante a 180 ° C per 1 h.
      Nota: SU-8 è normalmente difficile al forno tra 150 ° C e 250 ° C, seguendo lo sviluppo. La cottura dura annealing eventuali crepe superficiali che potrebbero formarsi durante sviluppo e maggiori legami incrociati SU-8 per assicurare stabilità meccanica. Duro da forno a 180 ° C per lo strato di SU-8 inferiore e 190 ° C per la parte superiore SU-8 strato produce buoni risultati per l'elettronica di maglia.
3. Uso PL maschera-2 per definire metal interconnessioni e pastiglie I/O (Figura 2B).
   1. LOR3A spin-cappotto su wafer a 4000 rpm per uno spessore approssimativo di 300 nm.
      Nota: LOR3A è basato su polydimethylglutarimide resistere che velocizza sottoquotazione durante la procedura successiva metallizzazione.
   2. Cuocere in forno la cialda su una piastra riscaldante a 180 ° C per 5 min.
   3. Spin-cappotto S1805 photoresist positivo a 4000 rpm per uno spessore approssimativo di 500 nm.
   4. Cuocere in forno la cialda su una piastra riscaldante a 115 ° C per 1 min.
   5. Caricare la cialda in un aligner maschera per esporre il S1805 con PL. maschera-2 corrispondente al metallo interconnessioni e pastiglie di I/O. Esporre ad una dose di h-linea (lunghezza d'onda 405 nm) di 40 mJ/cm².
   6. Immergere la cialda in un vassoio di sviluppatore fotoresist CD-26. Agitare delicatamente la soluzione per 1 min fino a quando il metallo interconnessioni modello è stato completamente sviluppato. Sciacquare in un vassoio dell'acqua deionizzata (DI) per 1 min e colpo secco.
   7. Termicamente evaporare 3 nm di Cr seguita da 80 nm di Au.
      Nota: Una pressione di base di al massimo 5 x 10^-7 T e la velocità di deposizione di 1 Å/s yield in genere la migliore qualità di film.
   8. Immergere la cialda in un becher da piatto di PG remover per circa 3 ore fino a quando il metallo ha eroso la completamente, lasciando il metallo solo in interconnessione desiderata e regioni pad I/O di rete elettronica. Risciacquare con alcool isopropilico e colpo secco.
4. Utilizzare maschera PL-3 per definire Pt elettrodi (Figura 2).
   1. Ripetere i passaggi da 1.3.1 attraverso 1.3.4.
   2. Caricare il wafer aligner maschera per esporre il S1805 con PL. mask-3 corrispondente per gli elettrodi di Pt. Esporre ad una dose di h-linea di 40 mJ/cm².
   3. Immergere la cialda in un vassoio di sviluppatore fotoresist CD-26. Agitare delicatamente la soluzione per 1 min fino a quando il pattern di elettrodi di Pt è stato completamente sviluppato. Sciacquare in un vassoio di per 1 min e colpo secco.
   4. Utilizzare un evaporatore di fascio di elettroni al deposito 3 nm di Cr seguita da 50 nm di Pt.
      Nota: I parametri tipici di deposizione sono una pressione di base di 5 x 10^-7 T e tasso di 2 Å / s.
   5. Immergere la cialda in un becher da piatto di PG remover per circa 3 ore fino a quando il metallo è completamente sottosquadro, lasciando Pt solo presso i siti di elettrodo desiderata della rete elettronica. Risciacquare con alcool isopropilico e colpo secco.
5. PL. maschera-4 consente di definire la parte superiore passivante strato di rete elettronica con photoresist negativo SU-8 (Figura 2D).
   1. Ripetere i passaggi 1.2.1 attraverso 1.2.5, tranne esponendo con PL. mask-4 corrispondente al livello superiore della maglia passivante del SU-8.
   2. Duro e cuocere la cialda su una piastra riscaldante a 190 ° C per 1 h.
      Nota: Questa temperatura è 10 ° C superiore a quella per la cottura dura del fondo SU-8 (punto 1.2.6). Questa temperatura elevata scorre leggermente il fondo SU-8, facendolo per fondersi con lo strato superiore di SU-8 e formano così una struttura unica, continua di SU-8.
6. Elettronica di maglia sono ora completate (Figura 2E e Figura 3); sganciarli dai wafer Si sciogliendo lo strato sacrificale di Ni.
   1. Trattare la cialda con il plasma ad ossigeno a 50 W per 1 min. Questo si ossida la superficie SU-8, rendendolo idrofila e permettendo la mesh prontamente sospesa in soluzione acquosa.
   2. In un becher da piatto combinare acido cloridrico, cloruro ferrico e DI un rapporto volumetrico di 1:1:20, rispettivamente, per ottenere una soluzione di Ni mordenzante.
   3. Immergere la cialda in un becher piatto della soluzione mordenzante Ni per circa 3 ore fino a quando l'elettronica maglia completamente è stato rilasciato dalla cialda Si.
   4. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire un becher da 100 mL di mesh rilasciato elettronica sonde da Ni mordenzante. Trasferire l'elettronica di maglia in un fresco bicchiere di almeno 3 volte per garantire risciacquo.
   5. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire l'elettronica della maglia in una soluzione di acqua/etanolo 70% / 30% per la disinfezione, quindi utilizzare la pipetta per trasferire l'elettronica di maglia in acqua sterile per il risciacquo.
      Nota: Dopo la sterilizzazione, l'elettronica di maglia possa essere trasferito ad altre soluzioni per la funzionalizzazione. Ad esempio, per promuovere l'adesione cellulare, l'elettronica di maglia possa essere trasferito ad una soluzione acquosa di poli-D-lisina (1 mg/mL) per 24 h.
   6. Uso di una pipetta di Pasteur per trasferire l'elettronica maglia sonde in un becher da 100 mL di fosfato sterile 1x tampone salino (PBS) prima dell'iniezione in vivo.

2. caricamento di Mesh elettronica in aghi

1. Il titolare di pipetta come acquistato è aperto al flusso ad entrambe le estremità. Sigillare l'estremità di fronte le circolari viti di fissaggio con resina epossidica, quindi non c'è nessuna perdita durante l'iniezione (Figura 4A). Lasciare che la resina epossidica indurire prima di procedere.
2. Il titolare della pipetta, inserire un ago capillare di vetro. Fissarlo con la vite di serraggio circolare e cono rondella (Figura 4B). Un 400 µm diametro interno (650 µm di diametro esterno) vetro capillare ago è stato usato per questo protocollo. Altri materiali dell'ago capillare (ad es., metallo) e diametri possono essere utilizzati ma potrebbero richiedere modifiche alla progettazione dell'elettronica di mesh per garantire iniettabilità.
   Nota: Gli aghi capillare che vanno da 150 µm di diametro interno di 1,17 mm (250 µm a 1,5 mm di diametro esterno) sono stati utilizzati nel nostro laboratorio. Iniezione tramite aghi più piccoli può essere promosso rendendo l'angolo di intersezione tra gli elementi di rete di SU-8 trasversali e longitudinali più acuti, diminuendo la larghezza degli elementi della maglia SU-8, utilizzando più sottile SU-8, e utilizzando una grossolana (cioè., cellula di unità più grande) struttura di rete. Maschere fotografiche per le mesh progettate per più piccolo capillari aghi sono disponibili su richiesta o il sito di risorse, meshelectronics.org. Gli aghi capillari di vetro con un diametro interno di 400 µm e diametro esterno di 550 µm sono inoltre disponibili in commercio. Questi ridurre il danno di tessuto acuta causato da iniezione mentre mantenendo la compatibilità con reti che richiedono un diametro interno da 400 µm, ma non sono stati usati per gli studi descritti qui.
3. Collegare una siringa da 1 mL all'uscita laterale del supporto pipetta utilizzando una lunghezza di 2 – 4 cm di tubo capillare.
4. Inserire l'ago capillare di vetro del becher da 100 mL di PBS contenente l'elettronica di maglia. Posizionare l'estremità dell'ago vicino le pastiglie di I/O di una mesh elettronica sonda e ritrarre manualmente la siringa per disegnare una sonda elettronica di maglia nell'ago (Figura 5 e complementare Video 1).
   Nota: Le pastiglie di I/O, regione di interconnessione di staminali e regione periferica della maglia sono facilmente identificabili da occhio nudo quando le sonde di elettronica di maglia sono sospese in soluzione. In questo modo inequivocabile caricamento di mesh elettronica negli aghi con l'orientamento corretto.
5. Spingere/tirare lo stantuffo della siringa mentre ancora immerso in soluzione fisiologica per regolare la posizione di rete elettronica all'interno dell'ago.
   Nota: Il posizionamento ideale è con la regione di dispositivo ultraversatile maglia come vicino alla fine dell'ago come possibile. Questa configurazione riduce al minimo il volume del fluido che sarà iniettato nel cervello garantendo che la regione periferica viene iniettata prima e le pastiglie di I/O Ultima.
6. Attentamente e staccare il tubo capillare dalla presa laterale del supporto pipetta. Staccarlo lentamente per evitare di creare una forza di aspirazione che potrebbe alterare la posizione dell'elettronica della maglia all'interno dell'ago.

3. stereotassica iniezione di Mesh elettronica nel cervello del topo dal vivo

Nota: I topi sono stati anestetizzati tramite l'iniezione intraperitoneale con una miscela di quest'ultimo ketamina e 1 mg/kg a 75 mg/kg. Il grado di anestesia è stato verificato con il metodo di pizzico di punta prima di iniziare l'intervento chirurgico. Posizionando il mouse su una coperta omeotermi di 37 ° C mentre nell'ambito dell'anestesia è stata mantenuta la temperatura corporea. Una tecnica sterile corretta è stata implementata per la chirurgia, compresi ma non limitati a sterilizzazione in autoclave tutti gli strumenti chirurgici in metallo per 1 h prima dell'uso, l'utilizzo di guanti sterilizzati, usando uno sterilizzatore caldo tallone durante la chirurgia, il mantenimento di un campo sterile intorno al sito chirurgico, la disinfezione di strumenti in plastica con etanolo al 70% e il cuoio capelluto depilato della pelle è stato predisposto con iodophor prima dell'incisione. Per gli ambulatori di sopravvivenza, dopo la conclusione della chirurgia, antiobiotic unguento è stato applicato intorno alla ferita, e il mouse è stato restituito a una gabbia attrezzata con un 37 ° C, rilievo di riscaldamento. Topi non sono stati lasciati incustoditi fino a quando essi aveva ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Topi sono stati dati l'analgesia di buprenorfina tramite l'iniezione intraperitoneale ad una dose di 0,05 mg/kg di peso corporeo ogni 12 h per fino a 72 h dopo la chirurgia. Topi sono stati isolati dagli altri animali che seguono la chirurgia. Topi sono stati eutanasizzati tramite un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital ad una dose di 270 mg/kg di peso corporeo o perfusione perfusione (vedere punto 6.1). Gli investigatori possono riferirsi a Geiger, et al. ³⁰, Kirby, et al. ³¹e Gage, et al. ³² per maggiori info su chirurgia stereotassica del roditore.

1. Anestetizzare il mouse e risolvere il problema in una cornice stereotassica.
2. Applicare il lubrificante oculare agli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Utilizzare una cornice stereotassica e trapano odontoiatrico per aprire un craniotomy alle coordinate desiderate sul cranio. Aprire un secondo craniotomy lontano dal sito di iniezione per l'inserimento di una vite di messa a terra in acciaio inossidabile o filo.
4. Difficoltà un substrato bloccaggio al cranio con cemento dentale. Tagliare un divario di circa 1 mm nel substrato per migliorare l'affidabilità del passo pieghevole più avanti nella procedura.
   Nota: Un cavo flessibile piatto (FFC) tagliato ad una funziona di forma "L" ben (figura 7A), anche se molti materiali avrebbero funzionato fino a quando essi sono lo spessore corretto per il 32-canale zero connettore di forza (ZIF) inserimento (progettato per 0,18 cavi spessi di ± 0,05 mm).
5. Montare il supporto pipetta con l'ago contenente maglia elettronica sul telaio stereotassica utilizzando un morsetto ad angolo retto terminale (Figura 4 e Figura 6A).
6. Fissare lo scarico laterale di Dispensare titolare ad una siringa da 5 mL fissata in una siringa pompa (Figura 6) utilizzando un circa 0,5 – 1 m di lunghezza del tubo capillare.
   Nota: Assicurarsi che non ci sono bolle nel tubo capillare prima di collegarlo al titolare della pipetta. Bolle possono interrompere il flusso durante l'iniezione e prevenire una consegna liscia, controllata di rete elettronica.
7. Utilizzare la cornice stereotassica per posizionare la punta dell'ago nella posizione di partenza desiderata all'interno del cervello.
   Nota: Le sonde di elettronica di rete utilizzate qui sono progettate con registrazione elettrodi si sviluppa su una lunghezza di ca. 2 mm e con il primo elettrodo situato ca. 0,5 mm dal bordo iniziale dell'elettronica della maglia (bordo più a sinistra nella Figura 3A). Per questo motivo, le coordinate stereotassiche dovrebbero essere selezionate tale che la posizione iniziale è di 0,5 mm più profondo di regione del cervello di interesse. La diffusione e la posizione degli elettrodi di registrazione all'interno della maglia elettronica può essere selezionati liberamente durante il processo di progettazione maschera e dovrebbe essere selezionati in modo che gli elettrodi di registrazione estendono le regioni del cervello di interesse come vengono iniettati lungo loro stereotassica traiettoria.
8. Posizionare la telecamera (Figura 6B) per visualizzare la parte superiore della sonda elettronica della maglia all'interno dell'ago di vetro. Alcuni software permette all'utente di disegnare una linea sullo schermo per segnare la posizione originale dell'elettronica della maglia.
9. Avviare il flusso impostando la pompa a siringa a bassa velocità e premendo Start. 10 mL/h è una percentuale di flusso iniziale tipica per un ago capillare di 400 µm diametro interno. Lentamente aumentare il tasso di flusso se la sonda elettronica di maglia non si muove all'interno dell'ago.
   Nota: È importante per ridurre al minimo il volume del fluido iniettato nel cervello come questo può danneggiare il tessuto circostante il sito di iniezione. Risultati migliori si ottengono con volumi di iniezione meno di 25 µ l per 1 mm di lunghezza di maglia iniettato. I valori ideali sono meno della metà di questo volume; nel nostro laboratorio, iniettiamo in genere 10 – 50 µ l per una lunghezza di maglia 4 mm iniettato.
10. Come la sonda elettronica di rete comincia a muoversi all'interno dell'ago, è possibile utilizzare la cornice stereotassica per ritrarre l'ago alla stessa velocità con cui è stata iniettata la sonda elettronica di maglia, utilizzando la posizione originale marcata della rete elettronica come guida.
    Nota: Questa procedura, definita il campo visivo (FoV) iniezione metodo²⁵, consente per la consegna precisa della rete elettronica di una regione del cervello mirato senza sgualcendo o dislocazione. Spesso la portata può essere ridotta una volta che la sonda elettronica di rete comincia a muoversi all'interno dell'ago. Nel nostro laboratorio, portate di 20 – 30 mL/h sono spesso necessari per superare l'attrito statico tra la maglia e le pareti del capillare dell'ago, ma il tasso può quindi essere ridotta a 10 mL/h, una volta che è stato avviato il processo di iniezione. Portate e volumi di iniezione sono solitamente più piccole per gli aghi più piccoli capillari di diametro.
11. Continuare a fluire Salina e ritrarre l'ago fino a quando l'ago è stato terminato il cranio. Arrestare il flusso della pompa a siringa.

4. ingresso/uscita interfacciamento

Nota: A questo punto, la sonda elettronica di maglia è stata iniettata dal punto di partenza desiderato all'interno del cervello lungo la traiettoria selezionata. L'ago è stata ritirata ed è appena sopra il craniotomy con la rete elettronica interconnessioni che vanno dal cervello all'ago e il / o pastiglie ancora all'interno dell'ago (figura 7B). Questa sezione utilizza una scheda di circuito stampato (PCB; Figura 7, Figura 8) l'interfaccia con la sonda elettronica di maglia. Il PCB collega un connettore ZIF con un connettore standard amplificatore a 32 canali attraverso un substrato isolante che diventa il palcoscenico di testa per esperimenti di registrazione neurale. Il PCB è personalizzabile per adattarsi a varie configurazioni di testa-fase. I nostri file di disegno sono disponibili su richiesta o dal sito web risorsa, meshelectronics.org e può essere utilizzato per acquistare a buon mercato PCB da fornitori di servizi di produzione e assemblaggio di PCB.

1. Utilizzare la cornice stereotassica per guidare con attenzione l'ago per la FFC substrato di bloccaggio e tutto il divario, che scorre la soluzione con la pompa a siringa per generare margine di flessibilità nel settore dell'elettronica di maglia interconnessioni (Figura 7).
2. Una volta che l'ago è di sopra del substrato di bloccaggio il divario, riprendere il flusso a un ritmo veloce per espellere l'elettronica mesh Pad I/O sul substrato serraggio (Figura 7).
3. Utilizzando una pinzetta e una pipetta di, piegare le pastiglie di I/O a ca. angolo di 90° come vicino il primo pad I/O come possibile.
   Nota: La flessione è necessario consentire le pastiglie da inserire nel connettore ZIF su un PCB in un passaggio successivo. Il connettore ZIF è esattamente la stessa larghezza come il 32 pastiglie di I/O della sonda elettronica della maglia, quindi piegare un imperfetto 90°, o una curva che non accade proprio davanti il primo pad di I/O, si tradurrà in dover tagliare pastiglie I/O (le pastiglie più a sinistra nella Figura 7E).
4. Una volta che le pastiglie di I/O sono allineate, spiegata e verso il gambo di maglia, asciutto con un'angolazione di 90° in posto con delicatamente che scorre aria compressa.
   Nota: Mesh elettronica sonde con meno di 32 canali può essere interfacciato a con la stessa scheda di interfaccia di 32 canali. Ad esempio, il nostro laboratorio utilizza comunemente maglia 16 canali elettronica sonde con 32 canali PCB. Questo fornisce più spazio all'interno del connettore ZIF, semplificando l'interfaccia, e i canali di uncontacted aggiuntivi sono facilmente identificabili come circuiti aperti mediante impedenza test durante le sessioni di registrazione.
5. Tagliare il bloccaggio substrato un bordo diritto circa 0,5 – 1 mm dal bordo delle pastiglie I/O. Anche tagliare parti estranee del substrato bloccaggio che ostacolano l'inserimento nel connettore ZIF 32 canali montato (Figura 7F).
6. Inserire le pastiglie di I/O nel connettore ZIF sul PCB e chiudere il bloccaggio (Figura 7). Elettronica di misura di uso per misurare l'impedenza tra i canali e la vite a terra per confermare il successo di interfacciamento. Se i valori di impedenza sono troppo alti, sganciare il connettore ZIF, regolare l'inserimento e ripetere il test fino a quando non viene confermata la connessione riuscita.
7. Coprire il connettore ZIF e maglia esposta elettronica interconnessioni con cemento dentale per la protezione. Capovolgere il PCB allo spacco nel substrato e fissare il PCB con cemento sul cranio del mouse (Figura 7 H).
   Nota: La FFC allo spacco di piegamento riduce lo sforzo meccanico che a volte può rompere la rete elettronica interconnessioni.
8. Lasciare che il cemento indurire, trasformando il PCB in una robusta, compatta testa-fase per l'interfaccia durante le sessioni di registrazione successiva (Figura 7I).

5. esperimenti di registrazione neurale

1. Posizionare il mouse in un tailveiner o altro dispositivo di ritenuta³³. Inserire il preamplificatore PCB nel connettore standard amplificatore sul PCB testa-fase. Utilizzare un cavo separato a terra la vite di riferimento.
2. Per le registrazioni sobrie, lasciare il mouse nel dispositivo di ritenuta. Registrare i dati utilizzando il sistema di acquisizione dati per il periodo di tempo desiderato (Figura 8A).
3. Per muoversi liberamente registrazioni, rilasciare il mouse dal dispositivo di ritenuta dopo aver inserito il preamplificatore PCB e la vite di riferimento di messa a terra. Record per la lunghezza desiderata del tempo utilizzando il sistema di acquisizione dati, mentre il mouse si comporta liberamente (Figura 8B).
4. Alla fine della sessione di registrazione, è possibile mettere il mouse indietro nel dispositivo di ritenuta, se necessario. Rimuovere il filo di messa a terra e preamplificatore, poi rilasciare il mouse torna alla sua gabbia e restituirlo all'alloggio degli animali fino alla prossima sessione di registrazione.

6. istologico di sezionamento, colorazione e Imaging

1. Aspettare fino a dopo l'iniezione il tempo desiderato, quindi anestetizzare il mouse e via irrorare con formaldeide. Rimuovi, freeze e donatrici cervello fette spesse 10-µm. Un protocollo dettagliato su cryosectioning di tessuto cerebrale dei roditori e immunohistochemistry può essere trovato in Evilsizor, et al. ³⁴.
   Nota: Tessuto cerebrale contenente rete elettronica può essere fissa e sezionato normalmente, anche se l'elettronica di monitoraggio vengono lasciato all'interno. Si tratta di una funzionalità unica rispetto ai convenzionali sonde neurale, che deve essere rimosso prima di sezionamento e di conseguenza possono modificare il tessuto o rendono difficile analizzare l'interfaccia di sonda-tessuto.
2. Risciacquare le sezioni di tessuto di cervello congelato 3 volte in 1X PBS.
3. Bloccare le sezioni in una soluzione di siero di capra 0,3% Triton X-100 e 5% in PBS 1X. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 1 h.
4. Incubare le sezioni con la soluzione di anticorpi primari. Le soluzioni di anticorpo primario utilizzate qui erano coniglio anti-NeuN (diluizione 1: 200), anti-neurofilamenti topo (diluizione 1: 400) e ratto anti-GFAP (diluizione 1: 500) con siero di Triton X-100 e 3% di capra di 0,3%. Incubare per una notte a 4 ° C.
5. Risciacquare le sezioni 9 volte per un totale di 40 min con PBS 1X.
6. Incubare le sezioni di cervello con la soluzione di anticorpi secondari. Le soluzioni di anticorpo secondario utilizzate qui erano Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio (diluizione 1: 200), Alexa Fluor 568 anti-topo di capra (diluizione 1: 200) e Alexa Fluor 647 capra anti-topo (diluizione 1: 200). Incubare le sezioni per 1 h a temperatura ambiente.
7. Risciacquare le sezioni 9 volte per un totale di 30 min con PBS 1X.
8. Montare i profili sulle lastre di vetro con lamelle tramite montante antifade. Lasciare le diapositive al buio per almeno 24 h prima di formazione immagine.
9. Immagine i vetrini con un microscopio confocale utilizzando 488 nm, 561 nm e 633 nm laser come le sorgenti di eccitazione per Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 647, rispettivamente. Utilizzare contrasto differenziale di interferenza (DIC) per l'elettronica di maglia di immagine sul microscopio stesso per successive sovrapposizioni di immagini e analisi.

Risultati

Risultati variano in base la specie animale nello studio, la regione del cervello mirato, il tempo trascorso ad iniezione e la quantità di danno acuto inflitto durante l'iniezione e il successo dei / o interfacciamento procedura, tra gli altri fattori. Unità singola chiodando attività potrebbero non essere fino a 1 giorno (nel caso di aghi di diametro interno 150 µm) per 1 settimana dopo l'iniezione e spike ampiezze possono variare fino a 4 – 6 settimane. Figura 9 Mostra dati elettrofisiologici rappresentativi da una sonda elettronica di 32 canali maglia iniettato l'ippocampo e la corteccia somatosensoriale primaria di un topo adulto maschio C57BL/6J. Potenziali di circa 300-µV ampiezza campo locale (LFPs) sono stati registrati su tutti i 32 canali e attività chiodando unitario è stata registrata su 26 canali. Il LFPs e picchi isolati è rimasta simile tra 2 e 4 mesi, suggerendo un'interfaccia altamente stabile tra registrazione elettronica e neuroni in questo periodo di tempo prolungato. La figura 10 Mostra risultati rappresentativi di sezionamento istologico e immunostaining del tessuto cerebrale contenente maglia elettronica 1 anno dopo l'iniezione. Macchiando per NeuN, un marker per somata neurale e il neurofilament, un indicatore per gli assoni neurali, non rivela poca o nessuna perdita di densità del tessuto al sito di iniezione, implicando l'interfaccia senza soluzione di continuità tra il rete elettronica ed il tessuto cerebrale. Ulteriormente la macchiatura per GFAP (un indicatore per gli astrociti) rivela livelli di vicino a fondo dei astrocytes intorno rete elettronica, che indica che la sua presenza suscita poco cronica risposta immunitaria.

Figura 1: passaggi in un siringa-iniettabili maglia elettronica esperimento. Questo protocollo descrive tutti i passaggi chiave in un esperimento di registrazione neurali roditore tipico utilizzando rete elettronica. Esperimenti di solito comporta, in ordine di attuazione, (1) fabbricazione di rete elettronica, (2) caricamento della rete elettronica nel capillari aghi, iniezione (3) stereotassica di maglia elettronica nel cervello, I/O (4) elettrici interfacciamento in mesh elettronica, registrazioni trattenute o liberamente commovente (5) e (6) maglia/tessuto di sezionamento e la macchiatura per istologia. In alcuni studi, si potrebbero desiderare solo dati di istologia, nel qual caso è possibile saltare i passaggi (4) e (5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: disegno schematico raffigurante la procedura di fabbricazione per l'elettronica di rete plug-and-play della regione periferica ultraversatile (riga superiore), staminali interconnessioni regione (riga centrale) e regione I/O (riga inferiore). (A) SU-8 photoresist negativo (rosso) è modellato con maschera di PL-1 per definire il fondo passivante strato di ogni sonda elettronica di rete plug-and-play. (B) Patterning con maschera-2 PL, evaporazione termica e a sollevamento metalliche definire Au interconnessioni e pastiglie I/O (oro). (C) Patterning con maschera-3 PL, evaporazione del fascio di elettroni e a sollevamento metalliche definire Pt elettrodi (blu). (D) SU-8 photoresist negativo (rosso) è modellato con PL mask-4 per definire lo strato passivante. Aperture in SU-8 vengono lasciate ogni elettrodo Pt e I/O pad. (E) A completamento della maglia sonda elettronica con caselle tratteggiate che indicano le posizioni ampliate nel top, middle e righe di fondo. Photomask file di progettazione sono disponibili dalla richiesta da parte degli autori o il sito di risorse, meshelectronics.org. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: fotografie e immagini al microscopio ottico del plug-and-play mesh elettronica. (A) piastrella immagini al microscopio ottico di una sonda elettronica di siringa-iniettabili maglia con i/o plug-and-play. La sonda era imaged dopo il completamento di fabbricazione i passi nella Figura 2 , ma prima del rilascio dal substrato Ni-rivestito. Caselle tratteggiate corrispondono da sinistra a destra per le sezioni della regione periferica ultraversatile, staminali e della regione di I/O ingrandita in C, D ed E, rispettivamente. Barra della scala = 1 mm (B) fotografia di un wafer di 3 pollici Si contenenti 20 completato maglia elettronica sonde. Barra della scala = 20 mm. (C) immagine al microscopio ottico di 20 µm elettrodi di registrazione Pt diametro della regione ultraversatile dispositivo. Barra della scala = 100 µm. (D) immagine al microscopio ottico ad alta densità au interconnessioni nella regione staminali. Ogni interconnessione Au è elettricamente isolato e collega un singolo elettrodo di Pt per un singolo pad di I/O. Barra della scala = 100 µm. (E) ottico microscopio immagine delle pastiglie di I/O. Ogni pad è composto da un'area comprimibile maglia e un'area continua di film sottile situato sullo stelo. Non-conduttivo SU-8 nastri collegare le parti della maglia delle pastiglie insieme per aiutare a mantenere l'allineamento. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: montaggio dell'apparecchio per portaaghi capillare durante l'iniezione. Fotografia (A) dei componenti dell'apparato. I componenti includono (1) un ago capillare di vetro, (2) un supporto per pipette, (3) una circolare vite di fermo per il possessore della pipetta e (4) una cono rondella per il titolare della pipetta. Articoli (2) a (4) sono inclusi con l'acquisto di un titolare di pipetta. La freccia indica l'uscita di Dispensare titolare che deve essere incollato chiuso con resina epossidica. (B) fotografia del titolare pipetta dopo il montaggio e l'inserzione di un ago capillare di vetro. La resina epossidica aggiunta è visibile presso l'uscita superiore del supporto pipetta (contrassegnata dalla freccia) e tubazione capillare collega il pipetta titolare ad una siringa (non mostrata). (C) fotografia del titolare della pipetta e l'ago capillare dopo l'attacco al telaio stereotassica con un morsetto ad angolo retto terminale. Barre della scala sono 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: caricamento di mesh elettronica in vetro aghi. (A) illustrazione schematica della procedura di caricamento per l'elettronica di rete plug-and-play. Un ago di vetro è posizionato verso la fine di I/O di una sonda elettronica di rete mentre è sospeso in soluzione. Lo stantuffo della siringa è poi ritirato manualmente per disegnare con la sonda elettronica di maglia. Posizionamento ideale è con la regione di dispositivo ultraversatile solo all'interno dell'estremità dell'ago. (B) fotografie corrispondente (A) di una sonda elettronica di rete viene caricata in un ago di vetro. Scala bar = 2 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: schematico della stazione chirurgia stereotassica. Una cornice stereotassica motorizzata (A) con annesso Dispensare titolare viene utilizzata per posizionare l'ago nella regione del cervello desiderata. La posizione dell'ago e caricato maglia elettronica sono monitorati con una lente obiettiva e collegato la fotocamera (B) e visualizzati su un computer (C). Una pompa a siringa (D) scorre precisi volumi di soluzione fisiologica attraverso l'ago, permettendo per iniezione accurata, controllata di maglia elettronica nella regione cerebrale desiderata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Plug-and-play I/O procedura di interfacciamento. (A) An FFC substrato di bloccaggio è fissato con cemento dentale adiacente il craniotomy. (B) elettronica di rete Plug-and-play stereotassicamente vengono iniettate nella regione del cervello desiderato utilizzando il metodo di FoV. (C), l'ago, con le pastiglie di I/O della maglia elettronica sonda ancora all'interno, viene riposizionato sopra la FFC substrato di bloccaggio. (D) flusso viene ripreso attraverso l'ago per espellere le pastiglie di I/O sulla FFC substrato di bloccaggio. (E) le pastiglie di I/O sono piegati a 90 ° rispetto al gambo, si svolse con il conduttore lato rivolto verso l'alto e asciugato in luogo. (F) la FFC substrato è tagliata con le forbici a una linea retta ca. 0,5 mm dal bordo delle pastiglie I/O. Substrato in eccesso viene tagliato via per consentire l'inserimento in un connettore ZIF a 32 canali. (G), il / o pastiglie sono inserite in un connettore ZIF 32 canali montato su un PCB personalizzato. Il connettore ZIF è agganciato chiuso per fare contatto con le pastiglie di I/O. (H), il fermo è cementato chiuso, il PCB è capovolto sul cranio, e il PCB è fissato con cemento dentale. (io) il PWB forma un headstage compatto con un connettore standard amplificatore per facile interfacciamento durante le sessioni di registrazione. Scala bar = 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: registrazioni sobrie e liberamente commovente. (A) fotografia di un topo C57BL/6J maschio in un dispositivo di ritenuta durante una sessione di registrazione. Un PCB di 32 canali preamplificatore è stato inserito nel connettore standard amplificatore. (B) fotografia dello stesso mouse con 32 canali preamplificatore PCB durante un esperimento di registrazione liberamente commovente. Scala bar = 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: risultati rappresentativi registrazione neurali. (A) rappresentante LFP mappe di calore da 32 canali maglia sonde elettronica iniettati nel mouse ippocampo e la corteccia somatosensoriale. I dati sono stati registrati mentre il mouse liberamente esplorato la sua gabbia a 2 mesi (in alto) e 4 mesi (in basso) post-iniezione. LFP ampiezza è color-coded secondo la barra dei colori a destra. Le tracce filtrate passa-alto (nero) che mostrano l'attività chiodando sono overlaid su spettrogramma per ciascuno dei 32 canali. (B) punte isolati dopo l'ordinamento dei dati tracciati in (A). Attività chiodando unitario è stata rilevata su 26 dei 32 canali entrambi 2 mesi dopo l'iniezione (in alto) e dopo l'iniezione 4 mesi (in basso). I numeri sopra ogni cluster di picchi corrispondono ai numeri di canale a (A). Questa figura è stata modificata da Fu, et al. ²⁸. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: risultati istologici rappresentativi. Schema (A) che illustrano l'orientamento della rete elettronica all'interno orizzontale (pannello centrale) e sagittale fette del cervello (pannello inferiore). (B) immagine al microscopio di fluorescenza di una fetta di spessore corticale cerebrale un anno dopo l'iniezione di una sonda elettronica di 16 canali maglia di 10 µm. La fetta è stato immunostained per NeuN (verde). (C) la stessa fetta di cervello immunostained per neurofilament (rosso). (D) la stessa cervello fetta immunostained per GFAP (ciano). (E), A immagine composita di (B) a (D) mostrando il maglia elettronica/tessuto interfaccia con etichetta NeuN (verde), neurofilamenti (rosso), GFAP (ciano) e mesh elettronica (blu). Scala bar = 100 µm. Questa figura è stata modificata da Fu et al. ²⁷. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare Video 1: ripetuto caricamento e iniezione di elettronica di maglia in soluzione. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Tutte le fasi di fabbricazione e l'utilizzo dell'elettronica della maglia sono importanti, ma alcuni sono particolarmente critiche. Prima di rilasciare l'elettronica di maglia da loro wafer, è essenziale per ossidare la superficie per rendere le maglie prontamente sospese in soluzione acquosa (punto 1.6.1). Se viene saltato questo passaggio, le maglie solitamente galleggiano sulla superficie dell'acqua, che li rende difficili da caricare negli aghi, e se possono essere caricati, spesso si attaccano ai lati degli aghi di vetro, che richiedono grandi volumi (> 100 µ l) per l'iniezione. Fallimento di ossidare la superficie prima di rilascio, pertanto, in genere significa che le maglie non possono essere utilizzate e la realizzazione deve essere nuovamente eseguite dall'inizio. Un altro passo fondamentale si piega l'elettronica di maglia "gambo" a ~ 90° durante il / o interfacciamento (punto 4.3). Se l'angolo è minore di 90°, quindi tutti i 32 pastiglie di I/O non si inseriranno nel connettore ZIF; alcuni dovranno essere tagliare l'estremità per consentire l'inserimento, riducendo il numero di elettrodi collegati. Il processo deve essere fatto anche delicatamente per evitare che lo stelo si rompa.

Il design della maglia elettronica può essere personalizzato per varie applicazioni modificando le fotomaschere e utilizzando la stessa procedura di fabbricazione indicata nella Figura 2. Ad esempio, mentre le sonde di elettronica di rete utilizzate per registrare i dati nella Figura 9 sono state progettate per avere 32 elettrodi di registrazione span del mouse ippocampo e la corteccia somatosensoriale primaria, il posizionamento degli elettrodi all'interno della mesh ultraversatile può essere selezionato per indirizzare qualsiasi regione del cervello, o più grandi elettrodi per la stimolazione possono essere incorporato²⁷. La stessa procedura di struttura e fabbricazione di mesh di base vengono mantenute, ma il posizionamento degli elettrodi e il design sono regolati per soddisfare le esigenze dello studio. Gli investigatori dovrebbero usare cautela, tuttavia e sempre test che disegni modificati possono essere iniettati facilmente attraverso gli aghi previsti. Piccole modifiche alla meccanica di piegatura della rete elettronica può avere effetti sostanziali sulla iniettabilità. Un esempio è che un angolo di 45° tra trasversali e longitudinali SU-8 nastri produce una sonda elettronica di rete che può essere iniettata facilely ma un angolo di 90° si traduce in uno che stropiccia e zoccoli aghi²¹.

Misurare l'impedenza degli elettrodi di registrazione è utile per la risoluzione dei problemi. Un elettrodo di Pt 20-µm diametro circolare dovrebbe avere una magnitudine di impedenza vicino 1 MΩ quando misurato ad una frequenza di 1 kHz in vivo o in 1X PBS²⁹. Un'impedenza significativamente più grande di questo implica che l'elettrodo non è esposti, come può accadere se è contaminato con photoresist residuo, o non elettricamente collegato. Quest'ultimo può verificarsi se, ad esempio, c'è polvere sulla maschera foto durante PL che risultati in una disconnessione nel Au interconnessioni, o se uno dei dischetti di I/O di maglia non viene contattato dai pin del connettore ZIF durante interfaccia i/o. Un grandezza di impedenza circa la metà del valore previsto suggerisce che il canale può essere cortocircuitato a quello adiacente, creando un circuito di due impedenze elettrodo in parallelo a vicenda. I valori di impedenza misurata fungono da guida durante la risoluzione dei problemi; combinato con la microscopia ottica delle sonde elettronica della maglia, l'origine del problema può solitamente essere identificato e corretti di conseguenza nella fabbricazione successiva eseguire o tentativo di interfacciamento di I/O.

L'uso della siringa-iniettabili maglia elettronica per studi acuti è limitato in quanto attività chiodando unitario non viene generalmente osservata fino a 1 settimana post iniezione²⁷, anche se recenti lavori (non pubblicato) mostrano che questo problema è facilmente superare. Determinanti del tempo necessario per vedere chiodare l'attività sono la maglia di design, il volume del fluido iniettato nel cervello insieme a rete elettronica e il diametro dell'ago per iniezione, come queste influenzano il grado di danno di tessuto durante la iniezione e il tasso di guarigione. Volumi di iniezione grande possono essere richiesti se l'elettronica di maglia non è trattato con il plasma ad ossigeno prima del rilascio in Ni mordenzante; cioè, se la rete non è idrofila, esso possa aderire l'ago di vetro. Occasionalmente, le maglie hanno difetti che portano alla flessione meccanica che li rende difficili da iniettare. Durante il caricamento dell'elettronica della maglia, è importante controllare che maglie si muovano facilmente e senza intoppi all'interno dell'ago (come illustrato in supplementare Video 1). In caso contrario, deve essere utilizzata una sonda elettronica di maglie diverse. Si otterranno risultati migliori per l'interfacciamento neurale senza giunte con i volumi di iniezione ideale di 10 – 50 µ l per 4 mm di lunghezza di maglia iniettato. I risultati più recenti con sonde di elettronica più fine della maglia iniettato e/o diametro capillare i ferri più piccoli (più piccoli diametro interno di 150 µm, 250 µm di diametro esterno) mostrano quella singola unità chiodare può essere osservato da poco dopo l'iniezione (misure acute) attraverso tempi più lunghi. I file di progettazione maschera per queste strutture più fini di maglia sono disponibili su richiesta o dal sito Web di risorse, meshelectronics.org. Stimiamo la resa delle nostre in vivo della maglia iniezione procedure utilizzando 400 µm diametro interno (650 µm di diametro esterno) aghi di circa il 70%, anche se il rendimento è più vicino a 80 – 90% per il nostro lavoro più recente con 150 µm di diametro interno (250 µm diametro esterno ) gli aghi. I motivi più comuni per guasto sono (1) che la mesh non iniettare senza intoppi, con conseguente edema cerebrale da volumi inaspettatamente grande iniezione nel cervello, (2) maglia rottura durante la manipolazione manuale necessaria nei / o l'interfaccia di procedura e (3) sanguinamento da danneggiare un vaso sanguigno durante l'iniezione. Danneggiare un vaso sanguigno durante l'iniezione è rara (la causa di meno di 10% di guasti) e potrebbe essere ridotto ulteriormente utilizzando chirurgia guidata da immagini. Notiamo anche che danno dei vasi sanguigni è un limite comune di tutte le procedure che coinvolgono la penetrazione del tessuto cerebrale, tra cui l'iniezione di particelle virali per la transfezione, l'impianto delle sonde rigide del cervello e l'iniezione dell'elettronica della maglia.

Rete elettronica sonde sono in grado di registrare da stabile e monitorare gli stessi neuroni individuali su almeno mesi per anno scale cronologiche ed non evocano quasi nessuna risposta immunitaria cronica, come dimostrato in Figura 9 e Figura 10, rispettivamente. Questo rappresenta un vantaggio significativo rispetto agli elettrodi di profondità di convenzione, che soffrono comunemente da diminuire le ampiezze di spike, segnali instabili e l'infiammazione cronica nel corso del lungo termine registrazione esperimenti^{14, 15}. Inoltre, l'elettronica di rete hanno il vantaggio che possono essere lasciati nel tessuto durante il sezionamento istologico, colorazione, e di imaging, in contrasto con le sonde tradizionali, che sono troppo rigidi e pertanto deve essere rimossa prima di istologia analisi. Pertanto, consentono la rete elettronica per la capacità unica di utilizzare l'analisi di immunohistochemical di studiare con precisione l'ambiente cellulare che circonda ogni sito di registrazione.

Il protocollo presentato qui si apre-up emozionanti nuove opportunità nell'ambito delle neuroscienze. Il metodo di consegna come minimo dilagante e una perfetta integrazione dell'elettronica di maglia con tessuto cerebrale riduce al minimo i disagi per i circuiti neurali ed evita la risposta immunitaria cronica, che potrebbero trarre vantaggio la maggior parte dei tipi di esperimenti di registrazione neurali cronica. La capacità di rete elettronica per registrare e monitorare i singoli neuroni stessi per lunghi periodi di tempo sarà soprattutto di interesse agli investigatori che cercano di correlare attività chiodando millisecondo-scala con mese-anno-lungo processi quali invecchiamento, la patogenesi della malattia di cervello o cervello sviluppo^16,18. Inoltre, esistono notevoli opportunità di estendere e personalizzare questo protocollo, ad esempio aggiungendo elettronica attiva alla PCB testa-fase per implementare funzionalità come digital multiplexing^8,35, wireless comunicazione^35,36,37e³⁵, co-iniezione di cellule staminali o polimeri con l'elettronica di maglia ad aiuto nel tessuto rigenerazione^{18,38, l'elaborazione del segnale 39}e incorporando nanowire transistori field - effect (NW-FET) in rete elettronica per altamente localizzate e multifunzionale cervello sonde^{24,29,40,41 ,42}.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motorized stereotaxic frame	World Precision Instruments	MTM-3	For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller	Intan Technologies	C3004	A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board	Intan Technologies	C3314	A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable	Intan Technologies	C3213	A component of the neural recording system
Mouse restrainer	Braintree Scientific	TV-150 STD	Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers	Nova Electronic Materials		3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats & 6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass)	Advance Reproductions		Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator	Sharon Vacuum		Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist	MicroChem Corp.		Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner	Karl Suss Microtec AG		Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer	MicroChem Corp.		Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist	MicroChem Corp.		Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist	Microposit, The Dow Chemical Company		Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer	Microposit, The Dow Chemical Company		To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater	Reynolds Tech		For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system	AST Products, Inc.		Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator	Denton Vacuum		For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG	MicroChem Corp.		Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution	MG Chemicals	415-1L	A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution	Kanto Corp.		A component of Ni etching solution
Glass capillary needles	Drummond Scientific Co.		Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type	Molecular Devices, LLC	1-HL-U	Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe	NORM-JECT®, Henke Sass Wolf		Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing	Becton Dickinson and Company		Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe	Becton Dickinson and Company		Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera	Thorlabs Inc.	DCC1240C	Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras	Thorlabs Inc.		Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill	Osada	3144-830	For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr	Fine Science Tools	19007-09	For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm	Fine Science Tools	18000-50	Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument	Leica Microsystems		Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100	Life Technologies		Used for histology
5% goat serum	Life Technologies		Used for histology
3% goat serum	Life Technologies		Used for histology
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab177487	Used for histology
Mouse anti-Neurofilament	Abcam	ab8135	Used for histology
Rat anti-GFAP	Thermo Fisher Scientific Inc.	PA516291	Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific Inc.	P36930	Used for histology
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich Corp.	P6407-5MG	Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp	Thorlabs Inc.	RA180/M	Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB)	Advanced Circuits		Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector	Omnetics Connector Corp.	A79024-001	Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC)	Molex, LLC	152660339	Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector	Hirose Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	Component assembled onto the PCB