JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف لنا فحص بصري لحويصلة متشابك (SV) إعادة التدوير في استزراع الخلايا العصبية. الجمع بين هذا البروتوكول مع تعداء مزدوجة للتعبير عن علامة presynaptic والبروتين من الفائدة يسمح لنا بتحديد مواقع presynaptic، حويصلة متشابك على إعادة تدوير القدرات، وتحديد دور بروتين الفائدة.

Abstract

في المحطات الطرفية النشطة الأعصاب presynaptic، حويصلات متشابك الخضوع لدورات أكسو-والالتقام. أثناء إعادة التدوير، أصبح عرضه المجالات لومينال SV transmembrane البروتينات على سطح الخلية. واحدة من هذه البروتينات هو سينابتوتاجمين-1 (Syt1). يتم أخذ جسم مضاد ضد المجال لومينال من Syt1، مرة واحدة إضافة إلى متوسط الثقافة، خلال دورة أكسو-اندوسيتوتيك. هذا الإقبال متناسباً مع مقدار SV إعادة التدوير ويمكن قياسها كمياً عن طريق الفلورة. هنا، نجمع امتصاص جسم Syt1 مع مزدوجة تعداء الخلايا العصبية هيبوكامبال المستزرعة. وهذا يسمح لنا أن (1) ترجمة مواقع presynaptic استناداً إلى التعبير عن علامة presynaptic المؤتلف سينابتوفيسين و (2) تحديد الوظائف الخاصة بهم باستخدام الامتصاص Syt1 (3) تميز استهداف وآثار من البروتين ذات الاهتمام، والتجارة والنقل-روجدي.

Introduction

تدرس إعادة التدوير حويصلة متشابك مهم في تحديد كيفية تغيير خصائص presynaptic، أثناء اللدونة متشابك أو استجابة لاضطراب وظيفة متشابك. دراسة سينابتوتاجمين-1 (Syt1) امتصاص جسم يوفر أسلوب واحد لقياس مقدار SV إعادة التدوير. Syt1 هو بروتين SV المرتبطة بمثابة Ca2 + أجهزة استشعار وضروري لإطلاق سراح اكسوسيتوتيك العصبي1،2. بروتين ترانسميمبراني مع مجال هيولى ج-طرفية خارج SV ومجال لومينال الطرفي ن داخل ال SV3. خلال الرقابة، يصبح مكشوف المجال لومينال من Syt1 إلى الوسط الخارجي. علينا أن نضيف إلى هذه الوسيلة الخارجية، الأجسام المضادة الموجهة ضد المجال هيولى، الذي يصبح استيعابه خلال الالتقام. هذه الأجسام المضادة يمكن أن تكون أما قبل مترافق مع فلوروفوريس أو إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة الثانوية4،5،،من67. كثافة الأسفار إيمونوسيجنال الناتج متناسباً مع مقدار التدوير SV. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد SV التأسيسي والناجمة عن ديبولاريزيشن إعادة تدوير6،8.

يمكن إجراء فحوصات امتصاص Syt1 بعد نقل الفيروس بوساطة الجينات إلى الخلايا جميعها تقريبا في الطبق أو بعد تعداء متفرق من عدد صغير من الخلايا. لدينا أسلوب يجمع بين المقايسة تعداء مزدوجة متفرق من الخلايا العصبية هيبوكامبال الأولية باستخدام فوسفات الكالسيوم9. نحن نستخدم علامة المؤتلف بروتين المعروف أن تتراكم في presynapses، سينابتوفيسين فلوريسسينتلي الموسومة، لتحديد مواقع محطات presynaptic وأوفيريكسبريس لدينا بروتين الفائدة، روجدي. وهذا يسمح لنا لاختبار أم لا روجدي الأهداف الوظيفية synapses، ويؤثر SV إعادة التدوير. تم تحديد الجينات ترميز روجدي أصلاً في شاشة لطفرات المورفولوجية التي تتميز بضعف الذاكرة10. في البشر، وتسبب طفرات في الجينات روجدي مرض نادر ومدمر يسمى متلازمة Kohlschütter-Tönz. المرضى الذين يعانون من تشوهات مينا الأسنان والصرع فارماكوريسيستانت والتأخر الحركي؛ ومع ذلك، ظلت التعريب سوبسيلولار المنتج الجيني بعيد المنال11. وهكذا، تقدم مقايسة الامتصاص Syt1 أدلة أساسية لإضفاء الطابع المحلي على روجدي معلم بروتينات فلورية خضراء في نهايات الفنية9.

هذا الأسلوب امتصاص له فوائد عدة. أولاً، إعادة تدوير SV يمكن ملاحظة في الوقت الحقيقي على حد سواء عن طريق إجراء تصوير لايف7،12، وبعد تثبيت6،9 بقياس كثافة fluorescence تسمية الأسفار Syt1. بالإضافة إلى ذلك، وضعت عدة متغيرات جسم Syt1. وهناك متغيرات غير المميزة التي يمكن تسميتها بجسم ثانوية بعد تثبيت بروتوكول قياسي immunostaining، والمتغيرات قبل مترافق مع تسمية الأسفار تعلق بالفعل. وأخيراً، fluorescence المستندة إلى جسم مفيد بسبب مجموعة كبيرة من الأصباغ الثانوية أو مترافق المتاحة تجارياً التي يمكن استخدامها.

عند تحديد وإيمونوستينينج الخلايا العصبية، من الممكن أيضا وصمة عار للبروتينات إضافية وإجراء تحليل كولوكاليزيشن. هذا يمكن أن يساعد في تحديد مكان تواجدهم فيما يتعلق بإعادة تدوير SVs. كثافة تسمية الأسفار هو التدبير المباشر لمقدار SV إعادة التدوير. وباﻹضافة إلى ذلك، تسمية الأجسام المضادة بشكل انتقائي الهياكل التي تحتوي على Syt1، مما أدى إلى خصوصية عالية والقليل من الأسفار الخلفية4. يمكن أيضا استخدام البروتوكولات التحفيز المختلفة، مثل المخازن المؤقتة depolarization أو التحفيز الكهربائي البروتوكولات9،12،،من1314. ومع ذلك، يمكن قياس تدوير SV القاعدية دون تنشيط الثقافات العصبية15.

لدينا أسلوب يتناول تحديداً امتصاص جسم Syt1 في الخلايا العصبية transfected مزدوجة مع الأجسام المضادة الثانوية إيمونولابيلينج بعد التثبيت. ومع ذلك، نشير إلى كافة المتغيرات المستخدمة بصورة روتينية للمقايسة في مناقشتنا لإعطاء المشاهدين فرصة للتكيف مع البروتوكول للاحتياجات المحددة.

Protocol

وأجريت دراسات لا مع الحيوانات الحية. ويبلغ عدد التجارب التي تنطوي على الحيوانات euthanized للحصول على خلية الثقافات أقرتها السلطات المحلية حماية الحيوانات (غوتنغن تيرشوتزكوميشن der Universitätsmedizin) تحت الموافقة T10/30. أجريت التجارب مع البروتوكولات المعتمدة.

1-الابتدائي خلية هيبوكامبال ثقافة

  1. إعداد ثقافة الخلية ينتابها الحصين الفئران في يوم الجنينية 1916،17. لوحة الخلايا على كوفيرسليبس 12 مم مغطاة بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) في الأطباق 24-جيدا في كثافة الخلايا 50,000-60,000/جيدا. فحص كثافة استخدام خلية العد البصريات التباين الدائرة والمرحلة.
  2. ثقافة الخلايا العصبية لمدة 3 أيام (اليوم في المختبر (DIV) 3) في لوحة 24-جيدا في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  3. تقييم كوفيرسليبس لمؤشرات الصحة الخلية باستخدام المجهر الخفيفة المنقولة (مثل مرحلة التباين البصريات في تكبير من 10-20 X). التحقق من المؤشرات التالية للصحة الجيدة: هالة تباين واضح مرحلة، نيوريتيس دون هياكل الخرز، ولا سوما تجميع أو تجميع نورت.

2-تعداء

ملاحظة: يشير البروتوكول التالي إلى مزدوج تعداء لآبار 3. ومع ذلك، يعمل البروتوكول بشكل أفضل عندما يتم إعداد كميات كافية للآبار 4.

  1. إعداد 500 مل من تعداء المخزن المؤقت (274 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم بوكل، 1.4 مم نا2هبو4، 15 ملم الجلوكوز، 42 مم حبيس) في قارورة Erlenmeyer.
    1. حل ز 8.0 من كلوريد الصوديوم و 0.37 ز من بوكل، ز 0.095 غ2هبو4، ز 1.35 الجلوكوز وز 5.0 من هيبيس في 400 مل ماء المقطر في قارورة Erlenmeyer.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.95 مع 1 من هيدروكسيد الصوديوم م باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
    3. ضبط حجم الصوت مع الماء المقطر إلى 500 مل والتحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
    4. جعل مختبرين 20-30 مل من تعداء المخزن المؤقت مع قيم الأس الهيدروجيني التالية 1 بيبيتينج M هيدروكسيد الصوديوم إلى المخزن المؤقت تعداء: 6.96، 6.97، 6.98، 6.99، 7.00، 7.01, 7.02, 7.03، 7.04، 7.05، 7.06، 7، 07، 7.08، 7.09، 7.11.
      ملاحظة: الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت تعداء أمر حاسم لفعالية تعداء.
    5. لاختبار الذي تعداء المخزن المؤقت يؤدي إلى أكبر عدد ممكن من الخلايا ترانسفيكتيد، اختبار كل قيمة pH من 6.96 7.11. استخدم الأسلوب تعداء الموصوفة في 2.2-2.11 وبلازميد المصادق عليه التعبير عن التجارة والنقل. تحديد عدد الخلايا transfected كل ساترة لكل قيمة pH المخزن المؤقت تعداء لتقييم المخزن المؤقت الذي يعمل الأفضل.
    6. الكوة المخزن المؤقت مع كفاءة أعلى في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل تعداء تجميد وتخزين الأنابيب عند-20 درجة مئوية.
  2. قبل الحارة المصل انخفاض المتوسط وخلية الثقافة المتوسطة، والماء المقطر إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء.
  3. إعداد مزيج تعداء في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. تعمل تحت غطاء الاندفاق الصفحي لضمان ظروف عمل عقيم.
    1. ميليلتر 7.5 مزيج من كلوريد الكالسيوم م 2 مع 4 ميكروغرام لكل الحمض النووي خالية من الذيفان (مورانج سينابتوفيسين ومجفب/بروتينات فلورية خضراء-روجدي). إضافة الماء تصل إلى إجمالي حجم 60 مل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    2. إضافة 60 مل من تعداء المخزن المؤقت لهذا المزيج. للحصول على أفضل النتائج، إضافة المخزن المؤقت تعداء dropwise بينما تهز الحمض النووي-المزيج بلطف في الدوامة.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. تجنب تهز الأنبوب الحضانة خلال فترة حضانة المرض عن طريق وضع أنبوب بجوار هود الاندفاق الصفحي.
  4. تحت غطاء السيارة الاندفاق الصفحي، إزالة مستنبت الخلية ("مشروطة" المتوسط) من الآبار باستخدام بيبيت 1000 مل وتخزينها في حاوية منفصلة في الحاضنات.
  5. إضافة 500 مل من المصل انخفاض المتوسط لكل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى تنتهي فترة الحضانة 20 دقيقة (الخطوة 2.3.3).
  6. إضافة 30 مل مزيج تعداء لكل بئر من بيبيتينج عدة قطرات. تجاهل هذه البقايا في الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. بعد أن تم تزويد جميع الآبار بمزيج تعداء، بلطف يهز لوحة 24-جيدا لضمان توزيع مزيج تعداء في الأجل المتوسط.
  8. احتضان الآبار لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  9. إزالة وتجاهل هذا المزيج تعداء وغسله ثلاث مرات مع خلية الثقافة المتوسطة. أضف 1 مل مستنبت الخلية لكل بئر واحتضانها لهم لمدة 30 ثانية في الرايت إزالة 750 مل من المتوسطة وإضافة نفس الكمية من متوسطة جديدة. كرر ذلك ثلاث مرات.
    ملاحظة: أن الخطوة الغسيل الحاسمة. الحفاظ على الوقت يحتوي كل جيدا لا المتوسطة كحد أدنى (أي. وإزالة واستبدال--بئر) وإضافة المتوسطة الغسل بلطف.
  10. إزالة وتجاهل مستنبت الخلية وإضافة 450 مل من مكيفة المتوسطة-البئر.
  11. واسمحوا الخلايا العصبية الناضجة في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 إلى DIV 10.

3. التحفيز وامتصاص Syt1

ملاحظة: يطبق البروتوكول التالي في الإقبال على الآبار 3. ديبولاريزيشن من أي عدد من الآبار، ضبط المبالغ وفقا لذلك.

  1. إعداد 50 مل من 10 x depolarization المخزن المؤقت (مم كلوريد الصوديوم، 700 مم بوكل، 10 مم مجكل2، 20 مم كاكل2، الجلوكوز 300 مم، 200 مم حبيس، درجة الحموضة 7.4 من 640) في قارورة Erlenmeyer.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ المخزن المؤقت Depolarization عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع. إذا كان يستخدم أيضا حلاً غير ديبولاريزينج،، تعد من 10 x Tyrode لحل يتكون من 1290 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم بوكل، مجكل 10 مم2، 20 مم كاكل2، 300 مم الجلوكوز، 200 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4 من أجل مقارنة التحفيز الناجم عن إعادة التدوير بعفوية إعادة التدوير. بعد التخفيف إلى 1 x، أضف 1 ميكرومتر من تيدرودوتاكسين قبل استخدامها لمنع توليد إمكانات العمل.
    1. حل 1.87 غ من كلوريد الصوديوم، غ 2.61 من بوكل، 0.1 غرام من مجكل2-6 ح20، ز 0.15 كاكل2-2 ح2س و 3.0 غ من السكر-1 ح2س وز 2.38 من حبيس في 50 مل ماء المقطر في قارورة Erlenmeyer. قم بضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم والعقيمة تصفية الحل. تمييع في المخزن المؤقت 01:10 في الماء المقطر لتحقيق تركيز 1 x.
  2. إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x (الرقم الهيدروجيني 7.4) للتثبيت بعد التحفيز.
    1. لمل 500 4% حل منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x، ز 20 من بارافورمالدهيد في 450 مل من المقطر H2o.
      ملاحظة: تدفئة الحل يمكن الإسراع بحل، لكن الحرارة لا حل ما يزيد على 70 درجة مئوية، كما قد تتفكك منهاج عمل بيجين.
      تنبيه: منهاج العمل السامة، ويحتمل أن تكون مسرطنة وأحداثه. ارتداء القفازات عند العمل مع منهاج عمل بيجين، والعمل تحت غطاء الدخان، وتجنب الابتلاع.
    2. السماح لتبرد الحل إلى RT وإضافة 50 مل من 10 x برنامج تلفزيوني حل الأسهم. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم/HCl باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
  3. قبل الحارة 600 مل 1 × depolarization المخزن المؤقت و 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء.
  4. أضف 1 مل أضداد المضادة Syt1 الماوس (استنساخ 604.2) إلى 1 x depolarization المخزن المؤقت ودوامه لمدة 10 ثوان.
  5. إزالة وتجاهل مستنبت الخلية من الخلايا. إضافة 200 مل مزيج depolarization الضد لكل خير، واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في الحاضنة.
  6. إزالة وتجاهل هذا المزيج depolarization-جسم وغسله ثلاث مرات مع خلية الثقافة المتوسطة. أضف 1 مل مستنبت الخلية لكل بئر واحتضان لمدة 30 ثانية في الرايت إزالة 750 مل من المتوسطة وإضافة نفس الكمية من متوسطة جديدة. كرر ثلاث مرات.
  7. إزالة وتجاهل مستنبت الخلية وإضافة 300 مل 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. غسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

4-إيمونوسيتوتشيميستري

  1. إعداد 50 مل من المخزن المؤقت لحظر.
    ملاحظة: حجب المخزن المؤقت يمكن الاحتفاظ في-20 درجة مئوية لعدة أشهر.
    1. حل 2.5 g من السكروز وز 1 من ألبومين المصل البقري (BSA) في 5 مل من 10 x برنامج تلفزيوني حل الأسهم. إضافة 1.5 مل من محلول مخزون مسحوق الغسيل 10%. إثارة الحل حتى تظهر كافة المكونات بشكل صحيح وقد حلت وإضافة المقطر ح2س حتى وصلت إلى وحدة تخزين نهائي من 50 مل. قاسمة الحل وتجميد مختبرين للتخزين.
  2. تضعف جسم الثانوية، إلى جانب فلوروفوري (الموجهة ضد الأنواع Syt1-جسم الأولية) في 200 مل من المخزن المؤقت حظر في كل بئر في إضعاف 1: 1000.
  3. إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني 1 x من كل جيد تتضمن ساترة.
  4. إضافة 200 مل من حجب ميكس جسم المخزن المؤقت لكل بئر واحتضان لمدة 60 دقيقة في الرايت
    تنبيه: نظراً لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء، يجب إجراء كافة الخطوات المضي قدما في الظلام.
  5. بعد الحضانة، غسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
  6. تضمين كوفيرسليبس على شرائح المجهر مع المتوسطة التضمين.
    1. إضافة قطره 7 مل من تضمين المتوسطة على شريحة المجهر. إزالة ساترة من لوحة 24-جيدا برفعه مع المحاقن والاستيلاء عليه بالملقط.
      تنبيه: الخلايا على سطح ساترة معطوبة بسهولة، حتى الملقط يجب أن يكون التعامل معها بحذر.
    2. تراجع ساترة في الماء المقطر إزالة برنامج تلفزيوني والجافة بعناية قبل لمس حافة واحدة لانسجة لينة.
    3. الوجه ساترة على تضمين الحبرية المتوسطة، حيث أن السطح تحمل الخلايا يواجه الشريحة المجهر، وبالتالي تضمين الخلايا إلى المتوسطة التضمين.
  7. اترك الشرائح لتجف تحت غطاء محرك السيارة ح 1-2 (غطاء لهم لتجنب التعرض للضوء) وتخزينها في مربع شريحة مجهر عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

5-المجهري التحليل

  1. بعد الجافة كوفيرسليبس، ووضعها تحت المجهر مع الهدف والكاميرا.
  2. ضبط وقت التعرض لكل قناة بحيث يتم تعريض قليلة بكسل لضمان توزيع الحد الأقصى من قيم رمادية.
    ملاحظة: في حين قد تختلف وقت التعرض بين القنوات، ينبغي أن يكون من المستمر لقناة واحدة لضمان إمكانية المقارنة بين كوفيرسليبس.
  3. الحصول على صور متعددة القنوات للمناطق العشر للفائدة (رويس) كل ساترة. تحقق من أن العائد على الاستثمار يحتوي على عمليات محواري من خلية transfected عن طريق فحص بروتينات فلورية خضراء-الأسفار، التي ينبغي أن تكون الشروريه.

6. التحليل الإحصائي

  1. تصدير الصور كملفات.tif. تحميل الصور إلى OpenView18 بواسطة النقر فوق الملف | تحميل ملف الصورة.
  2. اختر صورة مورانج سينابتوفيسين كالقناة 1 والصورة روجدي-التجارة والنقل/مجفب كقناة 2 والصورة الفلورية Alexa647 كالقناة 3.
  3. عتبة رويس.
    1. انقر فوق تحليل | مساحة المكان أكثر بونكتا. اختيار قيم العتبة و كثافة الدلتا حيث عند التفتيش البصري، هو استبعاد الأسفار منتشر، تاركة فقط الشروريه الإشارات في صورة القناة 1 (يمثلون مورانج سينابتوفيسين الأسفار). الاحتفاظ بنفس الحد الأدنى لجميع الصور.
  4. نقل رويس هذه القناة المقابلة 2 (الأسفار بروتينات فلورية خضراء-روجدي/مجفب) و 3 (Syt1-الأسفار) لكل منطقة ساترة بواسطة النقر فوق Execute الآن.
    ملاحظة: رويس ينبغي إلا يعتبر إذا كانت الخلية transfected مزدوجة. في هذا الأسلوب، الأسفار مورانج والتجارة والنقل ينبغي أن تكون واضحة للعيان.
  5. حفظ البيانات في محرر سجل التحليل بواسطة النقر فوق بيانات السجل.
  6. فتح محرر سجل تحليل ضمن علامة التبويب Windows ونسخ القيم لكل قناة. لصق القيم لقنوات منفصلة في جدول بيانات.
  7. تحديد الأسفار متوسط كثافة Syt1-القناة في رويس في كلا الشرطين تعداء (بروتينات فلورية خضراء-روجدي ومجفب).
  8. تطبيق الاختبارات الإحصائية المناسبة مثل الطالب الاختبار t لتحديد الاختلافات الهامة.

النتائج

نتيجة المتوقعة من هذا النهج هو تحديد حوالي 50 مزدوج transfected الخلايا العصبية الواحدة وساترة في كثافة الخلايا العصبية 50,000 كل بئر. إكسون لكل الخلايا العصبية من المتوقع أن تظهر النقاط الساخنة متعددة من تراكم سينابتوفيسين معلم فلوريسسينتلي، مما يشير إلى مجموعات أوفسفس. وفي موا...

Discussion

وهناك ثلاثة فحوصات استخدامها بشكل روتيني لدراسة متشابك حويصلة (SV) إعادة التدوير. الأول والثاني وتشمل الاستخدام) ستيريل الفلورية الأصباغ مثل FM1-43 (والتي تدرج في الأغشية ويتم تناولها في العضيات أثناء الالتقام، وتم إصدارها بعد الرقابة)؛ وب) فلوريسسينتلي معلم المؤتلف البروتينات SV (التي، عند أ?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر ارمغارد فايس لخبراء المساعدة التقنية. وأيد هذا العمل DFG عبر الكتلة التميز للفحص المجهري في نطاق نانومتر والفيزيولوجيا الجزيئية للمخ (كنمبب، B1-7، إلى T.D.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
B27Gibco17504-044
BSASigmaA7030-50g
CaCl2Sigma-AldrichC3306-100g
CoolSNAP HQ2Photometrics
dH2OInvitrogen15230
DABCOMerck8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647Jackson-Immunoresearch715605151antibody
DMEMInvitrogen41966
DPBSGibco14190
Eppendorf tubesEppendorf30120094
multiwell 24 wellFisher Scientific087721H
tube (50 mL)Greiner Bio-One227261
FBS superiorBiochromAGS0615
GlucoseMerck1,083,421,000
HBSSInvitrogen14170
HEPESSigmaH4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)ThermoElectron Corporation
KCLSigma-AldrichP9541-500g
L-GlutaminGibco25030
MgCl2HoneywellM0250-500g
microscope slidesFisher Scientific10144633CF
Microsoft ExcelMicrosoft
Mowiol4-88Calbiochem475904
NaClBioFroxx1394KG001
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NeurobasalInvitrogen21103049
OpenView Experiment Analysis ApplicationFree software, see commentswritten by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x)Roche11666789001
OptimemInvitrogen31985
PenstrepGibco15140-122
PFASigmaP6148-1kg
safety hoodThermoElectronSerial No. 40649111
SucroseneoFroxx1104kg001
Synaptotagmin1Synaptic Systems105311mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100Merck1,086,031,000
Vortex Genius 3 IKA3340001
Water bathGFL1004
Zeiss Observer. Z1 Zeiss

References

  1. Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
  2. Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
  3. Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
  4. Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
  5. Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
  6. Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
  7. Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
  8. Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
  9. Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
  10. Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
  11. Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
  12. Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
  13. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  14. Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
  15. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
  16. Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
  17. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
  18. Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
  19. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
  20. Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
  21. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
  22. Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
  23. Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
  24. Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
  25. Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
  26. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
  27. Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
  28. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
  29. Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
  30. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
  31. Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
  32. Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  33. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
  34. Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
  35. Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
  36. Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
  37. Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved