시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

요약

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

초록

활성 연 접 신경 맨끝에서 시 냅 스 소포 주기를 및 endocytosis를 받 다. 재활용, 하는 동안 SV 막 횡단 단백질의 luminal 도메인 세포 표면에 노출 된다. 이러한 단백질 중 Synaptotagmin-1 (Syt1) 이다. 항 체를 한 번 문화 매체에 추가 하는 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 엑 소 endocytotic 주기 동안 가져온 것입니다. 이 글귀 SV 재활용의 금액에 비례 하 고 면역 형광을 통해 정해질 수 있다. 여기, 우리가 교양된 hippocampal 신경의 이중 transfection Syt1 항 체 통풍 관 결합. (1) 연 접 사이트 재조합 연 접 마커 Synaptophysin의 식에 따라 지역화, (2) 결정 Syt1 통풍 관을 사용 하 여 그들의 기능 및 (3) 특성화 고 대상으로 우리와 관심, GFP Rogdi 단백질의 효과 수 있습니다.

서문

연 접 속성 변경, 시 냅 스가 소성 또는 시 냅 스 기능의 섭 동에 대응에서 하는 방법 시 냅 스 소포 재활용 공부 하는 것은 결정에 중요 하다. Synaptotagmin-1 (Syt1) 공부 항 체 이해는 SV 재활용의 양을 측정 한 방법을 제공 합니다. Syt1 Ca^{2 +} 센서 역할을 신경 전달 물질^1,2의 exocytotic 출시에 필요한 SV 관련 된 단백질 이다. 그것은 SV 외부 단자 세포질 도메인와 SV³내부 N 맨끝 luminal 도메인 막 횡단 단백질. Exocytosis, 동안 Syt1 luminal 도메인 외부 매체에 노출 된다. 이 외부 매체에 우리 endocytosis 동안 내 면 된다 세포질 도메인에 대하여 지시 하는 항 체를 추가 합니다. 이러한 항 체 중 미리 fluorophores 또는 이차 항 체^4,,56,7immunostained와 함께 활용 될 수 있습니다. 결과 immunosignal의 형광 강도 SV 재활용의 양에 비례 합니다. 이 방법은^6,8재활용 제정 및 도발은 유도 SV를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

접시에 거의 모든 세포에 바이러스 중재 하는 유전자 이동 또는 세포의 작은 숫자의 스파스 transfection Syt1 이해 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 우리의 방법은 칼슘 인산 염⁹를 사용 하 여 기본 hippocampal 신경의 스파스 더블 transfection 분석 결과 결합 합니다. 재조합 마커 단백질 presynapses에서 축적 하는 것으로 알려져 붙일 태그 Synaptophysin, 연 접 맨끝을 찾아서 우리의 단백질, Rogdi의 overexpress를 사용 합니다. 수 있습니다 테스트 여부 Rogdi 기능 synapses 대상과 SV 재활용에 영향을 줍니다. Rogdi 인코딩 유전자 초파리 돌연변이 장애인된 메모리¹⁰특징에 대 한 화면에서 원래 확인 되었다. 인간에서는, Rogdi 유전자에 있는 돌연변이 Kohlschütter Tönz 증후군 이라는 희귀 하 고 치명적인 질병을 일으킬. 치과 나 멜 기형, pharmacoresistant 간 질 및 정신 운동 지연;에서 고통 받는 환자 그러나, 유전자 제품의 subcellular 지 방화 하기 어려운¹¹남아 있었다. 따라서, Syt1 이해 분석 결과 제공 기능 시 냅 스⁹에서 GFP 태그 Rogdi의 지역화에 대 한 주요 증거.

이 통풍 관 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, SV 재활용 관찰할 수 있습니다 모두 실시간으로 라이브 이미징^7,12, 수행 하 여 및 고정^6,9 후 Syt1 형광 라벨의 형광 강도 측정 하 여. 또한, 여러 Syt1 항 체 변종 개발 되었습니다. 다음 표준 immunostaining 프로토콜, 고정 후 2 차 항 체로 표시 될 수 있습니다 태그 변종 그리고 이미 연결 된 형광 라벨와 사전 활용된 이체 있다. 마지막으로, 형광 항 체 기반으로 사용할 수 있는 상용 보조 또는 활용 된 염료의 큰 선택 때문에 유리 하다.

때 고정 하 고 immunostaining 신경, 그것은 또한 추가적인 단백질을 위한 얼룩 colocalization 분석을 수행 하. 이 그들이 있는 재활용 SVs에 관하여 결정을 도울 수 있다. 형광 라벨의 강도 SV 재활용의 양 직접 측정. 또한, 항 체는 선택적으로 포함 하는 Syt1 구조, 높은 특이성 및 작은 배경 형광⁴결과로 라벨. 다른 자극 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다, 같은 도발은 버퍼 또는 전기 자극 프로토콜^9,12,,1314. 그러나, 기초 SV 재활용 신경 문화¹⁵자극 없이 측정할 수 있습니다.

우리의 방법은 구체적으로 고정 후 이차 항 체 immunolabeling와 더블 페 뉴런에서 Syt1 항 체 이해를 해결합니다. 그러나, 우리는 시청자에 게 프로토콜 특정 요구에 적응 하는 기회를 우리의 논의에 분석 결과의 모든 일상적으로 사용 된 이체를 참조 하십시오.

프로토콜

아니 살아있는 동물 연구를 실시 했다. 안락사 동물 세포 문화 승인 아래 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다를 포함 하는 실험 번호 T10/30. 실험 승인 프로토콜 실시 했다.

1. 기본 Hippocampal 세포 배양

1. 배아 하루 19^16,17에 쥐 해 마의 천연된 세포 배양을 준비 합니다. 12 m m coverslips polyethyleneimine (페이) 50000-60000 셀/잘의 조밀도에 24-잘 요리 코팅에 셀 접시 챔버 및 단계 대조 광학 계산 셀을 사용 하 여 밀도 확인 합니다.
2. 3 일 동안 (하루 생체 외에서 (DIV) 3) 5% CO₂와 37 ° c 배양 기에서 24-잘 접시에서 뉴런을 문화.
3. 전송 된 가벼운 현미경 검사 법 (예를 들어, 단계 대조 광학 10-20의 확대)를 사용 하 여 셀 건강의 지표에 대 한 coverslips를 평가 합니다. 건강의 다음 지표에 대 한 확인: 명확한 단계 대비 후광, 파란색된 구조 없이 neurites 그리고 소마 클러스터링 또는 neurite 번들.

2입니다. transfection

참고: 다음 프로토콜 3 웰 스에 대 한 이중 transfection를 말합니다. 그러나, 프로토콜 금액 4 우물에 대 한 충분 한 준비가 때 가장 잘 작동 합니다.

1. Transfection 버퍼 (274 m m NaCl, 10mm KCl, 1.4 m m 나₂HPO₄, 15 m m 포도 당, 42 mM HEPES)의 500 mL를 삼각 플라스 크에 준비 합니다.
   1. 8.0 g의 NaCl, KCl의 0.37 g, 나₂HPO₄의 0.095 g, 포도 당의 1.35 g와 400 ml 삼각 플라스 크에 증류수의 HEPES의 5.0 g을 분해.
   2. PH 미터를 사용 하 여 1 M NaOH와 6.95에 pH를 조정 합니다.
   3. 500 ml 증류수와 볼륨을 조정 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 확인 하십시오.
   4. Transfection 버퍼 pH 값의 20-30 mL aliquots pipetting 1 확인 transfection 버퍼에 M NaOH: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      참고: transfection 버퍼의 pH transfection 효능에 대 한 결정적 이다.
   5. 테스트 하려면 transfected 세포의 높은 숫자가 있는 transfection 버퍼 리드, 7.11 6.96에서 각 pH 값을 테스트 합니다. 2.2 2.11 및 검증된 플라스 미드 GFP 표현에 설명 된 transfection 방법을 사용 합니다. 버퍼는 최고의 작품을 평가 하는 모든 transfection 버퍼 pH 값 coverslip 당 transfected 세포의 수를 결정 합니다.
   6. Aliquot 2 mL microcentrifuge 튜브로 높은 transfection 효율 버퍼 동결 및 저장-20 ° c.에 튜브
2. 미리 따뜻한 물 목욕에서 37 ° C에 증류수, 세포 배양 매체, 감소 된 혈 청 매체.
3. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 transfection 믹스를 준비 합니다. 살 균 작업 조건을 보장 하기 위해 층 류 후드 작동 합니다.
   1. 믹스 7.5 µ L 2 M 염화 칼슘의 각 내 무료 DNA (Synaptophysin-mOrange 및 mGFP/GFP-Rogdi)의 4 µ g. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 60 mL의 총 볼륨에 도달 물을 추가 합니다.
   2. 믹스를 transfection 버퍼의 60 mL를 추가 합니다. 최상의 결과 얻으려면 추가 transfection 버퍼 dropwise 소용돌이에 DNA-믹스를 부드럽게 흔들어 동안.
   3. 20 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어. 층 류 두건 옆 튜브를 배치 하 여 보육 시간 동안 부 화 튜브를 떨고 하지 마십시오.
4. 층 류 두건에서 1000 mL를 피펫으로 사용 하 우물에서 세포 배양 매체 (이 하 "조건된 매체")를 제거 하 고 인큐베이터에서 별도 컨테이너에 저장 합니다.
5. 각 우물에 감소 된 혈 청 매체의 500 mL를 추가 합니다. 20 분 잠복기 (2.3.3 단계)가 끝날 때까지 37 ° C, 5% CO₂ 에서 셀을 품 어.
6. 여러 상품 pipetting으로 각 잘 하 transfection 믹스의 30 mL를 추가 합니다. 튜브의 바닥에 찌 꺼 기를 삭제 합니다.
7. 모든 우물이 transfection 믹스와 함께 제공 된, 후 부드럽게 transfection 혼합 매체에서의 배포를 보장 하기 위해 24-잘 접시를 흔들.
8. 37 ° C, 5% CO₂60 분 동안 우물을 품 어.
9. 제거 및 transfection 믹스를 폐기 하 고 세포 배양 매체와 세 번 씻어. 각 우물에 세포 배양 매체의 1 mL를 추가 하 고 매체의 실시간 제거 750 mL에서 30 초 동안 그들을 품 어 신선한 매체의 동일한 금액을 추가. 이 세 번 반복 합니다.
   참고: 세척 단계는 중요 한. 최소한 각 잘 없는 매체는 시간 유지 (즉., 제거 하 고 잘에 의해 잘 대체) 부드럽게 세척 매체를 추가.
10. 제거 하 고 세포 배양 매체를 버리고 바른된 중간 잘-의해-우물의 450 mL를 추가.
11. DIV 10 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에서 성숙한 뉴런을 하자.

3. 자극과 Syt1 통풍 관

참고: 다음 프로토콜 글귀 3 웰 스에 적용 됩니다. 웰 스의 다른 수의 도발은에 대 한 금액을 적절 하 게 조정 합니다.

1. 50 mL 삼각 플라스 크에 10 x 도발은 버퍼 (640 m m NaCl, 700 m m KCl, 10mm MgCl₂, 20 m m CaCl₂, 포도 당 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7.4)을 준비 합니다.
   참고: 도발은 버퍼 수 보관 4 ° C에서 몇 주 동안. Depolarizing 비 솔루션은 또한, 사용 하는 경우, 10 준비 1290 m m로 구성 된 x Tyrode의 솔루션 NaCl, KCl, 10mm MgCl₂, 50mm 20 m m CaCl₂, 300 m m 포도 당, 200 mM HEPES pH 7.4 비교 하기 위해 자극 유발 자발적 재활용 재활용. 1 x 희석, 1 µ M 테트로도톡신의 활동 전위 생성을 차단 하는 사용 하기 전에 추가 합니다.
   1. 1.87 g의 NaCl, KCl, MgCl₂-6 H₂0의 0.1 g, CaCl₂-2 H₂O의 0.15 g과 포도 당-1 H₂O의 3.0 g와 삼각 플라스 크에 증류수 50ml에 HEPES의 2.38 g의 2.61 g을 분해. NaOH와 살 균 필터 솔루션 pH를 조정 합니다. 1 x 농도 달성 하기 위해 증류수에 희석 버퍼 1시 10분.
2. 자극 후 고정을 위한 1 개의 x PBS (pH 7.4)에 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.
   1. 4%의 500 mL에 대 한 1 x PBS에 PFA 분해 450 ml 증류수 H₂o.의 paraformaldehyde의 20 g
      참고: 솔루션을가 열 용 해, 최대 속도 수 있습니다 하지만 PFA 수 분해로 솔루션 70 ° C 이상가 열 하지 마십시오.
      주의: PFA 이며 독성, 잠재적으로 발암 성 않았음. PFA 작업할 경우 장갑을 착용 연기 후드, 작업과 섭취 하지 않도록 합니다.
   2. Rt 솔루션 식 고 10 배 PBS 재고 솔루션 50 mL를 추가 합니다. NaOH/HCl pH 미터를 사용 하 여 함께 pH 7.4에 조정 합니다.
3. 미리 버퍼 도발은 x 1의 600 mL와 10 mL 물 목욕에서 37 ° C에 세포 배양 매체의 따뜻한.
4. 10 초 동안 x 도발은 버퍼 및 회오리 1 마우스 안티 Syt1 항 체 (클론 604.2)의 1 mL를 추가 합니다.
5. 제거 하 고 세포에서 세포 배양 매체를 삭제. 각 잘 하는 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 5 분 동안 품 어 도발은 항 체 혼합의 200 mL를 추가 합니다.
6. 제거 및 삭제 도발은 항 체 혼합 하 고 세포 배양 매체와 세 번 씻어. 각 우물에 세포 배양 매체의 1 mL를 추가 하 고 매체의 실시간 제거 750 mL에서 30 초 동안 품 어 신선한 매체의 동일한 금액을 추가. 세 번 반복 합니다.
7. 제거 및 세포 배양 매체를 삭제 하 고 300 mL 4%의 추가 PFA 1 x PBS에. 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
8. 1 x PBS 각 5 분 동안 세 번 씻는 다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

4입니다. Immunocytochemistry

1. 블로킹 버퍼의 50 mL를 준비 합니다.
   참고: 버퍼를 차단 수 있습니다 보관-20 ° C에서 몇 달 동안.
   1. 10 x PBS 재고 솔루션의 5 mL에 자당의과 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 1 g 2.5 g를 용 해. 10% 세제 재고 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다. 모든 구성 요소는 제대로 녹이 고 증류수 H₂O 50 mL의 최종 볼륨을 도달할 때까지 추가 때까지 솔루션을 저 어. 약 수는 솔루션 및 스토리지에 대 한 aliquots를 동결.
2. 보조, fluorophore 결합 항 체 (기본 Syt1 항 체 종에 대 한 감독)에 1:1000의 희석에 각 잘 차단 버퍼의 200 mL에 희석.
3. 제거 하 고 각 잘을 포함 하는 coverslip에서 1 x PBS를 삭제.
4. 버퍼-항 체 혼합 각 잘 차단의 200 mL를 추가 하 고 실시간에 60 분 동안 품 어
   주의: 2 차 항 체는 빛에 민감한, 때문에 앞으로 이동 하는 모든 단계는 어둠 속에서 수행 합니다.
5. 부 화, 후 셀 1 x PBS의 1 mL와 5 분 동안 세 번 씻어.
6. 포함 매체와 현미경 슬라이드에 coverslips를 포함 합니다.
   1. 현미경 슬라이드에 매체를 포함 한 7 mL 방울을 추가 합니다. 주사기와 그것을 해제 하 고 집게로 잡아 여는 coverslip 24-잘 접시에서 제거 합니다.
      주의:는 coverslip의 표면에 세포는 쉽게 손상, 그래서 집게 관리와 처리 해야 합니다.
   2. 으로 PBS를 제거 하 고 부드러운 조직에 한 가장자리를 만져 그것을 신중 하 게 건조 하는 coverslip 찍어.
   3. 셀을 운반 표면 얼굴 현미경 슬라이드, 그로 인하여 포함 매체 셀에 포함 되도록 포함 중간 물방울에 coverslip 플립.
7. 1-2 h의 후드 아래에서 말리를 슬라이드를 두고 (빛에 노출을 피하기 위해 그들을 커버) 4 ° c.에 현미경 슬라이드 상자에 보관
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

5. 현미경 분석

1. coverslips, 건조 후 목표와 카메라 현미경 그들을 놓습니다.
2. 회색 값의 최대 배포 되도록 몇 픽셀 과도 노출 되도록 모든 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
   참고: 노출 시간 채널 간에 다를 수 있지만, 그것은 해야는 coverslips 사이 comparability을 위해 1 개 채널에 대 한 상수.
3. 관심 (ROIs) coverslip 당 10 영역에 대 한 다중 채널 이미지를 취득 합니다. Punctate 해야하는 GFP 형광을 확인 하 여 투자 수익에 transfected 신경에서 axonal 프로세스 포함 되어 있는지 확인 하십시오.

6. 통계 분석

1. .Tif 파일로 이미지를 내보냅니다. 파일 을 클릭 하 여 오픈 뷰¹⁸ 에 이미지를 로드 | 로드 이미지 파일입니다.
2. 채널 1로 Synaptophysin mOrange 이미지, Rogdi-GFP/mGFP 이미지로 2, 채널 및 채널 3로 Alexa647 형광 이미지를 선택 합니다.
3. ROIs 임계값입니다.
   1. 분석 을 클릭 | Puncta 이상의 장소 지역. 육안 검사에 따라 확산 형광 제외, 채널 1의 이미지에만 punctate 신호 (대표 Synaptophysin mOrange 형광)을 떠나 있도록 임계값 및 델타 강도 값을 선택 합니다. 모든 이미지에 대 한 동일한 임계값을 유지.
4. 지금 실행을 클릭 하 여 해당 채널 2에 이러한 ROIs (GFP-Rogdi/mGFP 형광) 및 3 (Syt1-형광) 각 coverslip 영역을 전송.
   참고: 셀이 더블 페는 ROIs만 고려 한다. 이 방법에서는, mOrange 및 GFP 형광 명확 하 게 표시 되어야 합니다.
5. 로그 데이터를 클릭 하 여 분석 로그 편집기에 데이터를 저장 합니다.
6. 분석 로그 편집기 Windows 탭에서 열고 각 채널에 대 한 값을 복사 합니다. 스프레드시트에 별도 채널에 대 한 값을 붙여 넣습니다.
7. 두 transfection 조건 (GFP-Rogdi 및 mGFP)에서 ROIs에서 Syt1 채널의 평균 형광 강도 결정 합니다.
8. 상당한 차이 확인 하기 위해 학생의 t-검정 등 적절 한 통계적 테스트를 적용 합니다.

결과

이 접근의 예상된 결과 잘 당 50000 뉴런의 밀도에 coverslip 당 약 50 더블 페 뉴런 찾는 것입니다. 각 신경의 축 삭 붙일 태그 Synaptophysin 축적, 나타내는 클러스터 ofSVs의 여러 핫스팟 표시 예정 이다. 기능적 연 접 사이트에서 재조합 Synaptophysin 신호 punctate Syt1 형광으로 colocalizes. 더블 transfection를 사용 하 여, 관심 (그림 1)의 단백질으로 GFP-Rogdi 또는 mGFP 제...

토론

정기적으로 재활용 시 냅 스 소포 (SV)를 공부 하는 데 사용 하는 3 개의 분석을 확인 하 고 있습니다. 처음 두의 사용을 포함 한) 형광 styryl FM1-43 (이 막에 통합 하 고 세포로 endocytosis, 동안 채택 exocytosis 후 해제 됩니다); 같은 염료 그리고 b) 붙일 재조합 SV 단백질 (, overexpression, 따라 배치할 재활용 기계에 통합) 태그. 연결 된 fluorophores 그들의 형광은 pH에 따라 변경는 SV의 산 성 내부와 extracellular 매?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
B27	Gibco	17504-044
BSA	Sigma	A7030-50g
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306-100g
CoolSNAP HQ2	Photometrics
dH2O	Invitrogen	15230
DABCO	Merck	8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647	Jackson-Immunoresearch	715605151	antibody
DMEM	Invitrogen	41966
DPBS	Gibco	14190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120094
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
tube (50 mL)	Greiner Bio-One	227261
FBS superior	BiochromAG	S0615
Glucose	Merck	1,083,421,000
HBSS	Invitrogen	14170
HEPES	Sigma	H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)	ThermoElectron Corporation
KCL	Sigma-Aldrich	P9541-500g
L-Glutamin	Gibco	25030
MgCl2	Honeywell	M0250-500g
microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Microsoft Excel	Microsoft
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
Neurobasal	Invitrogen	21103049
OpenView Experiment Analysis Application	Free software, see comments		written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x)	Roche	11666789001
Optimem	Invitrogen	31985
Penstrep	Gibco	15140-122
PFA	Sigma	P6148-1kg
safety hood	ThermoElectron		Serial No. 40649111
Sucrose	neoFroxx	1104kg001
Synaptotagmin1	Synaptic Systems	105311	mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Water bath	GFL	1004
Zeiss Observer. Z1	Zeiss