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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.

Zusammenfassung

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen. Sie bieten mehrere experimentelle Vorteile, wie z. B. Zugriff auf zahlreiche bildgebende Ansätze, elektrophysiologische Techniken und Verhaltens-Assays. Das Xenopus Kaulquappe olfaktorische System eignet sich besonders gut zu untersuchen, die Funktion der Synapsen gegründet während der normalen Entwicklung oder nach einer Verletzung reformiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven. Wir skizzieren eine Kombination aus in-vivo Messungen der präsynaptischen Kalzium Antworten in Glomeruli den Riechkolben mit olfaktorischen geführte Verhalten Assays. Methoden können mit der Durchtrennung der Geruchsnerven, studieren die Neuverkabelung der synaptischen Konnektivität kombiniert werden. Experimente werden vorgestellt mit Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere mit dem Ausdruck GFP-Reporter in den Zellen des zentralen Nervensystems. Anwendung der Ansätze beschrieben, gentechnisch veränderten Kaulquappen ist nützlich für die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen, die vertebrate Verhalten definieren.

Einleitung

Xenopus Kaulquappen bilden ein ausgezeichnetes Tiermodell um die normale Funktion des Nervensystems zu studieren. Transparenz, ein vollständig sequenzierte Genom1,2und Zugänglichkeit zu chirurgischen, elektrophysiologische und bildgebende Techniken sind einzigartige Eigenschaften des Xenopus -Larven, die es ermöglichen, Untersuchung neuronale Funktionen in-vivo3 . Einige der mehrere experimentelle Möglichkeiten dieses Tiermodell werden durch gründliche Studien am Kaulquappe sensorischen und motorischen Systeme4,5,6dargestellt. Eine besonders gut geeignet neuronale Schaltung, viele Aspekte der Informationsverarbeitung auf der Ebene der Synapsen ist Xenopus Kaulquappe olfaktorischen System7. Erstens die synaptische Konnektivität ist klar definiert: olfaktorische Rezeptor Neuronen (ORNs) Projekt auf den Riechkolben und synaptischen Kontakte mit Dendriten Mitral-/getuftet Zellen innerhalb von Glomeruli Geruch Karten zu generieren. Zweitens entstehen seine ORNs kontinuierlich durch Neurogenese während des gesamten Lebens die Funktionalität von olfaktorische Bahnen8zu erhalten. Und drittens, weil des olfaktorischen Systems eine große regenerative Fähigkeit zeigt, Xenopus Kaulquappen können ihre Riechkolben ganz nach Ablation9zu reformieren.

In diesem Artikel beschreiben wir Ansätze, die Darstellung der olfaktorischen Glomeruli in lebenden Kaulquappen mit Verhaltensexperimente, die Funktionalität der olfaktorische Bahnen zu studieren. Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um die funktionelle Wiederherstellung der glomerulären Konnektivität in den Riechkolben nach Riechnerv Durchtrennung10zu studieren. In Xenopus Kaulquappen gewonnenen Daten sind Vertreter der Wirbeltiere, da olfaktorische Verarbeitung evolutionär ist konserviert.

Die beschriebenen Methoden sind beispielhaft dargestellt, mit X. tropicalis , aber sie können leicht in Xumgesetzt werden. Laevis. Trotz der größeren Größe des Erwachsenen laevissind beide Arten in Kaulquappe Phasen bemerkenswert ähnlich. Die Hauptunterschiede liegen auf Genomebene. Laevis zeigt schlechte genetische Lenkbarkeit, vor allem durch seine Allotetraploid Genom und lange Generationszeit (ca. 1 Jahr) bestimmt. X. Tropicalis ist dagegen besser geeignet, um genetische Veränderungen aufgrund der kürzeren Generationszeit (5 – 8 Monate) und diploiden Genom. Die repräsentative Experimente sind für Wildtyp Tiere und drei verschiedenen transgenen Linien dargestellt: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) und Tubb2:GFP (laevis).

Die in die aktuelle Arbeit beschriebenen Methoden sollte neben der genetischen fortschreitet im Feld Xenopus betrachtet werden. Die Einfachheit und die einfache Umsetzung der vorgestellten Techniken macht sie besonders nützlich für die Bewertung der bereits beschriebenen Mutanten11sowie Xenopus Linien von CRISPR-Cas9 Technologie12generiert. Wir beschreiben auch einen chirurgischen Eingriff zur Geruchsnerven Transekt, die in jedem Labor Zugang zu Xenopus Kaulquappen umgesetzt werden können. Die Ansätze für die Bewertung der präsynaptischen Kalzium Antworten verwendet und olfaktorischen geführte Verhalten erfordern spezielle Ausrüstung, wenn auch auf einem moderaten Kosten zur Verfügung. Methoden sind in einer einfachen Form zur Förderung ihrer Verwendung in Forschungsgruppen vorgestellt und konnte die Grundlagen von komplexeren Assays festgelegt, durch die Implementierung von Verbesserungen oder durch den Verein zu anderen Techniken, d.h., histologische oder genetische Ansätze.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Tierforschung an Universität von Barcelona genehmigt.

Hinweis: X. tropicalis und laevis Kaulquappen werden nach Standardmethoden13,14aufgezogen. Kaulquappe Wasser wird vorbereitet, indem man kommerzielle Salze (siehe Tabelle der Materialien) zu Wasser durch Umkehrosmose gewonnen. Leitfähigkeit wird ∼700 µS und ∼1, 400 µS für X. tropicalis und laevis Kaulquappen, bzw. angepasst. Larven können entweder durch natürliche Paarung oder Befruchtung14einzuholen. Embryonen werden mit 2 % dejellied, die L-Cystein in 0,1 X Marc geändert Klingeltöne (MMR) vorbereitet. 1 X MMR enthält (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0,1 EDTA, pH 7,8. Larven sind nach 2 – 3 Tagen (Stufe 25) auf 2 L Tanks mit Kaulquappe Wasser übertragen. Wenn Kaulquappen Stufe 40 von Nieuwkoop-Faber (NF) Kriterien15erreichen, sind sie in 5 L Behälter gelegt und gewartet in einer Dichte von 10 Tiere/L. Temperatur bleibt konstant bei 23-25 ° C und 18 – 20 ° C für X. tropicalis und laevis Kaulquappen, beziehungsweise. Tiere in Phasen 48 – 52 der NF Kriterien gefunden werden für Experimente verwendet.

(1) Durchtrennung der Geruchsnerven

  1. Bereiten Sie eine betäubende Lösung von 0,02 % MS-222 in 50 mL Kaulquappe Wasser bei Raumtemperatur.
  2. Bereiten Sie einen kleinen Tank (1 – 2 L) mit Kaulquappe Wasser Erholung der Tiere nach der Operation zu ermöglichen.
  3. Rechteckige Zuschnitte von Zellulose qualitative Filterpapier (4 cm x 3 cm, siehe Tabelle of Materials).
  4. Wet 2 Stück Zellulose qualitative Filterpapier in 0,02 % MS-222 Lösung und legen Sie sie in den sezierenden Anwendungsbereich.
  5. Wählen Sie eine Kaulquappe aus dem Tank und Tauchen sie in die betäubende Lösung. Das Tier hält Schwimmen innerhalb von 2 – 4 min und reagiert nicht auf mechanische Reize auf die Rute mit einer Pinzette angewendet.
  6. Platzieren Sie den narkotisierten Kaulquappe auf das rechteckige Stück Filterpapier. Positionieren Sie das Tier mit seiner dorsalen Seite nach oben zeigt, so Hirnstrukturen visualisiert werden können.
    1. Mit Vannas Schere (siehe Tabelle der Materialien), Schnitt eine oder beide Geruchsnerven (je nach Test durchgeführt werden). Transekt einen einzelnen Nerv für Experimente, die interne Kontrolle der Nervenverletzung erfordern.
    2. Für Verhaltensexperimente Transekt beide Nerven um alle Duftstoff-Informationen, die Ankunft in den Riechkolben zu unterdrücken. Die Effizienz der Schnitt der Geruchsnerven kann leicht in den sezierenden Anwendungsbereich beobachtet werden; jedoch kann Pigmentierung oder Tier Position Faktoren begrenzt werden.
      Hinweis: (Optional) Der beste Weg, um die Gültigkeit des Verfahrens zertifizieren nutzt transgenen Kaulquappen, die fluoreszierende Reporter auf ihr Nervensystem ausdrücken (siehe repräsentative Ergebnisse). Zu diesem Zweck ist es notwendig, eine Dissektion Rahmen ausgestattet mit Fluoreszenz (Abbildung 1) zu verwenden. Wenn nur Wildtyp Tiere zur Verfügung stehen, kann Ablaufverfolgung mit CM-DiI eingesetzt werden. Folgen Sie Protokoll Nr. 2 (siehe unten), um eine 0,5 mg/mL Lösung von CM-DiI in 0,3 M Saccharose in der nasalen Kapsel vorbereitet zu injizieren. Zubereitung und Lagerung von CM-DiI 16 Einzelheiten entnehmen. Auslaufen der Farbstoff aus den wichtigsten Hohlraum muss zu minimieren. Zu diesem Zweck ist es erforderlich, den Druck der Injektion und der Öffnung der Mikropipetten zu ändern. Fluoreszenz auf der Ebene der glomerulären Schicht an den Riechkolben wird offensichtlich 24 h nach dem Auftragen der CM-DiI. Das vorliegende Werk nutzt Etikettierung mit CM-DiI, nur um die Durchtrennung Verfahren zertifizieren; jedoch kann diese Methode auch, morphologische Informationen der olfaktorischen Glomeruli mit konventionellen histologischen Verfahren verwendet werden.
  7. Übertragen Sie Tiere auf der Schmutzwassertank. Kaulquappen sollte normal schwimmen innerhalb von ~ 10 min. Perform erholen, eine sorgfältige Prüfung auf das Vorhandensein von Blutungen, die in ~ 1 % der Tiere dürften Operation unterzogen.
  8. Verletzte Tiere in einer MS-222-Lösung 0,2 % einschläfern.

2. Kennzeichnung der olfaktorischen Rezeptor Neuronen mit fluoreszierenden Calcium Indikatoren

  1. Bereiten Sie eine Lösung mit 12 % Calcium grün-1-Dextran (siehe Tabelle der Materialien), 0,1 % Triton X-100 und 1 mM NaCl17. Die Lösung bei-20 ° C oder bei-80 ° C zu speichern, wenn es nicht innerhalb eines Monats verwendet werden soll.
  2. Mikroinjektion mit einer Mikropipette Puller Glaspipetten mit Tipp Öffnungen ~ 1 – 2 µm (ähnlich wie Durchmesser, Mikroelektroden zur Patch-Clamp-Experimenten) vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Kalibrieren Sie das Volumen der Mikroinjektionen. Verwendung von destilliertem Wasser anpassen Druck und Einspritzzeitpunkt Erlangung Einspritzmengen von 0,15-0,3 µL.
    Hinweis: Ein einfaches Verfahren besteht darin, das zählen der Impulse erforderlich, um einer Pipette gefüllt mit 1 µL Wasser entleeren. Typische Kennwerte sind ein Druck von 30 Psi und 50 ms Einspritzzeit.
  4. Legen Sie eine Pipette in den Microinjector und laden Sie es mit ~ 2 µL der Kalzium-grün-1 Dextran-Lösung.
  5. Bereiten Sie eine Kaulquappe, die folgenden Schritte 1.1 bis 1.6.
  6. Bewegen Sie die Spitze der Pipette in den wichtigsten Hohlraum der nasalen Kapsel.
    Hinweis: Siehe Abbildung 2A beschreibt die Lage der olfaktorische Bahnen in einer Xenopus Kaulquappe.
  7. Einstellungen in 2.3 erhalten, ein paar Züge zu liefern. Beschränken Sie Farbstoff-Präsenz auf die nasale Kapsel.
  8. Lassen Sie die Kaulquappe für 2 – 3 min. mit einer Pasteurpipette ruhen, Tropfen 0,02 % MS-222-Lösung auf die mehr kaudalen Teile des Tieres zu vermeiden, trocknen.
  9. Übertragen Sie das Tier auf der Schmutzwassertank.
    Hinweis: Es sollte normal schwimmen erholen innerhalb von ~ 10 min. Manipulation von Tieren könnte zu Verletzungen führen.
  10. Einschläfern Sie Kaulquappen, die nicht normal schwimmen Verhalten 15 min nach der Injektion mit einer 0,2 % MS-222-Lösung wieder.
  11. Fluoreszenz auf der Ebene der glomerulären Schicht an den Riechkolben am Tag nach der Injektion zu beobachten.

3. Vorbereitung der Kaulquappen für Live Aufnahmen von präsynaptischen Antworten

  1. 24 – 48 h vor der Durchführung des Experiments Mantel 4 – 6 Petrischalen mit 35 mm Durchmesser mit Silikon-Elastomer (z. B. Sylgard). Sobald das Elastomer polymerisiert hat, fertigen Sie eine rechteckige gut um die Kaulquappe zu passen.
    Hinweis: Typische Abmessungen für X. tropicalis Kaulquappen gefunden auf NF Stufen 48 – 52 sind 10 x 4 mm.
  2. Bereiten Sie 100 mL von 160 µM bis 1 mM Aminosäurelösung als einen Geruchsstoff Anreiz für Kaulquappen vor. Die Lösung kann enthalten eine Mischung aus mehreren Aminosäuren: Histidin, Arginin, Methionin, Leucin und Lysin. Verdünnen Sie Aminosäuren in Xenopus Ringer-Lösung, bestehend aus (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 Glukose, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Sicherzustellen Sie, dass dieser pH-Wert auf 7,8 gehalten wird.
  3. Füllen Sie ein erhöhter Tank mit 20 mL der Aminosäure-Lösung. Schließen Sie den Behälter mit Polyethylen Schläuche zu einem Kapillarrohr 28 G (siehe Tabelle der Materialien) über die nasale Kapsel platziert.
    Hinweis: Das Kapillarrohr ist auf einem Mikromanipulator montiert (siehe Tabelle der Materialien). Luftblasen müssen nicht vorhanden sein von der Perfusion System.
  4. Erzielen Sie zeitliche Präzision bei der Anwendung der Aminosäure-Lösung unter Verwendung der Transistor-Transistor-Logik (TTL) seitens Prise Magnetventile (siehe Tabelle der Materialien). Eine Stimulator wird verwendet, um TTL-Impulse erzeugen (siehe Tabelle der Materialien). Überprüfen Sie die zeitliche Präzision um die Duftstoff-Lösung zu liefern, durch eine Änderung der Dauer der TTL-Impulse, dh., 0,1 bis 1 s.
  5. Füllen Sie ein weiterer erhöhter Tank mit 100 mL Xenopus Ringer-Lösung.
  6. Betäuben Sie eine Kaulquappe zu, und legen Sie sie in den sezierenden Geltungsbereich (Schritte 1.1 bis 1.6).
  7. Bildgebung eine Kaulquappe vorbereiten. Wenn Albino Kaulquappen verfügbar sind fahren Sie mit Schritt 3,9, ansonsten entfernen Sie die Haut über den Riechkolben zu, denn es enthält Melanozyten, die Bildgebung (Schritt 3,8) beeinträchtigen.
    Hinweis: Es gibt zwei Möglichkeiten, um das Experiment abhängig von der Pigmentierung des Tieres durchzuführen. Es empfiehlt sich, Albino Tiere zu nutzen. Albino-Sorten stehen für laevis und Albino X. tropicalis Linien vor kurzem von CRISPR-Cas9 12 oder TALENs18erzeugt wurden.
  8. Mit Vannas Schere, machen Sie einen seitlichen Schnitt auf der Kaulquappe Haut am Rande des zentralen Nervensystems. Machen den Schnitt sollte erfolgen, auf der Ebene der den Riechkolben und nie erreichte die Position des Tectum, die durch die Position des Sehnervs leicht identifiziert werden können.
  9. Drücken Sie die geschnittenen Haut mit einer Pinzette und ziehen Sie ihn über das Nervensystem. Überprüfen Sie die Abwahl durch das Fehlen von Melanozyten über den Riechkolben. Halten Sie das Tier durch strömenden Tropfen 0,02 % MS-222-Lösung mit einer Pasteurpipette feucht.
  10. Legen Sie die Kaulquappen in den Brunnen der beschichteten Schale (siehe Tabelle der Materialien). Setzen Sie ein Glas Deckglas beschichtet mit hohem Vakuum Fett über das Tier. Positionieren Sie das Deckglas um die Tectum bis zum Ende der Rute bedecken.
  11. Sicherstellen Sie, dass die Riechkolben und Plakoden der extrazellulären Medium ausgesetzt bleiben. Halten Sie die Kaulquappe unbeweglich, während der Bildgebung. Füllen Sie die Petrischale mit Xenopus Ringerlösung Solutioncontaining 100 µM Tubocurarin (siehe Tabelle der Materialien), Muskelkontraktionen zu verhindern.
    Hinweis: Tubocurarin wird in Aliquote bei-80 ° C nicht mehr als 6 Monate gespeichert.
  12. Das Gericht hält die Kaulquappe unter einem aufrechten Mikroskop zu platzieren. Schließen Sie den Behälter mit Xenopus Ringer-Lösung mit der Schale mit Polyethylen Schläuche (siehe Tabelle der Materialien) für kontinuierliche Perfusion der Xenopus Ringer-Lösung, um das Tier am Leben zu halten > 1 h.
    Hinweis: Mini magnetischen Klemmen (siehe Tabelle der Materialien) sind sehr nützlich für Schläuche in die Schale stabil zu verbinden. Perfusion und Saug-Rohre müssen in ~ 180 °-Winkel befinden.
  13. Starten Sie die Vorrichtung Xenopus Ringer-Lösung. Das Niveau der Lösung in der Schale konstant während des Experiments zu halten. Kontinuierlich bewerten Sie Kaulquappe Lebensfähigkeit durch die Beobachtung der Durchblutung durch die Gefäße.

4. live Imaging von präsynaptischen Ca2 + Veränderungen im olfaktorischen Glomeruli

Hinweis: Die bildgebende Verfahren wird für die Weitfeld-Mikroskopie beschrieben aber könnte leicht an einem confocal Mikroskop durch Anpassung der Erwerb Einstellungen angepasst werden. Bildgebung werden in einem aufrechten Mikroskop montiert auf einer Anti-Vibrations-Tabelle durchgeführt.

  1. Visualisieren der Kaulquappe mit geringer Vergrößerung Zielsetzung, z. B. 5 X.
  2. Verschieben der Mikromanipulator Achsen, die Kapillare, die Bereitstellung der Duftstoff-Lösung auf der Oberseite eine nasale Kapsel bilden einen 90 ° Winkel mit den Riechnerv zu platzieren. Der Fluss der Geruchsstoff Lösung über den Riechkolben sollte vermieden werden, da es Turbulenzen verursachen könnte, die Bildgebung zu verzerren.
  3. Finden Sie den Riechkolben befindet sich ipsilaterally der nasalen Kapsel (je nach Stimulation) mit einer hohen Vergrößerung, langem Arbeitsabstand, Wasser eintauchen Ziel: 60Xx, 0,9 N.A
  4. Überprüfen Sie die Fluoreszenzemission von Auge. Glomeruläre Strukturen sollte offensichtlich (Abbildung 2B).
  5. Führen Sie live Akquisition mit einer Kamera geeignet für Kalzium Imaging. Definieren Sie ein Feld mit den gesamten Riechkolben, in der Regel von 256 x 256 oder 512 x 512 Pixel. Satz der Erwerb Frame Rate Erwerb um 20 – 40 Hz. die Verstärkung so einstellen, dass die Werte der basalen Fluoreszenz ~ 20 % Sättigung sind. Erwerben Sie ein 5 s-Video.
  6. Visualisieren Sie den Film. Bildschärfe, die Abwesenheit von Bewegungsartefakten und Regionen mit gesättigten Pixel zu überprüfen. Typische Fluoreszenz Werte der glomerulären Regionen sollte von 5.000 – 20.000 a.u sein, wenn eine 16-Bit-Kamera verwenden. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn bildgebende Bedingungen optimal sind. Wiederholen Sie Schritt 4.6, bei Bedarf zur Verbesserung der Bildqualität oder Gain-Einstellungen anpassen.
  7. Starten Sie eine Zeitraffer-Akquisition um Reaktionen hervorgerufen durch olfaktorische Reize aufzunehmen.
    Hinweis: Präzise Anwendung der Geruchsstoff Lösung wird durch TTL Reize gesteuert. Ein typisches Experiment enthält eine Basisperiode von 4 s, gefolgt von Stimulation Zeiten zwischen 0,1 bis 0,5 s und eine Erholungszeit von 6 – 10 s.
  8. Führen Sie sich wiederholende Stimulationen der Geruchsstoffe für Zeitintervalle > 2 min. die Durchflussmenge auf 1 – 1,5 mL·min-1gesetzt. Da die globale Perfusion während alle Experimente aktiviert ist, werden lokal applizierten Aminosäuren ausgewaschen.
    Hinweis: Das Volumen der Lösung in der Schale beträgt ~ 3 mL.
  9. Bildanalyse
    1. Erkennung von Antworten
      1. Exportieren Sie Filme in ImageJ.
        Hinweis: Das Ziel ist die Anwesenheit der glomerulären Regionen reagieren auf Reize erkennen.
      2. Die rohe Bildsequenz Fluoreszenz zu einem ΔF/F0 Film zu verwandeln. Relative Änderung in basalen Fluoreszenz nach der folgenden Beziehung zu messen: (F-F0) / f0, wo F0 Fluoreszenz Ausgangswerte zeigt.
      3. Regionen von Interesse (ROI) um Bereiche mit vermeintlichen Fluoreszenz steigt während der Stimulation zu ziehen und ihre Stellung in der ROI-Manager (Abbildung 2E) aufnehmen. Zeichnen Sie einen ROI um Fluoreszenz Hintergrundwerte in einem Gebiet glomerulären Strukturen zu erkennen.
    2. Quantifizierung der Antworten.
      1. Legen Sie die definierten ROIs in der rohen Reihenfolge der Fluoreszenzbilder. Erhalten Sie den grauen Mittelwert der ausgewählten ROIs für jeden Frame. Die Reihenfolge der Werte, die ein Analyse-Programm zu übertragen (z. B.., Igor Pro).
      2. Subtrahieren Sie Hintergrundfluoreszenz, und berechnen Sie ΔF/F0 Änderungen für jede ROI (Abb. 2F). Plot der Anstieg der ΔF/F0 jeweils die ROIs ausgewählt. Berechnen Sie die Standardabweichung der basalen ΔF/F0 (vor-Stimulation).
        Hinweis: Eine positive Reaktion gilt bei Erhöhungen der ΔF/F0 während der Stimulation sind größer als 2 Standardabweichungen der basalen Werte.

(5) olfaktorische-geführte Verhalten Assay

Hinweis: Eine schematische Darstellung des Setups für die Durchführung des Tests ist in Abbildung 3dargestellt.

  1. Machen Sie kleine Löcher um 1,57 mm Außendurchmesser X 1,14 mm I.D. Schlauch im oberen Teil von jedem Bohrloch der 6-Well Platte passen. Legen Sie den Schlauch und Dichtung mit einem Epoxy-Kleber (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Die modifizierten Schale kann viele Male nach dem gründlichen waschen mit destilliertem Wasser wiederverwendbar.
  2. Bereiten Sie 50 mL einer Aminosäure-Lösung mit Methionin, Leucin, Histidin, Arginin und Lysin (siehe Schritt 3.2 für Details). Die Konzentrationen reichen von 160 µM bis 1 mM. 20 mL der Lösung in einem erhöhten Reservoir zu platzieren.
  3. Füttern Sie Kaulquappen für mindestens 12 Stunden vor dem Test nicht. Nehmen Sie 6 Kaulquappen aus ihrem Gehäuse Tank und legen Sie sie in 2 L Wasser sauber Kaulquappe, die Exposition gegenüber Geruchsstoffen zu minimieren.
  4. Legen Sie die modifizierte 6 Brunnen Schale auf eine weiße LED-Transilluminator (Abbildung 3).
  5. Paar der Perfusion Buchten in den Behälter mit der Aminosäure-Lösung mit einem Verteiler (siehe Tabelle der Materialien). Die Perfusion System überprüfen und Luftblasen zu beseitigen. Füllen Sie die 6 Brunnen gleichzeitig. Passen Sie die Höhe des Behälters ermöglicht die Lieferung von ≥5 mL Geruchsstoff Lösung innerhalb von ~ 30 s.
    Hinweis: Waschen Sie jede gut 4 Mal mit doppelt destilliertem Wasser nach Exposition gegenüber den Duftstoff-Lösung.
  6. Füllen Sie jeweils gut mit 10 mL Wasser Kaulquappe. Platz 1 Kaulquappe/gut. Ruhen lassen > 3 min.
  7. Bildaufnahme eingerichtet. Verwenden einer herkömmlichen CCD-Kamera, die Bilder an ≥5 Hz. Anschließen der Kamera an einen Computer erwerben kann. Hier, eine Zeiss MRC5 Kamera Zen Software gesteuert aber andere gleichwertigen Konfigurationen können verwendet werden. Ist es notwendig, Frame-Rate zu erhöhen, gelten Sie Pixel binning. Bilder sollten die ganze 6-Well Schale zeigen.
  8. Bildaufnahme Filme enthalten basale starten (30 s), Stimulus (25 – 35 s) und Erholungsphasen (30 – 60 s).
  9. Tiere aus der Schale 6 Brunnen Panzer nach Bildgebung zurück.
  10. Analysieren Sie Filme in ImageJ mit Plugins wie WrMTrck19,20 , die mehrere Parameter an Beweglichkeit zu bieten.
  11. Um Bilder für die Analyse vorbereiten, wählen Sie zuerst eine gut durch zeichnen ein rechteckigen ROI von 35 mm x 35 mm (Abb. 4A). Erhalten Sie ein Hintergrundbild durch die Berechnung der maximale Projektion der gesamten Sequenz. Es sollte ein Bild des Brunnens ohne die Kaulquappe anzuzeigen.
  12. Subtrahieren Sie die maximale Projektion aus dem rohen Film. Führen Sie Schnittstellenüberwachung auf dem generierten 32-Bit-Film und wenden Sie das WrMTrck-Plugin. WrMTrck Parameter, um zuverlässig tierische Bewegungen zu verfolgen. Übertragen der erhaltenen X, Y-Koordinaten in ein Analyseprogramm.
  13. Verwendung von X / Y-Koordinaten berechnen der euklidische Abstand zur Geruchsstoff (Perfusion Einlass in den Brunnen), durch die Anwendung der folgenden Gleichung:
    figure-protocol-19704
    wo Os zeigt die Position der Quelle Geruch und Tad gibt der Tadpole-Position zu einem bestimmten Zeitpunkt. Siehe Abbildung 4A für Details.

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Ergebnisse

In diesem Beitrag präsentieren wir eine Kombination aus zwei komplementäre Ansätze in Vivo Studie über die Funktionalität des Xenopus Kaulquappe olfaktorischen Systems ausführen: ich) ein Verfahren zur Bildgebung präsynaptischen Ca2 + ändert in den Glomeruli des Lebens Kaulquappen mit einem fluoreszierenden Kalzium Indikator und Ii) geführte ein Geruch Verhaltens Assay, die verwendet werden, um die Reaktion auf bestimmte wasserbasierte Geruchsstoffe z...

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Diskussion

Dieses Papier beschreibt Techniken, die sinnvoll, die Funktionalität der olfaktorische Wege im Leben zu untersuchen sind Xenopus Kaulquappen. Das aktuelle Protokoll eignet sich besonders für die Laboratorien, die funktionieren, oder haben Zugang zu Xenopus; Allerdings ist es auch interessant für jene Forscher studieren die zellulären und molekularen Grundlagen der neuronale Regeneration und Reparatur. Ergebnisse im Xenopus kombinierbar mit Daten aus anderen vertebrate Modelle, konservierte ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) mitfinanziert von European Regional Development Fonds (EFRE), durch wettbewerbsfähige Forschungspreise aus der M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Stipendium Fonds, Laura und Arthur Colwin ausgestattet Sommer Research Fellowship Fund , das Fischbach Fellowship und der große Generation Fund der Marine Biological Laboratory und der nationalen Xenopus Ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts) wo ein Teil dieser Arbeit wurde durchgeführt. Wir danken auch CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung. A.L. ist Serra Húnter Fellow.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman qualitative filter paperFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, AnionicThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicate capillaries for microinjectionSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroinjectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettesWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Upright microscopeZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD CameraHamamatsuImage EM
Solenoid valvesWarner InstrumentsVC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD CameraZeissMRC-5 CameraControlled by Zen software
camera lensThorlabsMVL8ML3There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resinRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutionsNarishigeMN-153
Mini magnetic clampsWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethylene tubingWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

Referenzen

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