JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

النمو الضفادع الصغيرة توفر منبرا فريداً للتحقيق في وظيفة المجراة في الجهاز العصبي. يمكننا وصف منهجيات لتقييم معالجة المعلومات حاسة الشم في معيشة يرقات النمو في ظروف تربية عادية أو بعد الإصابة.

Abstract

النمو الضفادع الصغيرة توفر محفلاً فريداً للتحقيق في وظيفة النظام العصبي. أنها توفر مزايا تجريبية متعددة، مثل إمكانية الوصول إلى العديد من النهج التصوير والتقنيات الكهربية وفحوصات السلوكية. يعتبر نظام حاسة الشم شرغوف النمو وبشكل خاص يناسب للتحقيق في وظيفة نهايات المنشأة خلال التطور الطبيعي أو إصلاحه بعد الإصابة. هنا، يمكننا وصف منهجيات لتقييم معالجة المعلومات حاسة الشم في معيشة يرقات النمو . أننا مخطط مجموعة من القياسات المجراة في الاستجابات بريسينابتيك الكالسيوم في جلوميرولي لمبة شمي مع فحوصات السلوك الموجهة بحاسة الشم. يمكن الجمع بين الأساليب مع ترانسيكشن للأعصاب شمي لدراسة تجديد أسلاك التوصيل متشابك. وتعرض تجارب استخدام الحيوانات المحورة وراثيا والبرية من نوع التعبير عن الصحفيين بروتينات فلورية خضراء في خلايا الجهاز العصبي المركزي. تطبيق النهج المبين للضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا يمكن أن تكون مفيدة لكشف الأسس الجزيئية التي تحدد سلوك الفقاريات.

Introduction

النمو الضفادع الصغيرة تشكل نموذجا حيوانية ممتازة لدراسة وظيفة طبيعية للجهاز العصبي. الشفافية والجينوم الكامل التسلسل1،2، وإمكانية الوصول إلى التقنيات الجراحية والكهربية والتصوير من خصائص فريدة اليرقات النمو التي تسمح للتحقيق في وظائف الخلايا العصبية المجراة في3 . بعض الاحتمالات التجريبية متعددة من هذا الطراز الحيوانية موضحة بدراسات دقيقة أجريت على شرغوف النظم الحسية والحركية4،،من56. دارة العصبية خاصة مناسبة تماما لدراسة جوانب كثيرة لتجهيز على مستوى نهايات المعلومات هو نظام حاسة الشم شرغوف النمو 7. أولاً، الاتصال به متشابك يعرف جيدا: مستقبلات الشم الخلايا العصبية (أورنس) مشروع للمبة شمي وإقامة اتصالات متشابك مع dendrites التاجي/معنقدة الخلايا داخل glomeruli لتوليد خرائط رائحة. ثانيا، ما أورنس باستمرار تولدها الخلايا طوال الحياة للحفاظ على الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم8. وثالثاً، لأن يظهر نظام حاسة الشم قدرة على التجدد عظيم، النمو الضفادع الصغيرة قادرة تماما إصلاح لمبة شمي بهم بعد التذرية9.

في هذه الورقة، ويصف لنا النهج التي تجمع بين التصوير glomeruli حاسة الشم في معيشة الضفادع الصغيرة مع التجارب السلوكية لدراسة الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم. واستخدمت أساليب مفصلة هنا للدراسة الفنية استعادة الاتصال الكبيبي في لمبة شمي بعد عصب شمي ترانسيكشن10. البيانات التي تم الحصول عليها في النمو الضفادع الصغيرة ممثل الفقاريات نظراً لتجهيز حاسة الشم التطوري المصانة.

تتمثل الأساليب الموصوفة باستخدام X. tropicalis ولكن يمكن تنفيذها بسهولة في العاشر. ليفيس. وعلى الرغم من حجم أكبر من الكبار X. laevis، كلا من الأنواع تتشابه خلال مراحل شرغوف. تكمن الاختلافات الرئيسية الموجودة على مستوى الجينوم. يعرض X. laevis الفقيرة الصوبة الوراثية، تحدد معظمها بالجينوم اللوتيترابلويد وجيل طويل الوقت (حوالي 1 سنة). وفي المقابل، عاشرا- تروبيكاليس أكثر قابلية للتعديلات الوراثية نظراً للوقت جيل أقصر (5-8 أشهر) والجينوم مثنوية. يتم توضيح التجارب التمثيلية للحيوانات البرية من نوع وثلاثة خطوط مختلفة وراثيا: Hb9:GFP (X. tropicalis)، NBT:GFP (X. tropicalis) و tubb2:GFP (X. laevis).

ينبغي النظر في المنهجيات المبينة في العمل الحالي جنبا إلى جنب مع تقدم الوراثية في مجال النمو . بالبساطة وسهولة تنفيذ التقنيات المعروضة يجعلها مفيدة بشكل خاص لتقييم طفرات سبق شرحه11، فضلا عن خطوط النمو المتولدة عن التكنولوجيا كريسبر-Cas912. كما يصف لنا إجراء العمليات جراحية المستخدمة في قطاع شمي الأعصاب التي يمكن أن تنفذ في أي مختبر وبعد الوصول إلى النمو الضفادع الصغيرة. النهج المستخدمة لتقييم استجابات الكالسيوم presynaptic والسلوك الموجهة بحاسة الشم تتطلب معدات محددة، وأن كانت متوفرة بمعتدلة التكلفة. ترد في نموذج بسيط لتشجيع استخدامها في مجموعات البحث منهجيات ويمكن أن تضع الأسس لفحوصات أكثر تعقيداً بتنفيذ التحسينات أو رابطة للتقنيات الأخرى، أي، نهج نسيجية أو الوراثية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الإجراءات بموافقة لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية في جامعة برشلونة.

ملاحظة: وتربى الضفادع الصغيرة X. tropicalis و X. laevis وفقا للطرق القياسية13،14. تعد المياه شرغوف إضافة الأملاح التجارية (انظر الجدول للمواد) للمياه التي تم الحصول عليها عن طريق التناضح العكسي. يتم ضبط الموصلية المايكروثانيه ∼700 و ∼1، المايكروثانيه 400 للضفادع الصغيرة X. tropicalis و X. laevis ، على التوالي. ويمكن الحصول على اليرقات أما عن طريق التزاوج الطبيعي أو الإخصاب في الأنابيب14. يتم ديجيليد الأجنة مع 2% لسيستين أعدت في قارعو الأجراس تعديل (MMR 0.1 x مارك). س 1 يحتوي على معدل وفيات الأمهات (في مم): 100 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، 1 MgSO4، 2 كاكل2، هيبيس 5، 0.1 يدتا، الأس الهيدروجيني 7.8. يتم نقل اليرقات بعد 2-3 أيام (مرحلة 25) إلى خزانات ل 2 مع المياه شرغوف. عندما تصل الضفادع الصغيرة إلى مرحلة 40 من المعايير نيووكوب--فابر (NF)15، أنها وضعت في خزانات ل 5 والإبقاء على كثافة 10 الحيوانات/L. درجة الحرارة تظل ثابتة في 23 – 25 درجة مئوية و 18-20 درجة مئوية ل X. tropicalis و X. laevis الضفادع الصغيرة، على التوالي. وتستخدم الحيوانات وجدت في مراحل 48-52 من معايير NF للتجارب.

1-ترانسيكشن للأعصاب شمي

  1. تعد حلاً أنيسثيتيزينج 0.02 في المائة MS-222 في 50 مل ماء شرغوف في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد خزان صغير (1-2 لتر) مع شرغوف المياه للسماح الاسترداد للحيوانات بعد الجراحة.
  3. قص قطعة مستطيلة من السليولوز ورق الترشيح النوعي (4 سم × 3 سم، انظر الجدول للمواد).
  4. ويت 2 قطعة من ورق الترشيح النوعي السليلوز في حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.02 في المائة، ووضعها تحت نطاق تشريح.
  5. اختيار شرغوف من الدبابة وتزج أنه في حل أنيسثيتيزينج. الحيوان توقف عن السباحة داخل دقيقة 2-4 ولا تستجيب للمنبهات الميكانيكية المطبقة على مستوى ذيل باستخدام الملقط.
  6. ضع شرغوف أنيسثيتيزيد على قطعة مستطيلة من ورق الترشيح. ضع الحيوان بجانبها الظهرية التي تواجه التصاعدي، حيث يمكن تصور هياكل الدماغ.
    1. باستخدام مقص فانس (انظر الجدول للمواد) قطع الأعصاب شمي أحدهما أو كليهما (اعتماداً على نوع الفحص القيام). قطاع عصب واحد للتجارب التي تتطلب رقابة داخلية لإصابة العصب.
    2. للتجارب السلوكية، قطاع الأعصاب على حد سواء من أجل قمع جميع المعلومات الرائحة قادمة إلى لمبة شمي. يمكن بسهولة ملاحظة كفاءة تقطيع الأعصاب شمي تحت نطاق تشريح؛ ومع ذلك، يمكن الحد موقف تصبغ أو الحيوان عوامل.
      ملاحظة: (اختياري) أن أفضل طريقة للتحقق من صحة الإجراء هو استخدام الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا التي تعبر عن الصحفيين الفلورسنت على الجهاز العصبي (انظر نتائج تمثيلية). لتحقيق هذا الهدف، من الضروري استخدام نطاق تشريح مجهزة بالأسفار (الشكل 1). إلا إذا كان الحيوانات البرية من نوع متوفرة، يمكن استخدام التتبع مع دي سم. اتبع البروتوكول 2 (انظر أدناه) لحقن حلاً 0.5 ملغ/مل من سم-دي أعدت في السكروز 0.3 متر في الكبسولة الآنف. انظر 16 للحصول على تفاصيل حول إعداد وتخزين دي سم. يجب تقليل تسرب صبغة خارج تجويف الرئيسية. لتحقيق هذا الهدف، من الضروري تعديل ضغط الحقن وفتح ميكروبيبيتيس. الأسفار على مستوى الطبقة الكبيبي اللمبة شمي يصبح واضح 24 ساعة بعد تطبيق دي سم. يستخدم هذا العمل وضع العلامات مع دي سم فقط للتصديق على إجراءات ترانسيكشن؛ ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للحصول على معلومات المورفولوجية لحاسة الشم جلوميرولي باستخدام الإجراءات التقليدية النسيجي.
  7. نقل الحيوانات إلى خزان الانتعاش. يجب استعادة الضفادع الصغيرة السباحة العادية داخل ~ 10 دقيقة القيام بتفتيش دقيق للوجود للنزيف، الذي من المتوقع في ~ 1 في المائة حيوانات تخضع لعملية جراحية.
  8. Euthanize الحيوانات المصابين في التوصل إلى حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.2%.

2-وضع العلامات للخلايا العصبية مستقبلات الشم مع مؤشرات الكالسيوم الفلورية

  1. تحضير محلول يحتوي على 12% الكالسيوم الخضراء-1-ديكستران (انظر الجدول للمواد)، 0.1% Triton X-100، و 1 مم كلوريد الصوديوم17. تخزين الحل في-20 درجة مئوية أو في-80 درجة مئوية إذا كان ليس لاستخدامها في غضون شهر.
  2. إعداد الماصات الزجاجية مع تلميح الفتحات ~ 1 – 2 ميكرومتر (قطره مماثلة إلى ميكروليكتروديس التي تستخدم لإجراء التجارب على التصحيح-المشبك) microinjection استخدام ساحبة ميكروبيبيتي (انظر الجدول للمواد).
  3. معايرة حجم ميكروينجيكشنز. استخدام الماء المقطر، ضبط وقت الضغط والحقن من أجل الحصول على حقن كميات من 0.15-0.3 ميليلتر.
    ملاحظة: إجراء بسيط يتمثل في عد عدد النبضات اللازمة لإفراغ ماصة مليئة 1 ميليلتر من الماء. معلمات النموذجية ضغط الوقت حقن هذه المبادرة 30 و 50 مللي ثانية.
  4. مكان ماصة في ميكروينجيكتور وتحميله مع ~ 2 ميليلتر من الكالسيوم ديكستران أخضر-1 الحل.
  5. إعداد شرغوف اتباع الخطوات 1، 1، 1 إلى 6.
  6. نقل تلميح الماصة في تجويف الرئيسية الكبسولة الآنف.
    ملاحظة: انظر الشكل 2أ تصف موقع مسارات حاسة الشم في شرغوف النمو.
  7. باستخدام الإعدادات التي تم الحصول عليها في 2.3، تسليم اثنين من نفث. تقييد الوجود صبغ الكبسولة الآنف.
  8. واسمحوا شرغوف الراحة لدقيقة 2-3 استخدام ماصة باستور، من أجل قطرات حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.02 في المائة على أجزاء أكثر والذيلية للحيوان لتفادي التجفيف.
  9. نقل الحيوانات إلى خزان الانتعاش.
    ملاحظة: ينبغي أن تسترد سباحة عادية داخل ~ 10 دقيقة التلاعب بالحيوانات قد تسبب إصابات.
  10. Euthanize الضفادع الصغيرة التي لا استرداد السلوك الطبيعي السباحة 15 دقيقة بعد الحقن باستخدام حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.2%.
  11. مراقبة الأسفار على مستوى الطبقة الكبيبي اللمبة شمي في اليوم التالي للحقن.

3-إعداد الضفادع الصغيرة لتصوير حية من الردود بريسينابتيك

  1. 24 – 48 ح قبل إجراء التجربة، معطف أطباق بيتري 4 – 6 من 35 مم مع سيليكون الاستومر (مثلاً، سيلجارد). مرة واحدة قد بلمرة الاستومر، اختﻻق بئر مستطيلة لاحتوائه شرغوف.
    ملاحظة: الأبعاد النموذجية للضفادع الصغيرة X. tropicalis التي وجدت في مراحل NF 48 – 52، 10 مم × 4 مم.
  2. تحضير 100 مل من مكم 160 1 مم من الأحماض الأمينية الحل بوصفها حافزا الرائحة للضفادع الصغيرة. الحل يمكن أن تحتوي على خليط أحماض الأمينية عدة: الميثيونين ولوسين والحامض الأميني ارجينين يسين. تخفف من الأحماض الأمينية في حل النمو في المسابقة، ويتألف من (في مم): 100 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، كاكل 12، 2 مجكل2، الجلوكوز 10، 10 حبيس، 240 من موسم للكيلوجرام، الأس الهيدروجيني 7.8. ضمان الحفاظ على هذا الرقم الهيدروجيني في 7.8.
  3. ملء خزان ارتفاع مع 20 مل الحل من الأحماض الأمينية. ربط الخزان بالبولي إيثيلين (انظر الجدول للمواد) وضع الأنابيب إلى أنبوب شعري ز 28 أعلاه الكبسولة الآنف.
    ملاحظة: الأنبوبة الشعرية هي التي شنت ميكرومانيبولاتور (انظر الجدول للمواد). فقاعات الهواء يجب أن تكون غائبة عن نظام التروية.
  4. تحقيق الدقة الزمنية في تطبيق الحل من الأحماض الأمينية باستخدام الترانزستور الترانزستور منطق (TTL) مراقبة الملف اللولبي الصمامات قرصه (انظر الجدول للمواد). مشجعا يستخدم لتوليد نبضات TTL (انظر الجدول للمواد). التحقق من الدقة الزمنية لتقديم حل الرائحة عن طريق تغيير مدة TTL البقول، أي., s 0.1 إلى 1.
  5. ملء خزان مرتفع آخر مع 100 مل من محلول النمو في المسابقة.
  6. تخدير شرغوف ووضعه تحت نطاق تشريح (الخطوات 1، 1، 1 إلى 6).
  7. إعداد شرغوف للتصوير. إذا توفرت ألبينو الضفادع الصغيرة للانتقال إلى الخطوة 3، 9، خلاف ذلك إزالة الجلد أعلاه لمبة شمي لأنه يحتوي على الخلايا الصباغية التي تنال من تصوير (الخطوة 3، 8).
    ملاحظة: هناك طريقتان لإجراء هذه التجربة تبعاً لتصبغ الحيوان. فمن الأفضل استخدام ألبينو الحيوانات. سلالات ألبينو متاحة ل X. laevis وخطوط X. tropicalis ألبينو مؤخرا تم إنشاؤها بواسطة كريسبر-Cas9 12 أو18من تالينس.
  8. باستخدام مقص فانس، جعل شق جانبية على الجلد شرغوف على حافة الجهاز العصبي المركزي. ينبغي جعل الخفض في مستوى لمبة شمي ولا يصل ابدأ إلى موقف تيكتوم، الذي يمكن بسهولة تحديد موقع العصب البصري.
  9. قرصه قطع الجلد باستخدام الملقط وتسحبه على الجهاز العصبي. التحقق من إزالة ناجحة بسبب غياب الخلايا الصباغية أعلاه لمبة شمي. إبقاء الحيوان رطبة بسكب قطرات من حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.02 في المائة استخدام ماصة باستور.
  10. ضع شرغوف في البئر للطبق المغلفة (انظر الجدول للمواد). وضع ساترة زجاجية مغلفة بارتفاع الشحوم فراغ أعلاه الحيوان. ضع ساترة لتغطية الجزء العلوي من تكتم إلى نهاية الذيل.
  11. ضمان أن تظل لمبة شمي وبلاكوديس يتعرض إلى الوسط خارج الخلية. الحفاظ شرغوف غير متحرك أثناء التصوير. ملء طبق بيتري مع سولوتيونكونتاينينج 100 ميكرومتر tubocurarine النمو في المسابقة (انظر الجدول للمواد) لمنع تقلصات العضلات.
    ملاحظة: يتم تخزين توبوكوراريني في مختبرين في-80 درجة مئوية لم يعد من 6 أشهر.
  12. ضع الطبق عقد شرغوف تحت مجهر رأسي. الاتصال في خزان يحتوي على الحل النمو المسابقة مع الطبق استخدام أنابيب البولي إيثيلين (انظر الجدول للمواد) التروية المستمرة للحل النمو في المسابقة لإبقاء الحيوانات على قيد الحياة > ح 1.
    ملاحظة: ميني المشابك المغناطيسية (انظر الجدول للمواد) مفيدة جداً لتوصيل أنابيب ستابلي إلى الطبق. أنابيب نضح والشفط يجب أن يكون موجوداً في زاوية ~ 180°.
  13. بدء تشغيل بيرفوسينج الحل النمو في المسابقة. الحفاظ على مستوى الحل في صحن ثابت طوال التجربة. استمرار تقييم جدوى شرغوف بمراقبة الدورة الدموية عن طريق السفن.

4-يعيش التصوير Presynaptic Ca2 + التغيرات في حاسة الشم جلوميرولي

ملاحظة: ويرد وصف للفحص المجهري واسع المجال الإجراء التصوير لكن يمكن تكييفه بسهولة مجهر [كنفوكل] عن طريق ضبط الإعدادات اقتناء. ينبغي أن يتم التصوير في مجهر تستقيم شنت على طاولة المضادة اهتزاز.

  1. تصور شرغوف ذات هدف تضخم منخفضة، على سبيل المثال 5 س.
  2. نقل المحاور ميكرومانيبولاتور مكان شعري تقديم حل الرائحة على رأس واحد كبسولة الآنف تشكل زاوية 90 درجة مع عصب شمي. وينبغي تجنب تدفق الرائحة الحل أعلاه لمبة شمي نظراً لأنها قد تسبب تثربولنسس التي تشوه التصوير.
  3. بحث لمبة شمي الموقع إيبسيلاتيرالي للكبسولة الآنف (رهنا بتحفيز) تضخم عالية، منذ فترة طويلة من العمل عن بعد، باستخدام الماء الغمر والهدف: 60Xx، 0.9 N.A.
  4. تحقق من انبعاث الأسفار بالعين. يجب أن تكون هياكل الكبيبي واضحة (الشكل 2ب).
  5. أداء اكتساب العيش مع كاميرا مناسبة لتصوير الكالسيوم. تعريف صندوق يحتوي على لمبة شمي كامل، عادة من 256 × 256 أو 512 × 512 بكسل. تعيين معدل الإطار اقتناء حيازة إلى 20-40 هرتز. ضبط الربح، حيث تكون قيم fluorescence القاعدية ~ 20 ٪ تشبع. الحصول على شريط فيديو s 5.
  6. تصور الفيلم. تحقق من الصورة التركيز، وعدم وجود حركة القطع الأثرية والمناطق التي تحتوي على المشبعة بكسل. ينبغي أن تكون قيم fluorescence نموذجية من مناطق الكبيبي a.u. 5,000 – 20,000 إذا باستخدام كاميرا 16-بت. المضي قدما إلى الخطوة التالية إذا كانت ظروف التصوير الأمثل. كرر الخطوة 4، 6 إذا لزم الأمر لتحسين جودة الصورة أو ضبط إعدادات الربح.
  7. بدء عملية شراء الوقت الفاصل لتسجيل الاستجابات التي أثارت من قبل المحفزات حاسة الشم.
    ملاحظة: ويسيطر التطبيق الدقيق للحل الرائحة المحفزات TTL. تجربة نموذجية تحتوي على فترة خط أساس 4 s، تليها تحفيز مرات تتراوح من 0.1 إلى 0.5 s وفترة استرداد من 6 – 10 s.
  8. إجراء التحفيز المتكررة من أودورانتس لفترات زمنية > تعيين الحد الأدنى 2 معدل التدفق إلى 1 – 1.5 mL·min-1. منذ نضح العالمية في خلال جميع التجارب، هي جرفت الأحماض الأمينية المطبقة محلياً.
    ملاحظة: حجم الحل في الطبق ~ 3 مل.
  9. تحليل الصور
    1. الكشف عن الاستجابات
      1. تصدير الأفلام إلى إيماجيج.
        ملاحظة: والهدف هو الكشف عن وجود مناطق الكبيبي الاستجابة للمحفزات.
      2. تحويل الخام تسلسل الصور الفلورية إلى فيلم0 ΔF/F. قياس التغيرات النسبية في الأسفار القاعدية وفقا للعلاقة التالية: (و-F0) &/F0، حيث يشير و0 إلى مستويات خط الأساس للأسفار.
      3. رسم المناطق ذات الاهتمام (ROI) حول المناطق تظهر زيادات fluorescence المفترضة من خلال التحفيز وتسجيل موقفهم في إدارة العائد على الاستثمار (الشكل 2ه). رسم العائد على الاستثمار للكشف عن مستويات fluorescence الخلفية في منطقة تخلو من هياكل الكبيبي.
    2. التقدير الكمي للاستجابات.
      1. ضع رويس محددة في تسلسل الصور الفلورية الخام. الحصول على قيمة الرمادي يعني رويس المحدد لكل إطار. نقل سلسلة القيم التي تم الحصول عليها إلى برنامج تحليل (على سبيل المثال.، برو إيغور).
      2. طرح fluorescence الخلفية، ومن ثم حساب التغييرات0 ΔF/F لكل عائد الاستثمار (الشكل 2 واو). ارسم الزيادات في ΔF/و0 لكل واحد من رويس المحدد. حساب الانحراف المعياري ل القاعدية ΔF/و0 (قبل التحفيز).
        ملاحظة: وتعتبر استجابة إيجابية إذا حصلت زيادات في ΔF/و0 خلال التحفيز أكبر من 2 انحراف معياري للقيم القاعدية.

5-حاسة الشم-انطلاقا من السلوك بالانزيم

ملاحظة: الرسم تخطيطي للإعداد للقيام الفحص يظهر في الشكل 3.

  1. جعل الثقوب الصغيرة لتناسب 1.57 مم x نقلت 1.14 ملم معرف الأنابيب في الجزء العلوي من كل بئر من طبق 6-جيدا. إدراج الأنبوب وختم استخدام لاصق الإيبوكسي (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: طبق المعدل يمكن إعادة استخدام مرات عديدة بعد غسل دقيق مع الماء المقطر.
  2. إعداد 50 مل من محلول الأحماض الأمينية المحتوية على الميثيونين، لوسين، والحامض الأميني، ارجينين ويسين (راجع الخطوة 3، 2 للحصول على التفاصيل). يمكن أن تتراوح التركيزات ميكرومتر 160 1 مم. وضع 20 مل الحل في خزان مرتفعة.
  3. لم آر الضفادع الصغيرة لمالا يقل عن 12 ح قبل المقايسة. تأخذ 6 الضفادع الصغيرة من دبابتهم السكن ووضعها في ل 2 من المياه النظيفة شرغوف للتقليل من التعرض إلى أودورانتس.
  4. ضع الطبق الآبار 6 معدلة على بيضاء LED-ترانسيلوميناتور (الشكل 3).
  5. زوجان مداخل نضح للخزان الذي يحتوي على الأحماض الأمينية الحل باستخدام على (انظر الجدول للمواد). التحقق من نظام التروية والقضاء على فقاعات الهواء. سد الآبار 6 في وقت واحد. ضبط ارتفاع الخزان السماح بتسليم إيه فايف مل من محلول الرائحة داخل ~ 30 ثانية.
    ملاحظة: أغسل جيدا 4 مرات مع الماء المقطر مزدوجة كل بعد التعرض للحل الرائحة.
  6. ملء كل جيدا مع 10 مل مياه شرغوف. 1 مكان شرغوف/حسنا. إجازة للراحة > 3 دقيقة.
  7. إعداد الحصول على الصور. استخدم كاميرا CCD تقليدية التي يمكنك الحصول على الصور في إيه فايف هرتز-توصيل الكاميرا بالكمبيوتر. هنا، استخدم كاميرا زايس MRC5 التي تسيطر عليها البرمجيات زن ولكن يمكن استخدام تكوينات مماثلة أخرى. إذا كان من الضروري زيادة معدل الإطار، تطبيق binning بكسل. وينبغي أن تظهر الصور الطبق كله 6-جيدا.
  8. بدء الحصول على الصور أن تحتوي على أفلام القاعدية (30 ثانية)، التحفيز (25-35 ثانية) وفترات الانتعاش (30-60 ثانية).
  9. عودة الحيوانات من طبق 6 آبار للدبابات بعد التصوير.
  10. تحليل الأفلام في استخدام الإضافات التي توفر معلمات متعددة مرتبطة بحركية مثل ورمترك19،20 إيماجيج.
  11. إعداد الصور للتحليل، حدد أولاً جيدا عن طريق رسم عائد مستطيلة من 35 ملم × 35 ملم (الشكل 4أ). الحصول على صورة خلفية عن طريق حساب الإسقاط الأقصى تسلسل كله. كان يجب عرض صورة للبئر دون شرغوف.
  12. طرح الإسقاط الحد الأقصى من الفيلم الخام. أداء مستوى العتبة على الفيلم 32-بت التي تم إنشاؤها وتطبيق البرنامج المساعد ورمترك. ضبط معلمات ورمترك لتعقب تحركات الحيوانات موثوق بها. نقل الحصول على X, Y تنسق في برنامج تحليل.
  13. س-ص "باستخدام" الإحداثيات، حساب المسافة الإقليدية إلى مصدر الرائحة (مدخل التروية في البئر)، بتطبيق المعادلة التالية:
    figure-protocol-15658
    حيث نظام التشغيل إلى موقف مصدر الرائحة وصبي تشير إلى موقف شرغوف في وقت معين. انظر الشكل 4أ لمزيد من التفاصيل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في هذه الورقة، نقدم الجمع بين نهجين متكاملين لإجراء الدراسة في فيفو من وظائف النظام حاسة الشم شرغوف النمو : أنا) طريقة للتصوير كاليفورنيا presynaptic2 + والتغيرات في glomeruli للمعيشة الضفادع الصغيرة باستخدام مؤشر الكالسيوم الفلورية، وثانيا) رائحة تسترشد المقايسة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وتصف هذه الورقة التقنيات التي مفيدة للتحقيق في الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم في المعيشة النمو الضفادع الصغيرة. البروتوكول الحالي مفيد بشكل خاص لتلك المختبرات التي تعمل، أو الوصول إلى النمو؛ ومع ذلك، كما أنها مثيرة للاهتمام لهؤلاء الباحثين دراسة الأسس الجزيئية والخلوية لإصل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من ذ ش وزارة الاقتصاد دي كومبيتيتيفيداد (مينيكو؛ SAF2015-63568-R) كوفونديد بالاوروبية الإقليمية تطوير الصندوق (سيطلب)، بجوائز البحوث التنافسية من الزمالة التذكارية فورتيس ف. غ. م. وصندوق الزمالة جورج ستيفن كوفلر، لورا وآرثر كولون وهبت الصيف البحث صندوق الزمالة ، الزمالة فيشباخ، وصندوق الجيل العظيم من المختبر البيولوجي البحري والوطني النمو الموارد RRID:SCR_013731 (وودز هول، ماجستير) حيث أجرى جزء من هذا العمل. ونشكر أيضا برنامج سيركا/محافظة كاتالونيا للدعم المؤسسي. أ. ل. وزميل Húnter سيرا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman qualitative filter paperFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, AnionicThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicate capillaries for microinjectionSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroinjectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettesWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Upright microscopeZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD CameraHamamatsuImage EM
Solenoid valvesWarner InstrumentsVC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD CameraZeissMRC-5 CameraControlled by Zen software
camera lensThorlabsMVL8ML3There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resinRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutionsNarishigeMN-153
Mini magnetic clampsWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethylene tubingWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

References

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14(2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

142 presynaptic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved